大蒜鱗莖浸提液對(duì)花生根腐病菌的抑制作用

袁冬梅，于靜，遲玉成，許曼琳，張霞，郭志青，宋新穎，何康，李瑩

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)與信息科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省花生研究所，山東 青島 266100）

花生（Arachis hypogaea）是我國(guó)重要的油料與經(jīng)濟(jì)作物?；ㄉ∈且环N常發(fā)性病害，其病原菌主要有尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、層出鐮孢菌（F.proliferatum）和茄腐鐮孢菌（F.solani）［1］。病原菌在花生整個(gè)生育期均可侵染，破壞維管束組織，影響正常的營(yíng)養(yǎng)和水分等物質(zhì)運(yùn)輸。該病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)造成減產(chǎn)20%以上?，F(xiàn)階段花生上鐮孢菌的防治主要依賴化學(xué)藥劑，存在易產(chǎn)生抗藥性及環(huán)境污染等問題。為尋求綠色環(huán)保且高效廣譜的防治措施，植物源殺菌劑的開發(fā)與研究日趨受到重視，利用其防治花生根腐病可減少農(nóng)藥殘留，提高花生質(zhì)量安全。

植物是生物活性化合物的天然寶庫(kù)，含有的次生代謝產(chǎn)物包括生物堿類、萜烯類、黃酮類、檸檬素和番荔枝內(nèi)酯等化合物都具有較強(qiáng)的抑菌活性［2，3］。利用植物提取物為材料探究其對(duì)病原菌的抑制作用是植物源農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)。丁香［4］、甘草［5］和瑞香狼毒［6］的提取物對(duì)植物枯萎病菌的抑制效果較好；Rongai等［7］發(fā)現(xiàn)石榴中的石榴鞣花酸可以抑制番茄枯萎病菌。

目前關(guān)于蔥屬植物浸提液對(duì)植物根腐病菌抑菌效果的研究已有不少報(bào)道。張偉等［8］研究表明蔥屬植物（洋蔥、韭菜、蔥、大蒜）的浸提液對(duì)三七根腐病病原菌均能產(chǎn)生顯著的抑制效果，其中大蒜浸提液的效果最好。蔣繼志等［9］采用4種蔥屬植物的水提液對(duì)引起草莓根腐病的兩種主要病原菌進(jìn)行抑菌效果研究，結(jié)果表明，韭菜和大蒜水提液在濃度較高時(shí)對(duì)膠孢炭疽菌和立枯絲核菌均有明顯的抑制效果。大蒜（Allium sativmL.）是公認(rèn)的天然植物廣譜抗菌材料，大蒜油中含有29種含硫化學(xué)物質(zhì)，對(duì)3個(gè)念珠菌?；》N和3個(gè)芽孢桿菌?；》N都具有抑制活性［10］；大蒜揮發(fā)性物質(zhì)和大蒜浸出液的體外試驗(yàn)表明，其對(duì)多種人類致病真菌包括白色念珠菌有抑制和殺滅作用［11］。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域已有關(guān)于大蒜提取物控制農(nóng)產(chǎn)品病害的研究報(bào)道。但是，關(guān)于大蒜對(duì)花生中病原菌的抑制作用及其防病效果研究不多。本研究通過測(cè)定大蒜鱗莖浸提液對(duì)花生根腐病菌的抑制作用，以期為利用大蒜植物源殺菌劑防治花生根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）PRIFo01、層出鐮孢菌（F.proliferatum）PRI－Fp01和茄腐鐮孢菌（F.solani）PRI－Fs01，分離自花生根腐病，由本實(shí)驗(yàn)室保存。新鮮紫皮大蒜購(gòu)自山東省青島市李滄農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜鱗莖浸提液的制備 稱取新鮮大蒜鱗莖40 g，洗凈后切碎，浸泡在100 mL無菌水中，室溫放置48 h。紗布過濾后再用0.2μm細(xì)菌過濾器過濾，獲得大蒜鱗莖浸提液母液（0.40 g／mL），4℃保存。

1.2.2 大蒜鱗莖浸提液對(duì)3種鐮孢菌的抑制作用 采用含藥培養(yǎng)基法：將母液按照20%、10%、5%的體積比分別加入已融化并冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿中，制成分別含0.08、0.04、0.02 g／mL大蒜鱗莖浸提液的培養(yǎng)基，以不加浸提液為對(duì)照組（CK）。采用直徑為6 mm的打孔器分別取新鮮活化5 d的鐮孢菌菌餅接種到上述培養(yǎng)基中心，25℃培養(yǎng)，分別于5 d和10 d采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算不同濃度大蒜鱗莖浸提液對(duì)花生根腐病3種鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

1.2.3 大蒜鱗莖浸提液對(duì)3種鐮孢菌產(chǎn)孢量的影響 將母液按照20%、10%、5%的體積比分別加入PDB液體培養(yǎng)基中，采用直徑為6 mm的打孔器每處理分別取新鮮活化5 d的鐮孢菌菌餅2個(gè)，置于上述不同濃度的PDB（5 mL）中，25℃搖床培養(yǎng)3 d。濾布過濾掉菌絲后獲得孢子懸浮液，稀釋100倍后，采用血球計(jì)數(shù)板顯微鏡下統(tǒng)計(jì)分生孢子數(shù)，至少統(tǒng)計(jì)3次。以不加大蒜浸提液的PDB為對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置3管，試驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.4 大蒜鱗莖浸提液對(duì)3種鐮孢菌孢子萌發(fā)的影響 按照1.2.3的方法獲得非處理的孢子懸浮液。低轉(zhuǎn)速離心后棄培養(yǎng)液，加入ddH2O重懸，再離心，重復(fù)3次，獲得孢子懸浮液，孢子濃度稀釋為105個(gè)／mL。將母液按照20%、10%、5%的體積比分別加入孢子懸浮液中，混勻后分別滴在玻片上，25℃靜置4 h后，顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況并計(jì)算孢子萌發(fā)率。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 大蒜鱗莖浸提液對(duì)花生根腐病的防治效果 選取培養(yǎng)10 d、大小一致的健康花生苗，每10株為一個(gè)處理，每種鐮孢菌4個(gè)處理（0、0.02、0.04、0.08 g／mL大蒜鱗莖浸提液）。盆栽花生苗根部加孢子懸浮液5 mL（107個(gè)／mL）和布滿菌絲的燕麥粒20粒，保濕培養(yǎng)24 h后，澆灌不同濃度大蒜鱗莖浸提液，20 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照李迎賓等［12］：0級(jí)，健康，無癥狀；1級(jí)，腐爛僅發(fā)生在根表面，腐爛面積≤10%，或腐爛已擴(kuò)展至內(nèi)部且腐爛面積≤10%；2級(jí)，腐爛已擴(kuò)展至內(nèi)部且腐爛面積為10%～40%，支須根無腐爛；3級(jí)，腐爛已擴(kuò)展至內(nèi)部且腐爛面積為40%～50%，支須根腐爛；4級(jí)，腐爛已擴(kuò)展至內(nèi)部且腐爛面積為50%～70%，支須根腐爛脫落；5級(jí)，腐爛已擴(kuò)展至內(nèi)部且腐爛面積＞70%直至整個(gè)塊根完全腐爛，支須根腐爛或整株萎蔫、倒伏或死亡。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用Canvas軟件和Microsoft office PowerPoint作圖，并用新復(fù)極差法（Duncan’s法）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜鱗莖浸提液對(duì)鐮孢菌菌絲的抑制作用

由圖1可知，大蒜鱗莖浸提液相同質(zhì)量濃度時(shí)，尖孢鐮孢菌和層出鐮孢菌的菌絲生長(zhǎng)更慢，受到的抑制作用更明顯；同一鐮孢菌的菌絲生長(zhǎng)與大蒜鱗莖浸提液質(zhì)量濃度成反比，濃度越高，菌絲生長(zhǎng)的抑制作用越明顯。生長(zhǎng)5 d時(shí)，浸提液濃度0.08 g／mL，對(duì)尖孢鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)98.31%，第10 d時(shí)抑制率為82.94%；在0.02 g／mL時(shí)，第5 d對(duì)層出鐮孢菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到56.08%，第10 d時(shí)仍保持在50%以上；茄腐鐮孢菌對(duì)大蒜鱗莖浸提液的敏感度相對(duì)較弱，即使在高濃度下抑制率也低于50%。表明大蒜鱗莖浸提液對(duì)3種鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用，層出鐮孢菌對(duì)低濃度（0.02 g／mL）大蒜鱗莖浸提液敏感，尖孢鐮孢菌對(duì)高濃度（0.08 g／mL）大蒜鱗莖浸提液敏感，而茄腐鐮孢菌對(duì)大蒜鱗莖浸提液的敏感度相對(duì)較弱。

圖1 大蒜鱗莖浸提液對(duì)鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 大蒜鱗莖浸提液對(duì)鐮孢菌產(chǎn)孢量的影響

結(jié)果（表1）表明，3個(gè)濃度大蒜鱗莖浸提液對(duì)鐮孢菌產(chǎn)生分生孢子數(shù)量具有顯著影響，產(chǎn)孢量隨大蒜鱗莖浸提液濃度的提高而減少，但3個(gè)濃度之間差異不顯著。在低濃度（0.02 g／mL）條件下，層出鐮孢菌產(chǎn)孢量減少94.25%，茄腐鐮孢菌產(chǎn)孢量減少72.35%，尖孢鐮孢菌產(chǎn)孢量減少64.77%。

表1 大蒜鱗莖浸提液對(duì)鐮孢菌產(chǎn)孢量的影響

2.3 大蒜鱗莖浸提液對(duì)鐮孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用

由表2可知，隨著大蒜鱗莖浸提液質(zhì)量濃度的提高，鐮孢菌孢子萌發(fā)率逐漸降低。低濃度（0.02 g／mL）即對(duì)尖孢鐮孢菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對(duì)層出鐮孢菌的抑制作用相對(duì)弱些；不同濃度對(duì)茄腐鐮孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用差異顯著。大蒜鱗莖浸提液對(duì)鐮孢菌孢子萌發(fā)的抑制效果表現(xiàn)為尖孢鐮孢菌＞茄腐鐮孢菌＞層出鐮孢菌。

表2 大蒜鱗莖浸提液對(duì)鐮孢菌孢子萌發(fā)率的影響

2.4 大蒜鱗莖浸提液對(duì)花生根腐病的防病效果

結(jié)果（圖2）表明，隨著大蒜鱗莖浸提液質(zhì)量濃度的增加，對(duì)花生根腐病的防病效果增強(qiáng)，病情指數(shù)下降。但不同鐮孢菌之間存在差異，對(duì)尖孢鐮孢菌與層出鐮孢菌的防病效果在0～0.04 g／mL范圍內(nèi)緩慢增加，0.04～0.08 g／mL范圍內(nèi)顯著增強(qiáng)，0.08 g／mL時(shí)防病效果大于50%；對(duì)茄腐鐮孢菌的防治效果不明顯，與室內(nèi)的抑菌試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 大蒜鱗莖浸提液對(duì)花生根腐病的防治效果

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)通過室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，大蒜鱗莖浸提液對(duì)花生根腐病3種鐮孢菌的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和萌發(fā)均有不同程度的抑制作用。大蒜鱗莖浸提液對(duì)尖孢鐮孢菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用顯著，對(duì)層出鐮孢菌主要抑制其菌絲生長(zhǎng)和孢子的產(chǎn)生，對(duì)茄腐鐮孢菌的孢子產(chǎn)生及萌發(fā)有一定的抑制作用。室內(nèi)盆栽花生根腐病的防病效果表明隨著大蒜鱗莖浸提液濃度增加防病效果增強(qiáng)。

大蒜素是從大蒜中提取的植物源抗生素，具有抑制植物病原細(xì)菌和真菌的特性［13］。王繼強(qiáng)等［14］對(duì)大蒜素的作用機(jī)理進(jìn)行了研究，顯示大蒜素并不是天然存在于鱗莖中，而是當(dāng)其受到機(jī)械破碎后，大蒜素的前體蒜酶被激活，催化分解蒜氨酸，生成具有揮發(fā)性的大蒜素。祁高展等［15］研究表明，大蒜鱗莖浸提液主要活性成分有二烯丙基二硫化物（DADS）、二烯丙基三硫化物（DATS）、二甲基二硫醚（DMDS）、苯甲酸乙酯（ELB）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和二烯丙基一硫化物（DAS）。無論是大蒜素還是大蒜鱗莖浸提液，發(fā)揮抑菌活性的作用機(jī)理可能是通過氧化巰基，使與微生物生長(zhǎng)繁殖相關(guān)的含硫巰基的酶失活，抑制乙酰輔酶A，從而影響微生物生長(zhǎng)繁殖，起到抑制或殺死病原菌的作用［13，16，17］。

花生根腐病鐮孢菌通過菌絲和孢子侵染花生。大蒜鱗莖浸提液可以有效抑制菌絲的生長(zhǎng)、減少孢子的產(chǎn)生以及抑制孢子的萌發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)花生根腐病的防治。雖然室內(nèi)盆栽防病試驗(yàn)對(duì)茄腐鐮孢菌的防治效果不明顯，但是茄腐鐮孢菌的致病力相對(duì)較弱，不是優(yōu)勢(shì)病原菌，對(duì)花生的危害作用小。本試驗(yàn)表明，大蒜鱗莖浸提液對(duì)3種鐮孢菌的防治效果較明顯，高濃度下能夠顯著抑制優(yōu)勢(shì)菌群，減少根腐病病情指數(shù)。植物源農(nóng)藥具有生態(tài)友好、可生物降解和目標(biāo)特異性等特點(diǎn)［18，19］，為病蟲害的綠色防控提供了新思路。大蒜來源廣泛，價(jià)格低廉，便于貯藏。本研究結(jié)論可為大蒜與花生輪作或種植花生前將大蒜鱗莖粉碎后耕入田地用于花生根腐病的預(yù)防以及澆灌大蒜鱗莖浸提液防治花生根腐病等無公害、簡(jiǎn)易防病技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。