基于細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)相關(guān)基因構(gòu)建肝細(xì)胞癌預(yù)后風(fēng)險評估模型及驗證

應(yīng)樂倩 王德強 余暉 李小琴

肝細(xì)胞癌惡性程度高、預(yù)后差，且其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)居高不下[1]。免疫檢查點抑制劑的出現(xiàn)為肝細(xì)胞癌的治療開辟了新途徑，但由于缺乏理想的靶點，因此治療上缺乏個體化的用藥指導(dǎo)。同時，細(xì)胞焦亡這一新的細(xì)胞死亡方式被揭示，其本質(zhì)上是一場機體的“炎癥風(fēng)暴”，可激活免疫反應(yīng)[2]。研究顯示細(xì)胞焦亡與胃癌、肺癌以及結(jié)直腸癌等疾病有關(guān)，能影響抗腫瘤藥物的療效[3-8]。因此，本文基于細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)相關(guān)基因構(gòu)建肝細(xì)胞癌預(yù)后風(fēng)險評估模型，得到細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)評分（pyroptosis and inflammatory response score,PIRS），并進一步探索PIRS對腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）狀態(tài)的預(yù)測效能，以期為肝細(xì)胞癌的預(yù)防和診治提供新思路和新靶點。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 mRNA數(shù)據(jù)和臨床信息從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov）和國際癌癥基因組聯(lián)盟（international cancer genome consortium,ICGC）數(shù)據(jù)庫（https://dcc.icgc.org/projects/LIRI-JP）獲得[9]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）可通過mRNA數(shù)據(jù)計算PIRS；（2）符合肝細(xì)胞癌病理診斷；（3）年齡、性別、總生存期（overall survival,OS）、組織學(xué)分級以及病理學(xué)分期等臨床數(shù)據(jù)完整。最終從TCGA數(shù)據(jù)庫和ICGC數(shù)據(jù)庫分別篩選出365例和231例肝細(xì)胞癌患者。查閱相關(guān)文獻提取細(xì)胞焦亡相關(guān)基因[3-8]，并從基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）數(shù)據(jù)庫（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）下載炎癥反應(yīng)基因集。

1.2 肝細(xì)胞癌預(yù)后風(fēng)險評估模型構(gòu)建 使用R語言的limma包提取出TCGA數(shù)據(jù)庫中245個細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)基因的mRNA數(shù)據(jù)。采用單變量Cox回歸分析篩選與OS顯著相關(guān)基因，計算HR和95%CI。通過Kaplan-Meier生存分析得到其最佳截斷值，將mRNA數(shù)據(jù)進行二分類轉(zhuǎn)換：低表達組為0，高表達組為1。最小絕對收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator,Lasso）Cox回歸分析得到回歸系數(shù)，其絕對值定為＞0.2，構(gòu)建由15個基因組成的肝細(xì)胞癌預(yù)后風(fēng)險評估模型。通過模型公式計算出PIRS，并通過其在TCGA數(shù)據(jù)庫的中位值（0.2）分別將TCGA數(shù)據(jù)庫和ICGC數(shù)據(jù)庫中患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。

1.3 模型的有效性驗證 Kaplan-Meier生存分析比較兩組患者的預(yù)后。通過AUC比較PIRS預(yù)測患者預(yù)后的準(zhǔn)確性。通過prcomp函數(shù)進行主成分分析（principal components analysis,PCA），對高低風(fēng)險樣本分類進行降維模擬。通過單因素和多因素Cox回歸分析研究PIRS與肝細(xì)胞癌臨床病理特征間的關(guān)系。

1.4 評估TME狀態(tài)以及機制探索 通過單樣本GSEA（single sample GSEA,ssGSEA）計算出免疫浸潤細(xì)胞的含量和免疫相關(guān)通路的活性[10]?；谀[瘤免疫功能障礙與逃逸（tumor immune dysfunction and exclusion,TIDE）網(wǎng)站（http://tide.dfci.harvard.edu/）已有的免疫治療數(shù)據(jù)，上傳肝細(xì)胞癌患者表達譜數(shù)據(jù)預(yù)測TME的狀態(tài)。通過前期收集TCGA數(shù)據(jù)庫的免疫景觀圖譜，研究者已將所有TCGA樣本分為C1～C6免疫亞型[11]，分別為創(chuàng)傷愈合型、IFN-γ為主型、炎癥反應(yīng)型、淋巴細(xì)胞耗竭型、免疫沉默型和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）為主型。從分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）下載京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）和基因本體論（gene ontology,GO）數(shù)據(jù)庫，通過GSEA提取細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路以及生物學(xué)功能。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用R 4.0.3（www.r-project.org）統(tǒng)計軟件。基因表達與患者預(yù)后的關(guān)系分析采用Kaplan-Meier生存分析，兩組生存率比較采用logrank檢驗。不同臨床病理分期患者的基因表達水平比較采用單因素與多因素Cox回歸分析。計量資料兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌預(yù)后風(fēng)險評估模型的構(gòu)建 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，通過對245個細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)基因的mRNA數(shù)據(jù)進行單變量Cox回歸分析和Kaplan-Meier生存分析比較預(yù)后，篩選出與OS顯著相關(guān)的62個基因（P＜0.05，圖1a，見插頁）。因為速激肽受體3（tachykinin receptor 3,TACR3）基因的HR值高達211，為排除不同數(shù)據(jù)庫之間存在的測量誤差，TACR3基因不參與預(yù)后模型的構(gòu)建。采用Lasso Cox回歸分析確定15個基因參與模型構(gòu)建（圖1b，見插頁），其中C-C基序趨化因子受體（C-C motif chemokine receptor 7,CCR7）、顆粒酶 A（granzyme A,GZMA）、HPN（hepsin）、白細(xì)胞介素18受體輔助蛋白（interleukin 18 receptor accessory protein,IL-18RAP）、白細(xì)胞介素7受體（interleukin 7 receptor,IL-7R）和核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域 6（the nucleotide oligomerization domainlike receptor family pyrin domain containing 6,NLRP6）為保護因素；而C-C基序趨化因子配體20（C-C motif chemokine ligand 20,CCL20）、GSDMC（gasdermin C）、早老蛋白-1（presenilin-1,PSEN1）、金屬蛋白酶 α（meprin α,MEP1A）、核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域 2（nucleotide oligomerization domain 2,NOD2）、整合素亞基 α5（integrin subunit α5,ITGA5）、ras同家族 G（ras homolog family G,RHOG）、集落刺激因子3受體（colony stimulating factor 3 receptor,CSF3R）和白細(xì)胞介素15受體亞基α（interleukin-15 receptor subunit α,IL-15RA）為危險因素（圖1c，見插頁）。根據(jù)模型公式計算每個患者的風(fēng)險評分：PIRS=（-0.452）×CCR7 值+（-0.404）×GZMA 值+（-0.561）×HPN 值+（-0.710）×IL-18RAP 值+（-0.514）×IL-7R 值+（-0.385）×NLRP6 值+（0.332）×CCL20 值+（0.402）×GSDMC 值+（0.419）×PSEN1+（0.445）×MEP1A值 +（0.515）×NOD2 值 +（0.516）×ITGA5 值 +（0.601）×RHOG 值+（0.602）×CSF3R 值+（0.759）×IL-15RA 值。

圖1 肝細(xì)胞癌預(yù)后風(fēng)險評估模型構(gòu)建相關(guān)圖（a：預(yù)后相關(guān)差異基因森林圖；b：15個基因的部分似然偏差圖和系數(shù)；c：15個基因mRNA表達熱圖）

2.2 PIRS對肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的評估及驗證 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，高風(fēng)險組患者預(yù)后較差，其中位OS明顯低于低風(fēng)險組（P＜0.01，圖2a，見插頁）。隨著PIRS升高，肝細(xì)胞癌患者OS明顯縮短（圖2b，見插頁），PIRS的中位值可以將患者分為高、低風(fēng)險兩組（圖2c，見插頁）。通過隨時間變化的ROC曲線，PIRS的 AUC 值在 1、2、3年分別為 0.871、0.846和 0.831（圖2d，見插頁）。

同時，經(jīng)外部ICGC數(shù)據(jù)庫驗證，相比低風(fēng)險組，高風(fēng)險組患者預(yù)后較差（P＜0.01，圖2e，見插頁）。PIRS與OS生存狀態(tài)的動態(tài)分布圖和PCA結(jié)果如圖2f、g所示，在驗證數(shù)據(jù)庫中得到一致的結(jié)果。AUC值在1、2、3年時分別為 0.844、0.733和 0.751（圖 2h，見插頁），證明PIRS對預(yù)測肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后具有較高的準(zhǔn)確性。

圖2 PIRS對肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的評估及驗證（a、e：PIRS與預(yù)后的關(guān)系；b、f：PIRS與總生存期散點圖；c、g：主成分分析分布圖；d、h：ROC 曲線圖）

2.3 PIRS與臨床病理指標(biāo)預(yù)測患者預(yù)后的有效性比較 臨床病理指標(biāo)在患者預(yù)后的評估上有指導(dǎo)意義，但現(xiàn)有的指標(biāo)不足以滿足臨床個體化治療的需求，需進一步完善預(yù)后評估體系。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，通過單因素Cox回歸分析，腫瘤的病理分期和PIRS與預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）；多因素回歸分析顯示，PIRS是患者預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)（HR=2.802，95%CI：2.286～3.433，P＜0.01，圖 3a）；病理分期處于晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者的PIRS較Ⅰ～Ⅱ期明顯升高（圖3b）。根據(jù)AUC結(jié)果提示，相比現(xiàn)有的臨床病理指標(biāo)，PIRS對預(yù)后預(yù)測的有效性更高（AUC=0.870＞0.643，圖 3c）。

通過ICGC數(shù)據(jù)庫進行驗證，單因素Cox回歸顯示，患者性別、腫瘤病理分期和PIRS與預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）；多因素回歸分析顯示，PIRS為患者預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)（HR=1.873，95%CI：1.427～2.460，P＜0.01，圖3d）。病理分期處于晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者的PIRS較Ⅰ～Ⅱ期明顯升高（圖3e）。相比臨床病理指標(biāo)，PIRS對預(yù)后預(yù)測有更高的有效性（AUC=0.844＞0.767，圖3f）。說明PIRS預(yù)測肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的有效性不亞于現(xiàn)有的臨床病理指標(biāo)，具有臨床價值。

圖3 肝細(xì)胞癌預(yù)后風(fēng)險評估模型的獨立預(yù)后分析（a、d：單因素與多因素Cox回歸分析結(jié)果圖；b、e：PIRS與病理分期關(guān)系；c、f：PIRS與臨床指標(biāo)ROC曲線圖）

2.4 PIRS評估TME免疫浸潤狀態(tài) 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，高風(fēng)險組的B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞含量均明顯低于低風(fēng)險組（均P＜0.01），但高風(fēng)險組中巨噬細(xì)胞含量高于低風(fēng)險組（P＜0.01）；上述結(jié)果在ICGC數(shù)據(jù)庫中均得到驗證（圖4a、b）。同時，通過TIDE對TCGA數(shù)據(jù)庫的mRNA數(shù)據(jù)進行計算，高風(fēng)險組中T細(xì)胞驅(qū)逐（exclusion）評分和免疫功能障礙相關(guān)的TIDE預(yù)測評分相比低風(fēng)險組均明顯升高（均 P＜0.01，圖 4c、d）。綜上，高風(fēng)險組的 TME處于“冷腫瘤”狀態(tài)，是肝細(xì)胞癌患者免疫系統(tǒng)被抑制的重要因素。

高風(fēng)險組患者發(fā)生的免疫抑制可能與T細(xì)胞的細(xì)胞毒性減弱以及干擾素反應(yīng)性減低有關(guān)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，高風(fēng)險組細(xì)胞毒性通路、免疫促進通路、T細(xì)胞共刺激通路以及Ⅱ型干擾素反應(yīng)通路的活性均低于低風(fēng)險組（均P＜0.01，圖4e）。在ICGC數(shù)據(jù)庫中，高風(fēng)險組的Ⅰ型干擾素反應(yīng)通路活性較低風(fēng)險組低（P＜0.05，圖4f）。通過對TCGA免疫景觀圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷愈合型（C1）的PIRS最高，分別與IFN-γ為主型（C2）、炎癥反應(yīng)型（C3）及淋巴細(xì)胞耗竭型（C4）比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01，圖4g）。C1與血管生成基因的高表達相關(guān)，促進腫瘤的增殖[11]。上述研究結(jié)果均提示高風(fēng)險組預(yù)后差可能與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸有關(guān)。

圖4 基于肝細(xì)胞癌預(yù)后風(fēng)險評估模型的腫瘤免疫微環(huán)境評估（a、b：PIRS與免疫浸潤細(xì)胞含量關(guān)系；c：PIRS與T細(xì)胞驅(qū)逐評分關(guān)系；d：PIRS與腫瘤免疫功能障礙與逃逸預(yù)測評分關(guān)系；e、f：PIRS與免疫相關(guān)通路關(guān)系；g：PIRS與TCGA免疫景觀圖譜關(guān)系）

2.5 PIRS相關(guān)通路以及生物學(xué)功能 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，通過KEGG富集分析，細(xì)胞周期、堿基切除修復(fù)、同源重組、錯配修復(fù)、p53信號通路及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）信號通路富集在高風(fēng)險組，與腫瘤細(xì)胞增殖及血管新生有關(guān)。除此之外，高風(fēng)險組中富集了TGF-β信號通路，其能調(diào)控腫瘤免疫逃逸過程，進一步促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展（圖5a）。低風(fēng)險組主要富集了與代謝有關(guān)的一系列通路，其中包括脂肪酸代謝、初級膽汁酸生物合成代謝、視黃醇代謝以及色氨酸代謝等，低風(fēng)險組主要與維持機體自身的生理活動有關(guān)（圖5b）。

通過GO富集分析，高風(fēng)險組富集了細(xì)胞周期相關(guān)的生物學(xué)活動，此外，發(fā)現(xiàn)PIRS與大分子的甲基化相關(guān)（圖5c）。低風(fēng)險組則與脂肪酸代謝以及蛋白質(zhì)激活級聯(lián)反應(yīng)等生物學(xué)活動密切相關(guān)（圖5d）。

圖5 PIRS相關(guān)通路生物學(xué)功能與通路富集分析結(jié)果（a：高風(fēng)險組KEGG通路富集圖；b：低風(fēng)險組KEGG通路富集圖；c：高風(fēng)險組GO功能富集圖；d：低風(fēng)險組GO功能富集圖）

3 討論

細(xì)胞焦亡的概念最早可追溯至1992年，研究發(fā)現(xiàn)小鼠巨噬細(xì)胞感染志賀氏菌可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。隨后發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染引起的巨噬細(xì)胞死亡是一種完全不同于凋亡的細(xì)胞死亡方式[13]。隨著半胱氨酸天冬氨酸酶-1（caspase-1）以及gasdermin蛋白家族的發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡的機制被逐漸闡明。細(xì)胞焦亡信號通路分為依賴caspase-1的經(jīng)典途徑和依賴caspase-4/5/11的非經(jīng)典途徑。gasdermin-N結(jié)構(gòu)域的質(zhì)膜成孔活性是引起細(xì)胞焦亡的必要條件[14]，其可通過誘導(dǎo)質(zhì)膜孔的形成，釋放IL-1β和IL-18，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂從而發(fā)生焦亡[15]。2018年，細(xì)胞死亡命名委員會將pyroptosis定義為一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡[2]，嚴(yán)重依賴于gasdermin蛋白家族成員的質(zhì)膜孔形成，通常（但并不總是）由于caspase的激活所導(dǎo)致。

在15個基因中有4個基因編碼的蛋白直接參與細(xì)胞焦亡的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，包括GZMA、NLRP6、GSDMC以及NOD2。NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞通過GZMA誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的方式來殺傷GSDMB陽性的腫瘤細(xì)胞，起到抗腫瘤作用[16]。同時，IFN-γ能上調(diào)GSDMB表達并促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[16]。此外，炎癥小體已被證明可通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與細(xì)胞焦亡。NLRP6是炎癥小體的組成部分，可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)[17]。但有研究發(fā)現(xiàn)，在NLRP6基因敲除的小鼠肺中，NK細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-γ水平升高，且NLRP6可抑制革蘭陽性球菌感染所致的肺內(nèi)中性粒細(xì)胞招募[18]。NLRP6通過激活caspase-1誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞發(fā)生焦亡以及加重氧/糖剝離再灌注模型的神經(jīng)元損傷[19-20]。上述研究結(jié)果均提示NLRP6參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，但具體調(diào)節(jié)機制有待進一步明確。GSDMC是gasdermin蛋白家族中的一員，同樣具有誘導(dǎo)質(zhì)膜孔形成的能力。在低氧條件下，磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3與程序性死亡受體-配體1（PD-L1）相互作用增強GSDMC基因轉(zhuǎn)錄，GSDMC的高表達與預(yù)后不良有關(guān)[21]。GSDMC/caspase-8介導(dǎo)癌細(xì)胞中的非經(jīng)典的焦亡途徑[21]。此外，NOD2除了可以促進細(xì)胞凋亡和加重炎癥反應(yīng)，還能誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[22]。

此外，有5個受體蛋白的編碼基因和1個配體的編碼基因，都參與腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)，分別是IL-7R、IL-18RAP、IL-15RA、CCR7、CSF3R 以及 CCL20。IL-7R編碼一種具有特異性α鏈和共細(xì)胞因子受體γ鏈的異二聚體受體。在乳腺癌、肺癌、腎癌和結(jié)腸癌組織中，IL-7R和（或）IL-7的表達增加[23]，促進肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[24]。IL-18RAP通過IL-18和IL-18RAP軸在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[25]。IL-15和IL-15RA作為共刺激因子可提高TME內(nèi)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤水平，在膠質(zhì)瘤治療中能提高溶瘤病毒治療聯(lián)合免疫治療的協(xié)同效應(yīng)，提高抗腫瘤作用[26]。除此之外，TGF-β可下調(diào) NK細(xì)胞活化標(biāo)志物和細(xì)胞毒性顆粒的表達，研究發(fā)現(xiàn)IL-15和IL-15RA是TGF-β信號通路的抑制劑[27]。在抑制性腫瘤微環(huán)境中，IL-15和IL-15RA有潛力成為重新激活NK細(xì)胞的靶點，從而逆轉(zhuǎn)NK細(xì)胞的功能障礙。CCR7主要在未發(fā)生細(xì)胞焦亡的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DC）中發(fā)揮作用，過度活躍的DC依賴于CCR7，提高自身遷移到淋巴結(jié)引流區(qū)的能力和T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性[28]。CSF3R基因缺失突變導(dǎo)致先天性中性粒細(xì)胞減少癥，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子刺激機體生成粒細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫[29]。CCL20是趨化因子受體CCR6的配體，首先在肝臟中被檢測到并且表達在巨噬細(xì)胞中，其能激活輔助性T細(xì)胞17產(chǎn)生IL-17。同時，IL-17也是CCL20表達的強誘導(dǎo)因子[30]。因此，上述正反饋關(guān)系表明 CCL20水平與IL-17信號激活密切相關(guān)，參與機體的固有免疫。

參與模型構(gòu)建的另外5個基因同樣與TME息息相關(guān)，參與腫瘤的惡性生物學(xué)行為。MEP1A編碼是一種鋅金屬內(nèi)肽酶，有蛋白酶活性，通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與肝癌的疾病進展[31]。HPN編碼絲氨酸蛋白酶，主要在肝臟中表達，也與前列腺癌和卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[32]。PSEN1編碼的蛋白是組成膜蛋白γ分泌酶的成分，研究發(fā)現(xiàn)PSEN1可通過抑制應(yīng)激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶途徑從而抑制機體免疫激活信號的傳導(dǎo)[33]。RHOG是控制癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的信號元件，影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和細(xì)胞間的黏附，介導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲[34]。ITGA5是整合素家族成員，mir-26a通過ITGA5誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞失去歸巢能力而發(fā)生凋亡[35]。

肝臟是一個沉默的器官，肝癌一旦發(fā)現(xiàn)大多數(shù)已是晚期，其惡性程度高，嚴(yán)重威脅著國人的身體健康[1]。肝細(xì)胞癌預(yù)后風(fēng)險評估模型的高風(fēng)險組患者TME表現(xiàn)出的免疫抑制狀態(tài)，可能與T細(xì)胞的細(xì)胞毒性減弱以及干擾素反應(yīng)性減低有關(guān)。研究表明病毒侵襲引發(fā)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生影響細(xì)胞中脂肪酸代謝，促進胞內(nèi)ATP含量升高，使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)[36]。因此，高風(fēng)險組的干擾素反應(yīng)性減低，可能更容易患HBV、HCV等病毒感染，進一步引起肝硬化以及肝癌的發(fā)生。同時，高風(fēng)險組中富集的TGF-β通路可通過T細(xì)胞驅(qū)逐降低對PD-L1檢查點抑制劑的療效[37]，促進腫瘤免疫逃逸，對患者預(yù)后造成不利影響。

免疫治療是基于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機制而設(shè)計，如靶向血管新生，激活效應(yīng)免疫細(xì)胞，抑制巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞釋放TGF-β等。值得關(guān)注的是，信迪利單抗聯(lián)合貝伐珠單抗已經(jīng)獲批用于肝細(xì)胞癌一線治療[38]。生物制劑的出現(xiàn)為腫瘤治療提供更多的可能性，研究人員發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤的免疫治療過程中，一部分患者對免疫治療有先天抵抗作用。加入細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6抑制劑可以提高腫瘤對免疫治療的敏感性，同時抑制腫瘤細(xì)胞的生長[39]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期通路在高風(fēng)險組顯著富集。由于目前肝細(xì)胞癌單用免疫治療的療效不理想，或許聯(lián)合細(xì)胞周期抑制劑能提高肝細(xì)胞癌患者對免疫治療的敏感性。

綜上所述，聯(lián)合用藥為肝細(xì)胞癌的精準(zhǔn)治療提供可能，而細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)相關(guān)通路將成為其中一個重要的靶點，值得深入研究。