過繼細(xì)胞免疫療法治療膽管癌的研究進(jìn)展

潘灝 侯波 彭鵬

膽管癌（cholangiocarcinoma,CCA）惡性程度極高，按照其發(fā)生部位可分為肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）和肝外膽管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma,ECC），其中ECC又可進(jìn)一步分為肝門部CCA和遠(yuǎn)端CCA。CCA患病人群主要集中在60歲以上，東方國家部分地區(qū)CCA發(fā)病率為西方國家的10倍以上[1]。CCA的主要致病因素是肝硬化和病毒性肝炎，以及肝吸蟲、膽結(jié)石、酒精、代謝疾病、吸煙、肥胖等[2]。目前治療CCA的主要方法有手術(shù)、放化療以及內(nèi)鏡治療，但療效均欠佳，晚期CCA患者因腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致生活質(zhì)量極差。近年來免疫療法越來越被人們關(guān)注，主要包括嵌合抗原受體（CAR）T療法、腫瘤疫苗、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤尤其CD19陽性的疾病治療方面效果顯著，這些治療措施有望結(jié)合目前的姑息治療手段，成為未來治療的新思路。本文就國內(nèi)外CCA的過繼細(xì)胞免疫療法研究進(jìn)展作一綜述，以期為今后研究提供參考。

1 CCA的治療現(xiàn)況

CCA首選外科手術(shù)治療，但術(shù)后容易復(fù)發(fā)，并且因很多患者被確診時(shí)已為中、晚期，錯(cuò)過手術(shù)機(jī)會(huì)。研究表明，ICC手術(shù)治療創(chuàng)傷較大，患者多為老年人基礎(chǔ)條件差難以耐受，后期病死率高[3]。且對于治療肝門部CCA而言手術(shù)療效欠佳，其5年的生存率僅為約30%，生存率極低[4]，由此看來手術(shù)治療并不理想。化療對于晚期ICC患者是較為普遍的治療方式，且相對安全可行，研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用吉西他濱和順鉑應(yīng)用于晚期ICC患者有效，可相對提高患者壽命[5-6]。此外一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，配合放療治療ECC可控制腫瘤生長以及緩解患者臨床癥狀[7]。國外一項(xiàng)入組117例惡性膽道狹窄患者的研究結(jié)果顯示，經(jīng)超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮經(jīng)肝膽道引流術(shù)治療后患者的TBil明顯下降[8]。此外，內(nèi)鏡治療可直接針對病灶，內(nèi)鏡下射頻消融能產(chǎn)生高溫，可使腫瘤凝固性壞死，還可延長支架通暢期，延長患者壽命[9]。一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示采用內(nèi)鏡下光動(dòng)力療法治療CCA也有一定效果[10]。以上是當(dāng)前的主要治療手段。

2 過繼細(xì)胞免疫療法

過繼細(xì)胞免疫療法是指通過各種手段利用自體產(chǎn)生的針對腫瘤的免疫細(xì)胞進(jìn)行改造和擴(kuò)增，再重新輸入人體，使其產(chǎn)生特異的抗腫瘤效應(yīng)，依靠自體免疫殺死癌細(xì)胞，包括非特異性及特異性治療。過繼細(xì)胞免疫療法主要利用IFN、TNF等產(chǎn)生的直接殺傷以及細(xì)胞因子激活免疫產(chǎn)生的間接殺傷效應(yīng)起作用。這種方法理論上可以使惡性腫瘤達(dá)到根治，是一種十分有前途且亟待大力發(fā)展的治療方向。

2.1 早期細(xì)胞免疫療法 研究者早期首先通過改造殺傷性細(xì)胞進(jìn)行嘗試治療 CCA，Takashi等[11]建立CCA小鼠模型，通過單克隆抗體西妥昔單抗聯(lián)用被細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞（killer cells activated by cytokines,CAK）增強(qiáng)對CCA細(xì)胞的毒性。Takashi等[12]還發(fā)現(xiàn)在活化的自然殺傷細(xì)胞上出現(xiàn)的細(xì)胞受體NKG2D，在多種癌癥中均有其配體，而采用活化的CD3+/NKG2Dhigh+T細(xì)胞聯(lián)合化療對入組23例已轉(zhuǎn)移的CCA患者治療有效，但療效不佳，也不具有特異性。

因樹突狀細(xì)胞（DC）是一種高效抗原提呈細(xì)胞（APC），同時(shí)還可產(chǎn)生記憶T細(xì)胞。Takehiro等[13]通過載有天冬氨酸-β-羥化酶（ASPH）的DC治療ICC模型大鼠，抑制了腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，并可增加CD3+淋巴細(xì)胞浸潤。

但癌癥微環(huán)境和癌細(xì)胞本身產(chǎn)生的免疫抑制細(xì)胞因子會(huì)抑制免疫功能。Chutamas等[14]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)因CCA細(xì)胞能產(chǎn)生IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β并分泌到腫瘤的微環(huán)境，這些因子抑制了DC功能并誘導(dǎo)產(chǎn)生Tregs；他們使用特異中和抗體，結(jié)果顯示其可增強(qiáng)對CCA細(xì)胞的殺滅效應(yīng)[14]。此外，Chutamas等[15]采用包含短發(fā)夾RNA的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)單核細(xì)胞衍生出了樹突狀細(xì)胞（SD-DC），這使TGF-βRII和IL-10受體的表達(dá)降低約90%，但仍難以從根本上降低癌細(xì)胞的免疫抑制作用。

綜上所述，采用改造殺傷細(xì)胞的CAK療法特異性較差，難以有效殺死腫瘤細(xì)胞。而改造DC方案特異性相對較高，可提高對CCA的療效，但癌癥微環(huán)境和癌細(xì)胞本身產(chǎn)生的免疫抑制仍難以克服，因此還需進(jìn)一步探索和研究，需要有效手段對抗腫瘤引起的強(qiáng)大免疫抑制。

2.2 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes,TIL）療法 為了提高治療腫瘤的特異性和有效性，研究者發(fā)現(xiàn)TIL本身具有選擇性，可特異性殺滅腫瘤細(xì)胞。這種腫瘤組織中的TIL，通過在體外培育和擴(kuò)增來重新輸注給患者自體的方法稱為TIL療法。TIL療法主要通過IL-2刺激TIL從而體外培養(yǎng)出淋巴細(xì)胞，過繼轉(zhuǎn)移給患者最終產(chǎn)生抗腫瘤作用。美國國立衛(wèi)生研究院于2014年報(bào)告1例43歲的伴有廣泛轉(zhuǎn)移的ICC婦女患者，采用TIL輸注抑制其腫瘤生長達(dá)7個(gè)月，表明TIL具有抗腫瘤活性[16]。

腫瘤DNA常表現(xiàn)為基因突變，而新抗原是一種基因發(fā)生改變了的蛋白質(zhì)，其可觸發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex,MHC）分子的呈遞作用。在包括CCA及多種上皮細(xì)胞癌中均證明了新抗原的觸發(fā)效應(yīng)[17]。但采用新抗原TIL治療的患者需使用特定的輸注藥品，且藥品生產(chǎn)周期長，往往趕不上腫瘤的生長速度[18]。

由此看來，TIL療法目前應(yīng)用仍不成熟，缺乏大數(shù)據(jù)驗(yàn)證，且生產(chǎn)過程耗費(fèi)大量時(shí)間，制備過程及工藝復(fù)雜，無法高效應(yīng)用于疾病的治療，生產(chǎn)成本高、特異性不強(qiáng)等問題仍需解決，還有待未來進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以及臨床研究。

2.3 特異性T細(xì)胞受體（TCR）T療法 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，研究人員開始逐漸探索出一種新的過繼細(xì)胞免疫療法，主要包括TCR和CAR[19]。其中TCR即使用正常的T細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可識別各種抗原，但修飾TCR時(shí)須注意其對正?？乖淖饔?。

Wang等[20]的一項(xiàng)研究采用人類白細(xì)胞抗原（human leukocyfe antigen-A,HLA-A）限制的小鼠T細(xì)胞，通過TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)人胰腺T細(xì)胞治療鼠類肉瘤病毒癌基因突變的腫瘤免疫缺陷小鼠可抑制腫瘤生長。為解決MHC引起的免疫障礙，Roland等[21]嘗試了一項(xiàng)CRISPR RNA引導(dǎo)的DNA修飾堿基編輯技術(shù)，其主要可通過HBV特異性重組T細(xì)胞受體（rTCR）來破壞基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致HBV特異性人群增加了40%，表明TCR T療法可用于改造免疫細(xì)胞以治療腫瘤。

但TCR需基因修飾，對相關(guān)技術(shù)的要求較高，研發(fā)成本高，存在MHC限制，且會(huì)造成自身抗原的破壞，還需未來進(jìn)一步探索和研發(fā)。目前較為成熟的TCR T療法主要為CAR，癌細(xì)胞表面的特定腫瘤相關(guān)抗原（TAA）能被CAR T細(xì)胞特異結(jié)合，因此它可以繞開MHC識別TAA。2021年蒙露等[22]采用CRISPR/Cas9基因編輯研制的CAR T細(xì)胞，結(jié)果顯示其在體外仍有殺傷效應(yīng)，并可抑制排斥反應(yīng)，但仍需未來進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明其有效性。

2.4 CAR T療法 近年來CAR T療法因兼具特異性及有效性被廣泛關(guān)注。最早CAR T療法是由Eshhar等[23]通過TCR的常區(qū)域結(jié)合單一抗體分子鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域（scFv），構(gòu)建CAR基因，誘導(dǎo)產(chǎn)生表達(dá)這種基因的T細(xì)胞，這被稱為第1代CAR；第2代CAR是指增加了一種刺激信號域CD28或CD137，可持續(xù)刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)T細(xì)胞增殖；第3代CAR是指增加了2個(gè)或2個(gè)以上的共刺激域，可提高其增殖能力，但其臨床療效較第2代來說孰優(yōu)孰劣仍不清楚[24]。國內(nèi)張偉光等[25]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶向B細(xì)胞抗原的第2代CAR T細(xì)胞比第3代殺傷力更強(qiáng)。Chmielewski等[26]研究開發(fā)了第4代CAR，其包括共刺激域和CAR誘導(dǎo)的IL-12盒式磁帶，除了可刺激T細(xì)胞產(chǎn)生，還可殺滅免疫逃避的腫瘤細(xì)胞，其抗腫瘤活性、增殖和存活均更強(qiáng)。因此目前CAR T細(xì)胞研究主要集中在第4代。

CCA患者進(jìn)行CAR T療法的重點(diǎn)是靶點(diǎn)的選擇。Xu等[27]采用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的基因技術(shù)分析間皮素K562-meso的作用，結(jié)果證實(shí)66.0%的meso-CAR T可用于治療膽道腫瘤細(xì)胞。Sangsuwannukul等[28]發(fā)現(xiàn)CD133是一種在癌癥患者中與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)伴侶，在67.6%的CCA標(biāo)本中均可發(fā)現(xiàn)CD133表達(dá)，ICC中CD133為52.6%。采用以CD133為靶標(biāo)的第4代CAR T細(xì)胞，在治療后可觀察到IFN-γ和TNF-α大量表達(dá)，表明此法有效。第4代CAR T細(xì)胞的存活能力及抗腫瘤能力使細(xì)胞免疫療法治療實(shí)體腫瘤成為可能，但完全治愈腫瘤目前還無法實(shí)現(xiàn)，仍需進(jìn)一步研究探索。

研究人員還發(fā)現(xiàn)CD276免疫檢查點(diǎn)分子（B7-H3）在ICC細(xì)胞和ICC啟動(dòng)細(xì)胞中表達(dá)豐富，而在正常組織中分布受限。B7-H3 CAR T細(xì)胞和移植了ICC細(xì)胞的小鼠細(xì)胞在體外用共培養(yǎng)，結(jié)果顯示其可消除近乎100%的ICC細(xì)胞[29]。此外T細(xì)胞可在其表面表達(dá)Fc受體CD64，利用CD64CAR T細(xì)胞在體外培育也達(dá)到同樣效果，表明此為有效的治療靶點(diǎn)[30]，有望用于臨床治療惡性腫瘤。此外，Phanthaphol等[31]研究發(fā)現(xiàn)，一種由α和β亞單位組成的跨膜異二聚體（αvβ6）整合素在很多實(shí)體的腫瘤中含量豐富，但在正常上皮細(xì)胞中含量極低。第4代靶向整合素αvβ6的A20-4G CAR T細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，有望用于αvβ6陽性CCA的細(xì)胞治療。

但CAR也有相應(yīng)毒副反應(yīng)。Feng等[32]采用CAR T雞尾酒療法對1例診斷為晚期不可切除肝門部CCA的女性患者連續(xù)注入靶向表皮生長因子受體（EGFR）和CD133的CAR T細(xì)胞；該患者治療后，雖然得到了8.5個(gè)月的局部緩解，但輸注CAR T細(xì)胞使患者產(chǎn)生了細(xì)胞因子釋放綜合征。因此對于CAR T治療的不良反應(yīng)仍需進(jìn)一步研究。

一項(xiàng)針對晚期CCA EGFR陽性患者CAR的臨床試驗(yàn)（NCT01869166）結(jié)果表明，5.8%的患者完全緩解，58.8%實(shí)現(xiàn)疾病穩(wěn)定[33]。針對人表皮生長因子受體（HER2）過表達(dá)實(shí)體瘤的 CAR（NCT04660929），以及針對黏蛋白1（MUC-1）CART治療ICC的安全性和有效性（NCT03633773）臨床試驗(yàn)仍在進(jìn)行中。

CAR T細(xì)胞針對實(shí)體瘤的治療效果不佳。Siddiqui等[34]總結(jié)15項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)共159例患者，這些試驗(yàn)結(jié)果總體上均表明各種惡性腫瘤與CAR T細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的患者例數(shù)占各自實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)總體患者的17%～100%，中位總體反應(yīng)率為62%，但大多數(shù)試驗(yàn)未到中位無進(jìn)展生存期和總生存期。最近Supimon等[35]將 MUC-1用作CAR T療法的靶向抗原，結(jié)果表明抗MUC-1-CAR4 T細(xì)胞通過增加TNF-α和 IFN-γ、促凋亡蛋白等的產(chǎn)生，促進(jìn)了共培養(yǎng)物中腫瘤細(xì)胞的裂解，表明抗 MUC-1-CAR4 T細(xì)胞對CCA有效。

從上述文獻(xiàn)可知，雖然研究者們通過各種靶點(diǎn)針對CAR T細(xì)胞進(jìn)行改造，但CAR T細(xì)胞仍很難殺死全部的腫瘤細(xì)胞。CAR T細(xì)胞只能針對腫瘤細(xì)胞表面的其中某一類抗原起效，并且腫瘤組織層次分明的排列使CAR T細(xì)胞很難滲透到內(nèi)部，雖然第4代CAR細(xì)胞較前幾代有一定改善，但實(shí)體瘤的免疫抑制作用仍然強(qiáng)大。仍需要大量的前瞻臨床實(shí)驗(yàn)和研究，有待進(jìn)一步的探索。

2.5 聯(lián)合治療 Reinhard等[36]研究發(fā)現(xiàn)一種納米RNA疫苗在特異性刺激CAR-T細(xì)胞后可提高CART細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，表明此聯(lián)合治療方法比單一CAR-T療法更有效。γδT細(xì)胞是一種執(zhí)行固有免疫的T細(xì)胞，不受HLA限制，因此具有適應(yīng)性免疫的特性以及強(qiáng)大的細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)通過健康人體血液中的單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增可得到γδT的細(xì)胞，將此細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)有治療作用[37]。一項(xiàng)國外研究中，1例ICC患者在肝移植后發(fā)生了縱隔淋巴結(jié)的腫瘤轉(zhuǎn)移，使用γδT細(xì)胞療法進(jìn)行8次治療后，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)明顯縮小[37]。DC是最有效的可誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫并支持獨(dú)立于T細(xì)胞先天免疫應(yīng)答的APC，γδT細(xì)胞與DC聯(lián)用可協(xié)調(diào)治療效果[38]。此外Farsaneh等[39]研究發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)CD40/CD40L的體外激活可以改善DC對膽管腫瘤的細(xì)胞毒副反應(yīng)，促進(jìn)Th1細(xì)胞因子/趨化因子的生成。由此看來聯(lián)合的細(xì)胞免疫治療相對更具優(yōu)勢，未來可在此方面繼續(xù)加強(qiáng)研發(fā)。

3 小結(jié)及展望

CCA的過繼細(xì)胞免疫療法利用自體產(chǎn)生的針對腫瘤的免疫細(xì)胞進(jìn)行改造和擴(kuò)增，培養(yǎng)后重新輸入人體使其發(fā)揮抗腫瘤作用。當(dāng)前較為成熟的是第4代CAR T細(xì)胞治療，可一定程度改善免疫抑制，但仍很難殺死全部的腫瘤細(xì)胞。聯(lián)合細(xì)胞治療相對更具優(yōu)勢，需未來進(jìn)一步探索研究。目前藥物的靶點(diǎn)選擇、療效的長期穩(wěn)定性、毒副反應(yīng)的減輕、生產(chǎn)成本的降低等問題仍需解決，相信隨著科技發(fā)展，細(xì)胞免疫療法在CCA上前景將會(huì)更加廣闊。