低FODMAP飲食對潰瘍性結腸炎模型大鼠TNF-α、IL-17表達的影響

陳燕 黃益倩 童曉清 章小艷 束龍 鄭培奮

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）是一種慢性非特異的腸道炎性疾病，其全球發(fā)病率逐年上升，發(fā)病機制涉及多方面因素，包括遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫反應失調、環(huán)境因素等[1]。近年來，低可發(fā)酵寡聚糖、雙糖、單糖及多元醇（FODMAP）飲食在腸易激綜合征（irritable bowel syndrome,IBS）患者中的應用研究受到了學者的廣泛關注[2]。FODMAP是指人體難吸收的一些短鏈碳水化合物，研究表明，這些短鏈碳水化合物在小腸內不容易被吸收，但在結腸中卻高度發(fā)酵而產(chǎn)氣，進而導致腹脹和腹瀉等癥狀加劇[3]。國外臨床研究也證實，低FODMAP飲食能有效改善炎癥性腸病患者的腹痛、腹脹等胃腸道癥狀[4]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，低FODMAP飲食輔助藥物治療能明顯改善UC大鼠輔助T細胞（Th）1和Th2細胞比例，降低轉化生長因子-β1和叉頭框蛋白3陽性表達[5]。然而，關于低FODMAP飲食是否與UC大鼠促炎因子表達相關，目前國內尚鮮見文獻報道。為此，本研究擬探討低FODMAP飲食對UC大鼠TNF-α和IL-17表達的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選擇清潔級成年雄性SD大鼠40只，體重（200±10）g，購自浙江省實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)條件：光照12 h，溫度（20.0±2.0）℃，環(huán)境相對濕度 40%～70%，自由飲水、進食，定期更換墊料。

1.2 主要試劑和儀器 IL-17抗體購自博奧森公司（批號：bs-2140R-50 μl，規(guī)格：50 μl）；TNF-α 抗體購自江萊生物公司（批號：JL13202，規(guī)格：96 T）；三硝基苯磺酸（TNBS）購自深圳市文樂生物科技有限公司（批號：R089840，規(guī)格：25 g/瓶）；美沙拉嗪緩釋顆粒購自法國愛的發(fā)制藥公司（批號：H2010006，規(guī)格：1.0 g/粒）；蘇木精（批號：714094）、伊紅（批號：BA4099）均購自德國BASO公司；HE試劑盒購自美國Richard-Allan Scientific公司；辣根過氧化物酶（批號：P8020，規(guī)格：1 g）、PBS（批號：P1010-2L，規(guī)格：2 L）均購自北京索萊寶公司；正置顯微鏡購自日本Olympus公司（型號：CX41）。

1.3 動物分組及造模 40只大鼠進行適應性喂養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法分為高FODMAP組、低FODMAP組、模型組和空白對照組，每組10只。除空白對照組外，參照Murano等[6]的造模方法，采用三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸法（5%TNBS+50%乙醇，按照 1∶1的比例配成灌腸液）制作UC大鼠模型。造模前禁食不禁水24 h，用大鼠灌胃針輕緩從肛門插入，深度約6 cm，推入灌腸液（100 mg/kg TNBS），推入后立即提尾倒立1 min后放回籠中自然蘇醒，并常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 干預方法 大鼠造模后第4天，開始給予相應的干預措施。高FODMAP組大鼠給予定制的高FODMAP鼠糧，包括黃豆、小麥和黑麥制品、魚粉、芒果、杏仁面和麥芽糖醇；低FODMAP組大鼠給予定制的低FODMAP鼠糧，包括大米、小米、燕麥、玉米、土豆、白菜和葡萄糖；模型組和空白對照組喂養(yǎng)飼料均為清潔級鼠糧，包括小麥、玉米、麩皮、豆柏和酵母粉等；上述鼠糧均參照文獻[5]配制。高FODMAP組和低FODMAP組均予美沙拉嗪緩釋顆粒灌胃治療（美沙拉嗪顆粒配制成25.0 g/L 溶液，每次 0.02 ml/g，1次/d）；模型組和空白對照組均予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃；干預治療療程為14 d。末次給藥24 h后，大鼠先吸入過量乙醚，再采用摘眼球法取血，離心后取血清備用，處死后迅速切取遠端結腸腸管，沿縱軸切開選取潰瘍最明顯處病變腸段取材，若無潰瘍則選取紅腫糜爛較明顯處病變腸段取材，并分為3份待檢。

1.5 觀察指標

1.5.1 疾病活動指數(shù)（DAI）評分 干預過程中觀察各組大鼠每日體質量變化、糞便性狀（是否成形）、便血等情況，計算出大鼠DAI評分。DAI評分＝體質量下降分數(shù)+糞便性狀分數(shù)+便血分數(shù)。DAI評分標準如下：無體質量下降、大便性狀正常、無便血記0分；體質量下降1%～5%記1分；體質量下降＞5%～10%、半稀便、大便隱血（+）記2分；體質量下降＞10%～15%記3分；體質量下降＞15%、稀便、肉眼血便記4分[7]。

1.5.2 結腸黏膜大體形態(tài)損傷評分 各組大鼠取1份結腸組織標本，觀察結腸黏膜大體形態(tài)改變，并參照下列標準進行評分：無損傷為0分；黏膜充血為1分；潰瘍面積＜受損面積的25%為2分；潰瘍面積＝受損面積的25%～50%為3分；潰瘍面積＞受損面積的50%為 4 分[8]。

1.5.3 結腸黏膜組織病理學評分 取1份結腸組織標本用甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察大鼠結腸黏膜組織損傷情況。100倍視野下隨機選擇8處進行評分并取均值，參照病理損傷評分系統(tǒng)。0分為正常腸黏膜；1分為缺少1/3隱窩；2分為缺少2/3隱窩；3分為固有層被單層上皮細胞覆蓋和較少的炎癥細胞浸潤；4分為炎癥細胞數(shù)量增多并有炎癥細胞明顯浸潤。

1.5.4 結腸黏膜及血清TNF-α、IL-17水平檢測 取1份結腸組織標本，用載玻片輕刮去結腸黏膜表面黏液，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，再使用載玻片刮取結腸黏膜組織，剪取約200 mg，冰上剪碎，再加入2 ml預冷的PBS，用勻漿器制成勻漿，4℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液，-80℃冰箱保存。大鼠結腸黏膜及血清TNF-α、IL-17水平檢測采用ELISA法，所有過程均嚴格按照試劑盒說明書操作。用純化的大鼠TNF-α、IL-17抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入大鼠TNF-α、IL-17，再與辣根過氧化物酶標記的TNF-α、IL-17抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。TMB在辣根過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNF-α、IL-17水平呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD）值，通過標準曲線計算樣品中大鼠TNF-α、IL-17水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠一般情況比較 建模前，40只SD大鼠毛色光潤，進食正常，反應靈活，大便呈顆粒狀，無稀便及膿血便；而在建模后的第4天，除空白對照組大鼠外，其余大鼠均相繼出現(xiàn)體質量下降，并且伴有黏液便、血便、倦怠懶動、活動減少、反應遲鈍、毛發(fā)凌亂、拱背、飲食飲水減少等現(xiàn)象，提示造模成功。造模過程各組大鼠無死亡。

2.2 4組大鼠干預階段DAI評分比較 高FODMAP組、低FODMAP組和模型組大鼠DAI評分均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，低FODMAP組大鼠在干預的第7和14天時，DAI評分均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而高FODMAP組大鼠則在干預的第14天時，DAI評分出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與低FODMAP組相比，高FODMAP組大鼠在干預的第7、14天時DAI評分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠干預階段DAI評分比較（分）

2.3 4組大鼠結腸黏膜大體形態(tài)損傷評分比較 高FODMAP組和模型組大體形態(tài)損傷評分均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，高FODMAP組和低FODMAP組大體形態(tài)損傷評分均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與低FODMAP組相比，高FODMAP組大鼠大體形態(tài)損傷評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而低FODMAP組與空白對照組大體形態(tài)損傷評分比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 4組大鼠結腸黏膜大體形態(tài)損傷評分比較（分）

2.4 4組大鼠結腸黏膜組織病理學評分比較 高FODMAP組、低FODMAP組和模型組組織病理學評分均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，高FODMAP組和低FODMAP組組織病理學評分均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表3。結腸黏膜組織病理學檢查見圖1。

圖1 各組大鼠結腸黏膜組織病理學檢查所示（a：空白對照組；b：模型組；c：低FODMAP組；d：高FODMAP組；HE染色，×100）

表3 4組大鼠結腸黏膜組織病理學評分比較（分）

2.5 4組大鼠結腸黏膜和血清TNF-α、IL-17水平比較 與空白對照組相比，高FODMAP組、低FODMAP組和模型組結腸黏膜和血清TNF-α、IL-17水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，高FODMAP組和低FODMAP組TNF-α、IL-17水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與低FODMAP組相比，高FODMAP組結腸黏膜TNF-α、IL-17水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表 4。

表4 4組大鼠結腸黏膜和血清TNF-α、IL-17水平比較（pg/ml）

3 討論

UC是一種病因和發(fā)病機制尚未完全明確的結直腸炎癥性疾病。目前臨床對UC尚無有效的根治方法，且患者病情容易反復，病程較長。因此，臨床的治療目標是誘導并維持臨床緩解以及黏膜愈合，防治并發(fā)癥，從而改善患者生命質量[9]。臨床上治療UC的藥物主要包括氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、硫嘌呤類藥物、免疫抑制劑和生物制劑。與此同時，飲食作為輔助手段作用于UC的臨床治療越來越受到重視[10]。因此，本研究采用TNBS灌腸法建立UC大鼠模型，主要觀察低FODMAP飲食對UC大鼠TNF-α和IL-17表達的影響。

隨著我國IBS發(fā)病率的不斷上升，F(xiàn)ODMAP飲食的相關研究也日益引起學者關注。2016年的一項臨床研究表明，高達86%的IBS患者在采用低FODMAP飲食時癥狀有所緩解[11]。而刊出在Gastroenterology雜志上的一項最新隨機對照試驗研究顯示，為期4周的低FODMAP飲食對于管理靜止期IBD患者的持續(xù)腸道癥狀是安全和有效的[12]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，同常規(guī)飼料喂養(yǎng)UC大鼠相比，低FODMAP組大鼠的DAI評分、結腸黏膜大體形態(tài)損傷評分、結腸黏膜和血清TNF-α、IL-17水平更低。這一結果說明了低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪能夠明顯降低UC大鼠結腸黏膜相關炎性因子的表達，有助于接受藥物治療的UC大鼠快速恢復。低FODMAP飲食的作用機制可能是：（1）低FODMAP飲食減少了結腸氣體的產(chǎn)生，避免結腸因氣體產(chǎn)生而膨脹，引起腹部不適，Sloan等[13]在一項隨機對照試驗中發(fā)現(xiàn)，低FODMAP飲食可顯著減少氫氣的產(chǎn)生，改變菌群組成，但對結腸容積無顯著影響；（2）低FODMAP飲食可以降低內臟的敏感性，張靈等[14]研究報道，低FODMAP飲食減少了人體難吸收的短鏈碳水化合物的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，例如短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸能誘導內臟超敏反應。

IL-17是CD4+效應T細胞亞群Th17細胞和CD8+效應性T細胞亞群Tc17細胞分泌的一種促炎癥細胞因子，它能夠刺激多種細胞分泌 TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等多種促炎因子，誘導腸道的炎癥反應[15]。腸道炎癥狀態(tài)時，初始CD4+T細胞在IL-23等前炎癥細胞因子的作用下，可促進T細胞分化為Th17細胞，并誘導分泌 IL-17。既往研究結果表明，TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子與UC發(fā)病密切相關，并與UC的疾病活動呈正相關，且抗TNF-α單克隆抗體目前已用于UC的臨床治療[16]。本研究結果顯示，模型組大鼠結腸黏膜TNF-α和IL-17水平較空白對照組均明顯上升。而在低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪干預后，炎癥因子水平均出現(xiàn)明顯的下降，這可能是與低FODMAP飲食增加調節(jié)性T細胞產(chǎn)生[17]、減輕炎癥反應、促進腸道黏膜修復有關。此外，研究表明，低 FODMAP飲食也可通過抑制NF-κB免疫炎癥信號通路、加強腸上皮細胞間緊密連接而發(fā)揮其抗炎作用，最終達到治療UC的作用[18]。

綜上所述，低FODMAP飲食聯(lián)合美沙拉嗪能明顯降低UC大鼠DAI及結腸黏膜大體形態(tài)損傷評分，改善了炎癥因子TNF-α和IL-17水平，為低FODMAP飲食在UC的臨床應用提供實驗與理論依據(jù)。