Mdr2基因敲除小鼠建立原發(fā)性肝癌模型觀察

李萌,平鍵,3*,徐列明,3

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院,上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學肝病研究所,上海 201203;3.肝腎疾病病證教育部重點實驗室,上海 201203)

原發(fā)性肝癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,不僅嚴重威脅人民生命健康,也為醫(yī)療資源帶來重大負擔。據統(tǒng)計,肝癌在2020年全球新發(fā)癌癥疾病譜中排名第七位,在癌癥致死人數(shù)中占第三位[1]。原發(fā)性肝癌包括兩種主要的組織學類型:肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC),其中ICC約占原發(fā)性肝癌的15%[2-3]。研究肝癌發(fā)病的機制既是重點也是難點,而選擇適宜的原發(fā)性肝癌動物模型則是肝癌機制研究的必要條件。

Mdr2(multidrug resistance protein2,Mdr2)基因,又名ATP-結合盒B亞家族成員4(ATP-binding cassette subfamily B member 4,Abcb4),其編碼的Mdr2蛋白作為一種脂質轉運蛋白,能夠將膽汁中磷脂的主要成分——磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)從肝毛細膽管膜的內側轉移到外側[2]。小鼠Mdr2基因敲除后,PC無法通過Mdr2蛋白被分泌到膽汁中,從而造成膽汁中磷脂的缺乏[4]。磷脂缺乏時,膽鹽和膽固醇無法與之形成混合膠束,造成膽鹽游離,引起膽管細胞損傷并導致膽汁淤積[4-5]。

文獻報道顯示,小鼠Mdr2基因敲除后表現(xiàn)為肝內外膽管的狹窄和狹窄所致的節(jié)段性擴張、“洋蔥皮樣”膽管周圍纖維化和膽管局部性增生,并且隨時間推進,逐漸發(fā)展為肝纖維化、肝硬化,甚至肝癌[6]。因其肝形態(tài)學變化與人類原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)相似,Mdr2-/-小鼠也是目前最常用的PSC轉基因動物模型[7]。已有學者使用Mdr2-/-小鼠進行肝癌機制研究,但不同遺傳背景的Mdr2-/-小鼠肝癌發(fā)生時間存在一定差異。為此,本文觀察了C57BL/6背景Mdr2-/-小鼠原發(fā)性肝癌的發(fā)生時間及發(fā)生率,并對其組織學類型進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

9只SPF級Mdr2基因敲除小鼠C57BL/6-Abcb4tm1,包括雌6只、雄3只,(11.3 ± 4.2)周齡,約22 g。同周齡及體重的SPF級野生型小鼠C57BL/6野生型小鼠5只(雌3只,雄2只)亦購自蘇州賽業(yè)實驗動物技術有限公司【SCXK(蘇)2018-0003】。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心【SYXK(滬)2020-0009】,普通飼料飲食,自由飲水,相對濕度(55 ± 5)%,溫度25℃,光照遵循晝夜節(jié)律。本實驗通過上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心和實驗動物倫理委員會批準(PZSHUTCM190524006),并且嚴格遵守實驗動物使用的3R原則。

由蘇州賽業(yè)實驗動物技術有限公司采用CRISPR/Cas9技術構建并采用PCR和產物測序進行鑒定。Abcb4基因位于小鼠第5號染色體上(NCBI參考序列:NM_008830),共鑒定出28個外顯子,選擇第3 ~ 4外顯子作為目標位點,設計gRNA(gRNA1∶5’-TACCAAGGGCGGTACCTTCAAGG-3’;gRNA2∶5’-GCTCCTTACCACAATGGTACTGG-3’)將此段基因進行剪切(見圖1A)。產生的小鼠進行PCR擴增驗證(引物F2∶5’-CTTTGCAGCTAAATA AAGTGGGAC-3’,引物R1∶5’-TCCACCCTAGACC CTTATTGTCTC-3’),然后對PCR產物進行測序,分析測序結果,確認基因型(見圖1B)。通過雜合子互配進行擴增繁殖,并采用PCR(引物F1∶5’-TGTCATCTGGCAATTTAGGCTG-3’,引物R1∶5’-TCCACCCTAGACCCTTATTGTCTC-3’,612 bp;引物F2∶5’-CTTTGCAGCTAAATAAAGTGGGAC-3’,引物R1∶5’-TCCACCCTAGACCCTTATTGTCTC-3’,652 bp;純合子小鼠僅在612 bp處出現(xiàn)條帶)篩選出純合子小鼠用于實驗(見圖1C),其反應條件為:94℃ 3 min,(94℃ 30 s,60℃ 35 s,72℃ 35 s)× 35循環(huán),72℃ 5 min。

圖1 Mdr2-/-小鼠構建原理與鑒定Note. A. gRNA cleaves the exon 3 ~ 4 region of Mdr2 gene. B. Sequencing showed that the 4751 bp sequence in the target region had been knocked out. C. PCR identifies mice as homozygous. 30, 31. Mouse number. M. Marker. WT. Wild type control. Water. Water control.Figure 1 Construction principle and identification of Mdr2-/- mice

1.1.2 主要試劑與儀器

丙氨酸氨基轉移酶(laninne aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒,均為南京建成科技有限公司產品;甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)檢測試劑盒為酶聯(lián)生物公司產品;細胞角蛋白7(cytokeratin-7,CK-7)I抗購自Abcam公司;細胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK-19)I抗購自proteintech公司;通用二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒,均購自中杉金橋公司;山羊血清為上海碧云天生物技術有限公司產品。LEICA ASP300自動脫水機、LEICA EG1160石蠟包埋機、轉輪切片機RM2035、HI1220烤片機、均為德國Leica公司產品。M5多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司產品。

1.2 方法

1.2.1 血清采集及肝大體觀察

小鼠飼養(yǎng)65周后,以20%烏拉坦腹腔注射麻醉,腹主動脈采血,室溫靜置1 h,以4℃、3000 r/min離心15 min并收取血清。摘取肝后觀察其腫瘤發(fā)生情況并拍照,留取約0.5 × 0.5 × 0.3 cm3大小肝組織、腫瘤及腫瘤旁組織標本,予10%甲醛固定。

1.2.2 血清ALT、AST檢測

按照試劑盒說明檢測血清ALT、AST。

1.2.3 血清AFP檢測

采用ELISA法檢測小鼠血清AFP。按照說明書每樣本孔加入血清50 μL,同時設標準品孔、空白孔。各孔中加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體工作液100 μL,37℃孵育60 min,棄去液體,每孔加入350 μL洗滌液,靜置1 min后吸棄,重復5次。每孔再加入底物A、B液50 μL,37℃避光孵育15 min后加入50 μL終止液,于450 nm波長處測定OD值并計算各樣本濃度值。

1.2.4 肝組織病理學觀察

將留取的肝組織標本10%甲醛固定48 h后逐級脫水、石蠟包埋,切取4 μm切片。石蠟切片脫蠟至水后進行蘇木精-伊紅(HE)染色、天狼猩紅染色并在光學顯微鏡下觀察照像。

免疫組化染色:將石蠟切片脫蠟至水后置入檸檬酸鹽修復液(pH = 6.0)中沸煮30 min進行抗原修復,內源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min、10%山羊血清封閉0.5 h。分別滴加CK-7(1 : 8000)或CK-19(1 : 1000)一抗過夜,洗片后,滴加山羊抗小鼠/兔二抗,孵育0.5 h,洗片后,加入DAB顯色液顯色,以蘇木素染色液復染后封片觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩組小鼠肝大體觀察比較

小鼠飼養(yǎng)65周后取其肝進行觀察。正常組小鼠肝形態(tài)均正常,色澤紅潤,質地柔軟,表面光滑無腫塊。9只Mdr2-/-小鼠肝表面均可見腫瘤結節(jié),數(shù)量不等,形態(tài)不一,其余肝組織質地柔韌,各肝葉間偶有黏連(見圖2)。

圖2 Mdr2-/-小鼠肝腫瘤形態(tài)Figure 2 Morphology of liver tumors in Mdr2-/- mice

2.2 兩組小鼠肝組織HE及天狼猩紅染色觀察比較

肝組織HE染色顯示:野生型小鼠肝小葉結構清晰,肝細胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列,無變性壞死,肝竇未見狹窄或擴張。Mdr2-/-小鼠肝癌旁組織HE染色顯示,肝小葉結構紊亂,匯管區(qū)明顯擴大,可見淋巴細胞、單核細胞等炎性細胞浸潤。肝腫瘤組織HE染色顯示,腫瘤細胞大小不一,細胞形態(tài)不規(guī)則,排列結構無序,細胞核形態(tài)多樣或消失(見圖3)。

天狼猩紅染色觀察:野生型小鼠僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁見少量膠原纖維。Mdr2-/-小鼠肝癌旁組織內則膠原增生明顯,匯管區(qū)有大量膠原纖維形成并向小葉內伸展;肝腫瘤組織天狼猩紅染色顯示,肝腫瘤內部無明顯膠原纖維,而在腫瘤邊緣有明顯的膠原組織包繞(見圖3)。

2.3 兩組小鼠血清ALT、AST、AFP水平比較

與野生型小鼠相比,Mdr2-/-小鼠的血清ALT和AST活性均顯著升高(P< 0.01,見表1)。ELISA法檢測兩組小鼠血清AFP水平,結果顯示Mdr2-/-小鼠血清AFP水平較野生型小鼠顯著升高(P< 0.01,見表1)。

表1 兩組小鼠血清ALT、AST、AFP水平( ± s)Table 1 Serum ALT、AST、AFP levels of two groups of mice( s)

表1 兩組小鼠血清ALT、AST、AFP水平( ± s)Table 1 Serum ALT、AST、AFP levels of two groups of mice( s)

注:與正常組比較,**P < 0.01。Note. Compared with the normal group,**P < 0.01.

2.4 兩組小鼠肝組織CK-7、CK-19染色觀察比較

免疫組化結果顯示正常組CK-7、CK-19陽性細胞多分布于匯管區(qū),形態(tài)規(guī)則呈小管狀,提示膽管細胞排列規(guī)則,未見膽管增生或缺失。Mdr2-/-小鼠肝癌旁組織CK-7、CK-19陽性細胞數(shù)量明顯增加,且多聚集于匯管區(qū),有大量結締組織包繞,提示Mdr2-/-小鼠肝有明顯的膽管增生。而在腫瘤組織中,多數(shù)樣本中均未見CK-7、CK-19陽性細胞,個別樣本中有散在的CK-7、CK-19陽性細胞單個或小管樣分布,但染色面積均未達到5%(見圖4)。結合鏡下觀察及免疫組化染色結果,所有樣本均被判斷為原發(fā)性肝細胞癌。

圖4 兩組小鼠肝CK-7、CK-19染色結果對比(×100)Figure 4 Comparison of CK-7 and CK-19 staining results in the liver of two groups of mice (×100)

3 討論

目前常見的小鼠原發(fā)性肝癌造模方法有化學誘導法、腫瘤移植法以及采用基因修飾小鼠等。其中化學誘導法多采用硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)或二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)等化學藥物長期給藥,其建立小鼠原發(fā)性肝癌模型的時長多為6 ~ 12個月,誘發(fā)小鼠肝癌的成功率較高[8-9]。但高劑量染毒存在動物死亡率較高的風險,故在染毒劑量、方法和時長等方面還需不斷優(yōu)化,尚未形成較統(tǒng)一的造模方案。腫瘤移植法通常將腫瘤組織或細胞株移植到裸鼠皮下或肝,使其成為荷瘤動物模型,其優(yōu)點是成瘤時間快、造模周期短、易于觀測。但遺憾的是其無法模擬人類腫瘤的形成過程中組織學及微環(huán)境的自然癌變特征[10]。在本實驗中,我們構建了C57BL/6.Mdr2基因敲除小鼠并觀察其自發(fā)形成肝腫瘤情況。所觀察的9只Mdr2-/-小鼠均自發(fā)形成肝腫瘤,觀察期間未見小鼠死亡,且正常飲食無需染毒,避免了實驗操作誤差及接觸有毒化學品的風險。并且,該小鼠腫瘤的形成機制可能與肝細胞持續(xù)存在慢性損傷和炎癥相關,經過長期發(fā)展最終出現(xiàn)肝癌,此過程無需人為干預,與腫瘤發(fā)生的自然特征更為貼近。伴隨基因編輯技術的不斷進步,基于基因修飾造成肝癌的動物模型已逐漸被重視和采用。例如Kim等[11]建立的HBV相關的轉基因肝癌小鼠模型,HBx基因轉入CD1小鼠后,小鼠在8 ~ 10月齡時即出現(xiàn)肝腫瘤結節(jié),并在11 ~ 15個月時大多數(shù)雄性小鼠將死于肝透明細胞癌。而Engelholm等[12]則利用CRISPR/Cas9技術發(fā)現(xiàn)Dnajb1-Prkaca基因融合足以誘導一種多發(fā)于兒童的肝癌——纖維層狀肝細胞癌(fibrolamellar hepatocellular carcinoma,FL-HCC)。本實驗結果顯示,Mdr2-/-小鼠在連續(xù)飼養(yǎng)65周后均發(fā)生了肝腫瘤,此時小鼠的平均月齡為17.5個月,其腫瘤表型為肝細胞癌。

細胞角蛋白(cytokeratin,CK)主要分布于上皮細胞,是角質細胞中的主要骨架蛋白。在正常肝中,膽管上皮細胞主要表達CK-7和CK-19,而正常的成熟肝細胞則不表達,故而CK-7和CK-19對膽管上皮細胞和肝內膽管細胞癌具有特異性染色[13]。本實驗中小鼠肝表現(xiàn)出了膽管細胞增生、管腔寬大畸形等膽管病變,但并未在腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)膽管細胞癌性病變,結合組織病理學觀察及CK-7和CK-19免疫組化結果,判斷該小鼠自發(fā)腫瘤為肝細胞癌。結果表明Mdr2-/-小鼠適宜作為肝細胞癌的研究模型。

盡管Mdr2-/-小鼠肝癌模型具有造模簡便、成瘤率高及死亡率低的特點,但其缺點在于造模周期較長。據報道,基于BALB/c背景的Mdr2敲除小鼠在7月齡時即可觀測到肝癌發(fā)生,其組織學類型為肝細胞癌[6]。本實驗構建了C57BL/6小鼠背景的Mdr2敲除小鼠,在飼養(yǎng)55周時處死的小鼠未觀察到肝腫塊,而在65周觀察到本實驗9只小鼠全部有肝腫塊形成,可能與不同品系小鼠的差異有關。此外,已有研究表明,FVB背景的Mdr2-/-雌性小鼠較雄性疾病進展更快,表現(xiàn)出更嚴重的膽汁淤積和肝纖維化癥狀[14-15]。在本實驗中雌性和雄性小鼠腫瘤最早發(fā)現(xiàn)時間均為71周齡,且血清AFP水平無明顯差異,其原因除了品系差異外,也可能與樣本數(shù)量較少有關。因此進一步探究雌性小鼠是否能更快進展為肝癌,或在Mdr2基因敲除的基礎上聯(lián)用化學藥物干預能否進一步縮短造模時間,這些問題均需要更多的實驗證據觀察驗證。另外,肝癌模型制備的重要用途之一是用于抗癌藥物的研發(fā),該模型是否可用于藥物療效評估,也有待于進一步探索。

總之,本實驗顯示連續(xù)飼養(yǎng)至(76.3 ± 4.2)周齡的C57BL/6.Mdr2-/-小鼠可自發(fā)形成腫瘤,其表型為肝細胞癌,該腫瘤模型的形成特征及應用前景需繼續(xù)深入研究。