建立術后腸梗阻大鼠模型的新方法及評價

李倩 莫黎 何永恒

術后腸梗阻是腹部外科手術后早期常見的并發(fā)癥之一[1]，以惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、排氣時間延長及腸鳴音異常為主要臨床表現(xiàn)[2]，其發(fā)病率可高達17%～20%，尤其以腸道手術后更為常見[3]。術后腸梗阻癥狀通常持續(xù)2～4 d，有時甚至會長達7 d以上，部分患者（尤其是經(jīng)腸吻合后的患者）腸梗阻時間會顯著延長[4]，術后腸梗阻治療周期長、恢復慢，患者術后住院時間延長使患者和社會的醫(yī)療負擔增加[5]。目前該疾病的主要治療策略是在常規(guī)腹部外科手術后治療的基礎上減輕胃腸負擔（如禁食及使用鼻胃管等），針對性的治療措施少，因此理想術后腸梗阻造模方式的建立有著重要意義。目前國內外主要采用Kalff教授[6]及王李教授[7]的方法，即通過摩擦小腸來建立術后腸梗阻模型，但其與臨床實際情況尚有差距，因此本實驗研究了不同造模方法對SD大鼠術后胃腸動力及血清IL-6、TNF-α水平的影響，旨在建立操作便捷、能真實模擬臨床腹部手術術后腸梗阻且重復性好的動物模型，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體重（200±20）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：[SYXK（湘）2016-0002]。購入后于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物房適應性喂養(yǎng)5 d，所有針對大鼠的實驗操作均遵守實驗動物使用和保護條例，本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學倫理審查批準（批準編號：LL2019092005）。

1.2 實驗主要試劑 IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒由上海晶天生物提供，生產(chǎn)批號分別為E20200103010、E20200103012。

1.3 動物分組及建模方式 將60只SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型A、B、C、D組、假手術組和空白組，每組10只。模型A、B、C、D組和假手術組大鼠手術前均禁食24 h，不禁飲，術后禁食不禁飲，麻醉方式為10%水合氯醛（0.25 ml/100 g）腹腔注射。模型A組開腹后以沾有0.9%氯化鈉溶液棉簽自小腸近心端向遠心端擦拭3次，手術后順序還納腸管；模型B組開腹后提出盲腸，結扎并切除部分盲腸；模型C組結扎并切除部分盲腸，再以0.9%氯化鈉溶液棉簽行小腸擦拭1次；模型D組結扎并切除部分盲腸后，再于小腸中部離斷，以3-0可吸收線間斷全層縫合小腸；假手術組開腹后靜置20 min關腹；空白組不予手術處理。

1.4 取材及檢測 所有大鼠術后23.5 h均給予0.15 ml活性炭溶液灌胃，0.5 h后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。

1.4.1 血清IL-6、TNF-α水平檢測 大鼠麻醉后將其固定，心尖采血，靜置 1 h后，4 000 r/min、4℃離心 15 min，取上清液，干冰即時冷凍保存，采用ELISA法檢測血清 IL-6、TNF-α 水平。

1.4.2 胃腸推進率及胃殘留物質量檢測 開腹后，輕柔分離展開腸管，夾閉胃賁門、幽門及回腸下端，計算胃腸推進率（胃腸推進率=小腸染黑長度/全小腸長度×100%），并分離胃體測量胃殘留物質量（胃殘留物質量=全胃重量-洗凈后胃體重量）。

1.4.3 小腸病理切片觀察 靠近幽門取2 cm近端小腸腸管，0.9%氯化鈉溶液洗凈后以4%多聚甲醛固定液固定，用于 HE染色。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，滿足方差齊性的計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；不滿足方差齊性的計量資料則應用Welch檢驗，多重比較采用Tamhane's T2檢驗；Pearson相關分析胃腸推進率與血清IL-6、TNF-α水平的相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 6組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 術后24 h，空白組 IL-6、TNF-α 水平均明顯小于模型 A、B、C、D組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；模型C、D組IL-6、TNF-α水平均明顯高于模型A、B組、假手術組、空白組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。見表1。

表1 6組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（ng/L）

2.2 6組大鼠胃腸推進率、胃殘留物質量比較 術后24 h，空白組胃腸推進率均明顯高于模型A、B、C、D組，胃殘留物質量均明顯低于模型B、C、D組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；模型C、D組胃腸推進率均明顯低于模型A組、假手術組、空白組，胃殘留物質量均明顯高于模型A組、假手術組、空白組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），其中模型C組胃腸推進率明顯低于模型A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表 2。

表2 6組大鼠胃腸推進率及胃殘留物質量比較

2.3 6組大鼠小腸病理切片觀察 模型A、B組的腸黏膜壞死、脫落；模型C、D可見黏膜壞死、脫落并有大量炎癥細胞浸潤；空白組及假手術組腸黏膜上皮排列有序，絨毛結構清晰，組織結構正常，未見損傷，見圖1。

圖1 6組大鼠小腸病理切片所見（a：空白組；b：假手術組；c：模型A組；d：模型B組；e：模型C組；f：模型D組；HE染色，×200）

2.4 大鼠胃腸推進率與血清IL-6、TNF-α水平的相關性分析 大鼠胃腸推進率與血清IL-6水平呈負相關（r=-0.85，P＜0.01），與血清 TNF-α 水平呈負相關（r=-0.79，P＜0.01），見圖 2、3。

圖2 胃腸推進率與血清IL-6水平關系的散點圖

圖3 胃腸推進率與血清TNF-α水平關系的散點圖

3 討論

現(xiàn)代研究普遍認為術后腸梗阻大致有兩個不同的階段：（1）以過度抑制反應為特征的短暫神經(jīng)介導階段；（2）較長的炎癥反應階段[8]。而炎癥反應在術后腸梗阻的后續(xù)維持階段起關鍵作用[9]。在20世紀90年代后期，研究發(fā)現(xiàn)手術操作會引發(fā)白細胞在相應腸段中的流入，損害發(fā)炎腸管的收縮能力，導致腸管持久性運動障礙[10-11]。之后，許多研究結果表明肥大細胞在術后腸梗阻的炎癥級聯(lián)反應中起關鍵作用，如術后腸梗阻模型小鼠的腹腔液中肥大細胞蛋白酶-I水平顯著增加，且腸肌層有明顯的炎性浸潤，而用肥大細胞穩(wěn)定劑酮替芬預處理小鼠能夠防止腸肌層的炎性細胞募集，并且可改善手術后小鼠的胃排空現(xiàn)象[12]；肥大細胞缺陷型術后腸梗阻小鼠也同樣表現(xiàn)出手術后炎癥反應減弱的現(xiàn)象[13]。而在結腸切除術后發(fā)生術后腸梗阻患者中，肥大細胞的激活也有明顯增加[14]。此外，研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)單核細胞和常駐巨噬細胞也與腸管炎癥反應有關[10]。而腸壁內相關細胞的激活，部分由與損傷相關的分子模式和病原體相關的分子模式引起，前者是響應機械釋放的大分子或化學細胞損傷（例如腸管的手術操作），后者是由與炎癥相關的滲透性增加而通過腸壁移位所引起，網(wǎng)絡狀分布的常駐巨噬細胞、肥大細胞活化后，誘導促炎細胞因子TNF-α、IL-1B、IL-6和單核細胞趨化蛋白-1等的分泌，組織隨后進入細胞炎癥期，大量的單核細胞和中性粒細胞進入肌層，進而導致腸管收縮力受損[1]。而在臨床中術后腸梗阻患者的血清IL-6以及TNF-α水平較術前均有明顯升高[15]，因此本研究中選取此兩種促炎細胞因子作為模型評價標準。

目前國內外術后腸梗阻動物模型的建立主要承自Kalff教授建立的模型制造方法：開腹后，將小腸移出腹腔，以0.9%氯化鈉溶液濕潤棉簽或紗布擦拭小腸腸管表面，再按順序還納腸管，關腹。擦拭的具體操作各個實驗項目略有不同，有以時間記，5～20 min不等；有以次數(shù)記，3～5次不等；方向均為近端至遠端，模擬腹部手術造成的腹腔內的刺激。傳統(tǒng)的造模方式雖然操作簡單，但沒有模擬腸管離斷對機體的刺激，而研究表明術后5 h，腸管切口處附近肌肉會出現(xiàn)電慢波和相性收縮，這個現(xiàn)象會隨著切除上下距離的增加而減少[16]。因此腸管離斷對胃腸動力的影響是實際存在且不能忽視的，且其單純對小腸進行手術操作，忽略了腹部空腔臟器吻合帶來的感染風險。

本研究綜合了以往的造模方式并結合臨床實際情況，創(chuàng)新地建立了幾種手術造模方式：模型B組盲腸結扎并切除；模型C組盲腸結扎并切除后以0.9%氯化鈉溶液棉簽擦拭小腸1次；模型D組首先部分盲腸切除，縫扎閉合遠端，然后在小腸中部離斷行腸管吻合術。根據(jù)術后腸梗阻的臨床特征及現(xiàn)有的機制研究結果，本研究團隊選取了血清IL-6、TNF-α水平、胃腸推進率及胃殘留物質量作為主要檢驗指標。

本研究結果表明，術后24 h，空白組胃腸推進率均明顯高于模型A、B、C、D組，胃殘留物質量均明顯低于模型B、C、D組，模型C、D組胃腸推進率均明顯低于模型A、假手術、空白組，胃殘留物質量均明顯高于模型A、假手術、空白組，其中模型C組胃腸推進率高于模型B組，證明盲腸切除手術操作對胃腸推進率的影響要大于傳統(tǒng)的小腸擦拭法，且C組能更好的模擬臨床腹部手術患者術后的胃腸功能顯著減低的狀態(tài)；術后24 h，各模型組血清IL-6水平均明顯高于空白組，與郭薇等[17]研究結果一致。在各組小腸病理切片觀察中也發(fā)現(xiàn)，各模型組均可見腸黏膜壞死、脫落及大量炎癥細胞浸潤，以模型C、D兩組最為明顯。再從操作便捷度來看，模型A組為傳統(tǒng)造模方法，操作較為復雜，在多次擦拭小腸的過程中容易出現(xiàn)漿膜損傷及血管斷裂等情況，且模型的重復性不佳，易出現(xiàn)個體差異，而盲腸切除的操作相對簡單，模型D組雖然也能較好的模擬術后腸梗阻，但手術難度較高，在實驗過程中，因出現(xiàn)吻合口瘺導致大鼠死亡1例，不適合推廣。

綜合來看，模型C組在胃腸動力及促炎細胞因子等方面很好地模擬了臨床實際情況，且造模方式便捷，減少了擦拭過程中的意外，采用盲腸切除術更貼近于胃腸道手術術后腸梗阻的動物模型；此外，盲腸切除+小腸擦拭1次的造模方式使得操作刺激量更加可控，此方法操作便捷度好，模型重復性好，適合推廣應用。