腦鐵沉積動物模型的研究進展

黃一羚,羅嘉強,彭鵬

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科, 南寧 530021)

鐵是大腦中含量最豐富的微量金屬元素之一。與所有細(xì)胞一樣,神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞在其生理學(xué)的許多方面都需要鐵,包括電子傳遞、還原型輔酶II(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)活性、軸突髓鞘形成,以及作為參與神經(jīng)遞質(zhì)合成的幾種酶的輔助因子[1]。正常情況下,機體內(nèi)鐵主要來源于膳食以及從衰老紅細(xì)胞中回收[2],由于人體缺乏排泄過多鐵的機制,使得腦鐵濃度隨著年齡逐漸增加(生理性)。

研究表明某些血液病或神經(jīng)退行性疾病的患者大腦存在鐵沉積,如地中海貧血[3-4]、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、Friedreich共濟失調(diào)癥、神經(jīng)鐵蛋白病、多發(fā)性硬化、亨廷頓病(Huntington disease,HD)等[5-7]。但到目前為止,腦鐵沉積定量的準(zhǔn)確性、鐵沉積引起腦功能紊亂的原因及發(fā)病機制尚不十分明確,臨床對這類疾病尚無有效治愈手段。因此,建立腦鐵沉積動物模型是解決以上問題不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

1 腦鐵沉積的機制

正常情況下,哺乳動物大腦中的鐵穩(wěn)態(tài)受到嚴(yán)格調(diào)節(jié),它依賴于血—腦脊液屏障(blood-brain barrier,BBB)和許多參與血液循環(huán)鐵運輸?shù)姆肿覽8]。目前,鐵如何通過血腦屏障尚不十分清楚,但有研究表明,轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin/transferrin receptor,Tf/TfR)途徑是鐵跨越腦毛細(xì)血管內(nèi)皮管腔膜的主要途徑[9],當(dāng)鐵通過血腦屏障后,經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(transferrin-bound iron,Tf-Fe)和非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(non-transferrinboundiron,NTBI)兩種轉(zhuǎn)運形式被腦細(xì)胞攝取[10]。

由于每天從飲食中攝入的鐵量(1 ~ 2 mg)相當(dāng)于通過消化、皮膚和尿路等排出的鐵量[11],且體內(nèi)紅細(xì)胞衰老和破壞不斷釋放鐵,因此,隨著年齡的增長,鐵逐漸在大腦中沉積,尤其是在皮質(zhì)、蒼白球、紅核、齒狀核、尾狀核和黑質(zhì)中[7,12]。在腦鐵沉積疾病中,不同疾病的鐵沉積方式可能不同,如帕金森病可能與DMT1表達(dá)增加[13-14]、乳鐵蛋白受體(LfR)表達(dá)增加[15]有關(guān);多發(fā)性硬化癥可能與炎癥過程[16]有關(guān);而鐵蛋白病可能與鐵蛋白輕鏈基因突變[17-19]有關(guān)。

大量證據(jù)表明PD患者幾種鐵轉(zhuǎn)運蛋白的失調(diào)(負(fù)責(zé)鐵的流入/吸收或流出/釋放)導(dǎo)致異常鐵沉積[20]。有研究報道,PD患者黑質(zhì)中二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1(recombinant divalent metal transporter 1,DMT1)[13-14]和腦內(nèi)乳鐵蛋白受體(lactoferrin receptor,LfR)[21]表達(dá)增加促進了神經(jīng)元內(nèi)鐵沉積以及黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元變性。此外,PD患者血腦血管系統(tǒng)中LfR表達(dá)增高,可能與PD患者血腦屏障的改變有關(guān)[21]。在生理條件下,過氧化-抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)[22]。當(dāng)腦內(nèi)發(fā)生鐵沉積,過多的游離鐵誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,可導(dǎo)致神經(jīng)元過氧化損傷、變性甚至死亡,這是誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病的重要原因之一[5]。

2 腦鐵沉積動物模型的建立

2.1 實驗動物選擇

動物與人類不同,有些可以排出體內(nèi)過多的鐵,因此選擇的實驗動物應(yīng)與人體生理機制類似,同時遵循3R原則。由于人類和其他哺乳動物缺乏控制鐵排泄的機制[23],故在建立腦鐵沉積模型時,鼠、恒河猴模型均有報道,但研究者采用鼠模型較為多見。由于建立模型方法不同,鼠的品種選擇往往不一。

如在應(yīng)用腹腔注射鐵劑或羰基鐵飲食時,研究者使用SD大鼠[1,24]、ICR小鼠[25]較多,原因可能是SD大鼠與ICR小鼠屬于封閉群,具有類似于人類群體遺傳異質(zhì)性遺傳組成,在人類遺傳研究、藥物篩選和毒性實驗等方面起著不可替代的作用[26]。此外,SD大鼠還具有對疾病抵抗力強的特點,在藥理學(xué)研究如藥物排泄速率、蓄積傾向等方面應(yīng)用廣泛[27]。而使用基因敲除法時,研究者多采用C57BL/6小鼠[28-30],原因可能是C57BL/6小鼠屬于近交系,具有基因純合、遺傳穩(wěn)定、表現(xiàn)型均一[27]等特性。

2.2 鐵劑選擇

在目前鐵沉積模型研究中,注射用鐵劑有:右旋糖酐鐵、超微超順磁性氧化鐵納米顆粒(ultramicro superparamagnetic iron oxide nanoparticle,USPIO)、蔗糖鐵等。與蔗糖鐵比,右旋糖酐鐵穩(wěn)定性較好,但氧化應(yīng)激水平較高[31]。此外,右旋糖酐鐵還具有低毒性和肌肉吸收方面性質(zhì)獨特的特點[32]。

據(jù)文獻報道,在建立腦鐵沉積模型時,Gong等[1]、趙晉英等[25]多采用右旋糖酐鐵。也有研究者應(yīng)用蔗糖鐵建立鐵過載大鼠模型,但在該研究中實驗組大鼠腦組織中并未發(fā)現(xiàn)鐵沉積,故而推測鐵-蔗糖復(fù)合物無法穿透血腦屏障[33]。蔗糖鐵雖然在腦鐵沉積模型建立方面應(yīng)用較少,但也有其獨特之處。Italia等[32]對BALB/c小鼠腹腔注射蔗糖鐵,研究表明這種給藥方式與β地中海貧血患者的輸血鐵超載途徑非常相似。USPIO是水動力學(xué)粒徑小于40 nm[34]的超順磁性氧化鐵納米粒子。Fujiwara等[35]發(fā)現(xiàn)USPIO也可應(yīng)用于腦鐵沉積模型的建立中。但由于其顆粒小,可通過毛細(xì)血管壁、血漿半衰期長等特點,更多應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的診斷、治療、藥物運輸及探測等方面。因此,在建立不同疾病動物模型時,可根據(jù)實際需要選擇最適合的鐵劑以更符合疾病的發(fā)病機制。

2.3 腦鐵沉積模型建立方法

2.3.1 注射鐵劑法

腹腔[1,25]或肌肉[36-38]注射鐵劑是建立鐵沉積動物模型的主要方法,具有操作簡單、成功率高等優(yōu)點。此外,還有較為少用的靜脈注射法。但在建立動物腦鐵沉積模型時,由于研究者普遍采用鼠模型,故更偏向于采用腹腔注射。其原因可能有以下幾點:(1)肌肉注射相對于腹腔注射,吸收速度較慢;(2)肌肉注射可能會引起注射部位肌肉痙攣或壞死;(3)靜脈注射操作困難,鐵劑生物利用度高,容易造成肝、心臟鐵過載導(dǎo)致實驗動物死亡。

有研究通過給SD大鼠每隔1 d腹腔注射右旋糖酐鐵100 mg,共注射3 d,每只大鼠共注射300 mg鐵[1]。經(jīng)原子吸收分光光度計測量總鐵表明,鐵過載組大鼠大腦中皮質(zhì)、紋狀體、黑質(zhì)、海馬4個部位的鐵含量顯著增加,病理檢查也得出了類似的結(jié)果。趙晉英等[25]通過給小鼠腹膜腔注射右旋糖酐鐵每次10 mg,隔日注射1次,共28 d,結(jié)果顯示鐵過載小鼠大腦紋狀體、脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞、軟腦膜和腦血管鐵染色明顯增強。Fujiwara等[35]給恒河猴靜脈注射USPIO造影劑4次(每15 min 2.5 mg/kg),累計劑量為10 mg/kg,結(jié)果顯示黑質(zhì)、蒼白球、丘腦、皮層鐵含量顯著增加。

2.3.2 羰基鐵飲食法

羰基鐵飲食法是給實驗動物喂養(yǎng)含有一定量羰基鐵的飼料造成腦鐵過載。雖然該方法操作簡單、動物死亡率低,但對于建立腦鐵沉積動物模型來說,造模周期較長。

據(jù)文獻報道,羰基鐵飲食法一般多用于肝鐵沉積動物模型的建立,在腦鐵沉積模型中應(yīng)用較少。Chang等[24]在建立腦鐵過載模型時將大鼠分成3組,對照組喂食基礎(chǔ)純凈膳食(含鐵60 mg/kg)、高鐵組喂食添加2.5%羰基鐵的基礎(chǔ)純凈膳食、低鐵組喂食低鐵純凈膳食(含鐵10 mg/kg),共6周。結(jié)果顯示在皮質(zhì)、海馬、紋狀體和黑質(zhì)4個腦區(qū)中,與對照組相比,低鐵組大鼠腦鐵濃度顯著降低,高鐵組大鼠鐵濃度明顯升高。

由于腸道從食物中吸收的鐵較少,因此在建立腦鐵沉積動物模型的方法中,采用羰基鐵飲食方法相對于注射的鐵劑的方法成模過程非常緩慢。為了造模成功,建議研究者在進行造模時應(yīng)設(shè)立多個鐵濃度的羰基鐵飲食,在保證實驗動物不因肝、心臟等器官發(fā)生嚴(yán)重鐵過載導(dǎo)致死亡的前提下,選擇最佳的羰基鐵飲食,并合理延長造模時間,使目標(biāo)器官出現(xiàn)鐵過載。

2.3.3 基因敲除法

基因敲除法是將Cp、Heph、IRP2等與鐵代謝相關(guān)基因敲除,使體內(nèi)鐵代謝紊亂從而得到腦鐵沉積模型的方法。該方法實驗操作復(fù)雜,技術(shù)要求及動物死亡率高,多用于研究某些特定基因。

如Jiang等[28]為研究亞鐵氧化酶(Heph)和銅藍(lán)蛋白(CP)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)鐵代謝和體內(nèi)鐵平衡中的作用,選取亞鐵氧化酶基因敲除(Heph-KO)、銅藍(lán)蛋白基因敲除(Cp-KO)小鼠和野生型(wild type,WT)小鼠進行實驗,測量3個不同年齡組Heph-KO、Cp-KO和WT小鼠的大腦鐵濃度。研究結(jié)果顯示,在4周齡和8周齡的幼鼠中,所檢查的大腦區(qū)域鐵濃度沒有顯著差異,而在6 ~ 7個月大時,與WT和Cp-KO組小鼠相比,Heph-KO組小鼠的皮質(zhì)、海馬、腦干和小腦中的鐵濃度顯著升高,表現(xiàn)出鐵蓄積,同時鐵蛋白水平也增加。這表明在Heph-KO小鼠的大腦中,鐵會隨著年齡的增長而增加且更易發(fā)生腦鐵過載。此外,還有研究表明與單獨敲除Cp或Heph基因相比,同時敲除小鼠的Cp和Heph基因會使小鼠的腦鐵積累加速,且具有顯著鐵積累的區(qū)域為黑質(zhì)(substantianigra,SN)和小腦[29]。

在研究帕金森的發(fā)病原因時,Ci等[30]使用了IRP2基因敲除的小鼠進行實驗,研究結(jié)果表明與WT小鼠相比,IRP2基因缺失誘導(dǎo)了黑質(zhì)中的鐵積累,并加劇了神經(jīng)元凋亡和帕金森病癥狀。

地中海貧血是一種由于β-珠蛋白生成障礙導(dǎo)致血紅蛋白生成減少的遺傳溶血性疾病,在建立地中海貧血腦鐵沉積動物模型時,Yatmark等[39]將小鼠β-珠蛋白基因敲除,使小鼠出現(xiàn)與人類地中海貧血相似的病理和臨床癥狀,隨后對小鼠腹腔注射每只20 mg右旋糖酐鐵,為期5 d,總鐵劑量為100 mg。研究結(jié)果顯示,與對照組相比,鐵超載組小鼠腦鐵濃度明顯增加。

由此可知,在建立不同疾病所致腦鐵沉積模型時,應(yīng)根據(jù)需要敲除不同基因,使動物模型的表現(xiàn)與人類疾病更加相符,從而更有利于某一特定疾病的研究。

3 腦鐵沉積模型的應(yīng)用

3.1 鐵代謝相關(guān)分子與基因的研究

研究者建立腦鐵沉積模型多用于探討與鐵代謝有關(guān)的分子與基因,如鐵調(diào)素、Cp、Heph、IRP2等。Gong等[1]利用大鼠腦鐵沉積模型證實鐵調(diào)素可防止大腦中的鐵積累及鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,推測鐵調(diào)素可能在阻斷神經(jīng)退行性疾病病理過程中具有巨大潛力。Jiang等[28]證實,在6 ~ 7個月時,與WT和Cp-KO組小鼠比,Heph-KO組小鼠的皮質(zhì)、海馬、腦干和小腦中的鐵濃度顯著升高,表現(xiàn)出鐵蓄積,同時鐵蛋白水平也增加,而Cp KO小鼠在12個月時,大腦鐵的積累才會隨著年齡的增長而增加。

3.2 腦鐵沉積疾病及定量方法的研究

準(zhǔn)確定量腦鐵沉積對于腦鐵沉積疾病診斷及治療至關(guān)重要。在研究IRP2基因敲除引起的鐵超載對帕金森病癥狀的影響時,Ci等[30]發(fā)現(xiàn)小鼠IRP2基因敲除可以導(dǎo)致黑質(zhì)鐵超載和星形膠質(zhì)細(xì)胞鐵代謝改變,從而引起帕金森氏癥狀加重。Yatmark等[39]建立β型地中海貧血小鼠腦鐵超載模型并結(jié)合磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)檢查,研究結(jié)果顯示與對照組相比鐵超載小鼠大腦T2*值下降,并且病理證實存在鐵沉積,從而證實MRI技術(shù)和T2*值對鐵積累檢測的有用性。Fujiwara等[35]則證實彌散MRI對組織中鐵沉積很敏感,可以用來量化鐵。

4 總結(jié)與展望

建立腦鐵沉積模型時,根據(jù)疾病種類、研究目的,研究者選擇的動物品種、造模方法、鐵劑劑量往往不一(見表1)。對于動物品種的選擇,腹腔注射或羰基鐵飲食法多選擇SD大鼠或ICR小鼠,而基因敲除多選擇C57BL/6小鼠。由于動物品種不一,鐵劑耐受程度不同,為避免實驗過程中因劑量問題導(dǎo)致動物死亡,注射鐵劑應(yīng)在預(yù)實驗期間設(shè)立多個劑量梯度,尋找最合適的劑量。羰基鐵飲食法由于經(jīng)腸道吸收,鐵在腦內(nèi)沉積的過程又非常緩慢,目前研究者多采用2.5%或3%羰基鐵飲食進行造模。無論是注射鐵劑還是羰基鐵飲食,在造模過程中都可根據(jù)需要適當(dāng)延長造模周期,以達(dá)到最佳效果。

表1 鐵沉積動物模型Table 1 Animal model of iron deposition

目前,腦內(nèi)鐵沉積的診斷多依賴于MRI定量技術(shù),但定量的準(zhǔn)確性尚不十分明確。腦鐵沉積動物模型的建立不僅能了解腦鐵沉積引起的疾病發(fā)病機理、研究有效治愈手段,還有望進一步提高MRI定量腦鐵沉積的準(zhǔn)確性。