有氧運動對尼古丁戒斷小鼠VTA多巴胺神經(jīng)元抑制性突觸傳遞效能的影響

吉春燕,汪澳哲,呂媛媛,趙麗,2,李巖,2*

(1. 北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院,北京 100084;2. 北京體育大學(xué)運動與體質(zhì)健康教育部重點實驗室,北京 100084;3. 北京體育大學(xué)中國運動與健康研究院,北京 100084)

吸煙會增加罹患心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、精神障礙、惡性腫瘤等多種疾病的發(fā)病率,每年導(dǎo)致全球800多萬人死亡,給全世界造成巨大的經(jīng)濟壓力和社會負擔(dān)[1]。煙草依賴的主要原因是尼古丁成癮,其主要特征有:用藥后的欣快感、撤藥后的戒斷癥狀以及對藥物持續(xù)性的強烈渴求[2]。復(fù)吸是治療成癮最大的難題。目前國際平均藥物復(fù)吸率近91%,我國藥物復(fù)吸率為90%[3]。戒斷過程中患者會因為突然缺失藥物出現(xiàn)戒斷癥狀,包括食欲增加、心率降低等軀體癥狀和焦慮、快感缺失、認知障礙和工作記憶障礙等情感癥狀[4]。戒斷癥狀引起的強烈渴求是導(dǎo)致戒煙者復(fù)吸率居高不下的重要原因,探究戒斷期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化,尋找引發(fā)強烈藥物渴求的中樞機制進而降低復(fù)吸率,是治療和控制成癮性疾病的重要策略[5]。

由中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)的多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)元投射至伏隔核(nucleus accumbens,NAc)的獎賞環(huán)路的結(jié)構(gòu)異常和功能紊亂是導(dǎo)致成癮形成和戒斷后復(fù)吸的重要原因[6]。在成癮形成過程中,各類成癮性藥物直接或者間接地增強VTA的多巴胺神經(jīng)元在其下游腦區(qū)的多巴胺釋放,使機體產(chǎn)生強烈的欣快感和正性強化作用從而啟動成癮[7]。在戒斷過程中,VTANAc的多巴胺投射會發(fā)生相反的變化。戒除各種成癮藥物會導(dǎo)致NAc基礎(chǔ)多巴胺的減少[8],從而引起快感缺失等負性情緒反應(yīng)并激發(fā)藥物渴求。多巴胺的釋放受到神經(jīng)元興奮水平的影響,嗎啡、尼古丁戒斷后VTA多巴胺神經(jīng)元放電頻率均出現(xiàn)降低[9],從而使NAc多巴胺末梢釋放的遞質(zhì)減少。多巴胺神經(jīng)元放電的頻率和模式受到γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid,GABA)能抑制性突觸傳入的嚴格調(diào)控[9]。VTA多巴胺神經(jīng)元接受來自局部GABA能中間神經(jīng)元和外部NAc、腹側(cè)蒼白球和腹側(cè)背蓋區(qū)尾側(cè)(the tail of the VTA,tVTA)腦區(qū)的GABA能輸入。關(guān)于抑制性輸入在戒斷期多巴胺神經(jīng)元興奮性變化中的作用機制,有以下3個方面證據(jù)[10-12]:第一,藥物戒斷期,VTA局部興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡,表現(xiàn)為GABA增多而谷氨酸減少;第二,電生理學(xué)研究表明藥物戒斷導(dǎo)致VTA區(qū)多巴胺神經(jīng)元抑制性突觸傳遞效能增強;第三,通過光遺傳等方法減弱VTA區(qū)多巴胺神經(jīng)元的抑制性突觸傳遞效能可以改善成癮模型的戒斷癥狀、減少復(fù)吸。以上諸多證據(jù)表明,藥物戒斷會導(dǎo)致VTA區(qū)多巴胺神經(jīng)元抑制性突觸傳遞效能增強,從而降低多巴胺神經(jīng)元的興奮性,減少NAc多巴胺的釋放,觸發(fā)覓藥行為。由此可見,靶向干預(yù)VTA區(qū)多巴胺神經(jīng)元相關(guān)抑制性投射環(huán)路的傳遞效能是改善戒斷癥狀、減少復(fù)吸的重要策略。

流行病學(xué)及臨床研究證實,運動在藥物成癮的各個階段都具有保護作用。研究表明,戒斷階段進行運動干預(yù)能減輕焦慮、情緒低落、抑郁等負面情緒反應(yīng),緩解戒斷癥狀并減少復(fù)吸[13]。動物研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)60 min的運動2 h后,海馬的多巴胺釋放增加2倍[14]。相關(guān)研究表明,運動緩解負性情緒、改善戒斷癥狀、減少復(fù)吸可能與運動促進多巴胺代謝有關(guān)[15]。但是,目前關(guān)于運動促進成癮戒斷期多巴胺釋放的神經(jīng)生物學(xué)機制尚不明確,尤其是從功能學(xué)的角度探究運動對成癮戒斷期VTA區(qū)多巴胺神經(jīng)元接受的抑制性輸入的影響更未見報道。因此,本研究觀察有氧運動對尼古丁戒斷模型VTA多巴胺神經(jīng)元GABA能輸入的調(diào)節(jié)作用,以期從突觸可塑性的角度為運動減少尼古丁復(fù)吸提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本實驗以8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠為研究對象,共40只,體重約為22 g,實驗動物由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2021-0006】提供。動物房內(nèi)的光照時間由人工控制,白天時間為6:00 ~ 18:00,環(huán)境溫度為22 ~ 24℃,相對濕度維持50% ~ 65%,飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動物房【SYXK(京)2021-0053】。飼養(yǎng)期間,所有小鼠自由攝食及飲水,維持飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。本研究實驗方案已獲得北京體育大學(xué)運動科學(xué)實驗倫理委員會批準(2019031A)。

1.1.2 主要試劑與儀器

尼古丁酒石酸鹽(Tocris Bioscience,美國),CNQX(Sigma,美國),河豚毒素(Sigma,美國),小鼠單克隆谷氨酸脫羧酶67(glutamic acid decarboxylase 67,GAD67)抗體(Millipore,G5419,美國),熒光素Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG(Invitrogen,A-11032,美國)。

條件性位置偏愛行為學(xué)系統(tǒng)(泰盟,CPP-100,中國),動物跑臺(杭州段氏DSPT-215,中國),振動切片機(LEICA,VT1200S,德國),膜片鉗放大器(Axon,700B,美國),數(shù)模模數(shù)轉(zhuǎn)換器(Axon,1440A,美國),膜片鉗數(shù)據(jù)采集分析軟件(Axon,pClamp 10.7,美國),冰凍切片機(LEICA,CM3050S,德國),激光共聚焦顯微鏡(LEICA,SP8,德國)。

1.2 方法

1.2.1 成癮模型建立與運動方案

在適應(yīng)環(huán)境1周后,將小鼠隨機分為生理鹽水+安靜組(saline sedentary組,SS組)、生理鹽水+運動組(saline exercise組,SE組)、尼古丁+安靜戒斷組(nicotine sedentary組,NS組)、尼古丁+運動戒斷組(nicotine exercise組,NE組)。采用條件性位置偏愛實驗(conditioned position preference,CPP)建立小鼠尼古丁成癮模型。CPP實驗由以下環(huán)節(jié)組成[16]:(1)預(yù)測試(第1天):小鼠被允許自由探索黑箱與黑白條紋箱20 min并記錄其在兩側(cè)箱體所停留時間,剔除單側(cè)停留時間> 65%的小鼠。(2)條件化訓(xùn)練(第2 ~ 9天):小鼠接受生理鹽水或尼古丁給藥。在第2、4、6、8天NS、NE組小鼠腹腔注射尼古丁(0.5 mg/kg),放入黑箱20 min;在第3、5、7、9天小鼠腹腔注射等量生理鹽水并放入黑白條紋箱20 min。SS、SE組小鼠每天腹腔注射生理鹽水并放入對側(cè)箱體訓(xùn)練。(3)測試(第10天):允許各組小鼠在兩側(cè)箱體自由探索20 min,記錄小鼠在兩個箱體中的停留時間。之后停止給藥,SE組和NE組小鼠進行連續(xù)2周的運動干預(yù),SS組和NS組小鼠自由進食及飲水不進行運動干預(yù)。(4)后測:2周戒斷后,各組小鼠再次進行CPP測試,方法如測試期,記錄小鼠在兩側(cè)箱體停留時間。CPP得分(s)為小鼠在注射尼古丁訓(xùn)練箱的停留時間減去注射生理鹽水訓(xùn)練箱的停留時間。實驗流程如圖1。

圖1 實驗流程圖Figure 1 Timeline of the experiments

實驗的運動方案:使用跑臺進行運動干預(yù),小鼠運動強度為60% ~ 75%最大攝氧量,訓(xùn)練前10 min跑速為12 m/min,后50 min跑速為15 m/min,跑臺坡度為0°,60 min/d,每周5 d。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)該運動強度具有調(diào)節(jié)突觸可塑性的作用[17],前期研究也發(fā)現(xiàn)65% ~ 70%最大心率的中等強度運動可以有效降低成癮患者的主觀渴求度[18]。

1.2.2 腦片膜片鉗實驗

小鼠麻醉(吸入異氟烷),取腦后振動切片,保留含有VTA的腦片,腦片厚度為250 μm。膽堿切片液配方為:23 mmol/L NaHCO3,2.5 mmol/L KCl,1.25 mmol/L NaH2PO4,0.5 mmol/L CaCl2,7 mmol/L MgSO4,10 mmol/L 葡萄糖,11.6 mmol/L 抗壞血酸鈉,3.1 mmol/L 丙酮酸鈉,110 mmol/L 氯化膽堿,20 mmol/L阿托品。腦片在人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中室溫孵育1 h以上,ACSF配方為:2.5 mmol/L KCl,2.5 mmol/L CaCl2,1.25 mmol/L MgCl2,1.25 mmol/L NaH2PO4,119 mmol/L NaCl,23 mmol/L NaHCO3,10 mmol/L葡萄糖,之后進行腦片膜片鉗記錄。

采用全細胞電壓鉗技術(shù)記錄以下指標:自發(fā)性抑制性突觸后電流(spontaneous inhibitory postsynaptic current,sIPSC)、微小抑制性突觸后電流(miniature inhibitory postsynaptic current,mIPSC)和抑制性突觸后電流(inhibitory postsynaptic current,IPSC)配對脈沖刺激比值(paired-pulse ratio,PPR)。記錄用玻璃微電極內(nèi)充灌電極內(nèi)液,配方為:100 mmol/L K-gluconate,50 mmol/L KCl,2 mmol/L MgCl2,10 mmol/L Hepes,0.2 mmol/L EGTA,2 mmol/L Mg-ATP,0.3 mmol/L Na2GTP,10 mmol/L磷酸肌酸鈉;使用KOH調(diào)節(jié)pH = 7.2 ~ 7.4。記錄誘發(fā)指標時,刺激電極置于多巴胺神經(jīng)元突觸前150 μm左右位置,用兩個連續(xù)刺激誘發(fā)PPR(刺激間隔時間:20,50,100,200,400 ms)。整個記錄過程,將膜電位鉗制在-70 mV,灌流液中加入AMPA受體拮抗劑CNQX(20 μmol/L)阻斷興奮性突觸活動。記錄mIPSC時,灌流液中加入河豚毒素(tetrodotoxin,TTX,1 μmol/L)阻斷動作電位。

1.2.3 免疫熒光染色

小鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉,灌注4%多聚甲醛進行前固定,取腦置于4℃多聚甲醛后固定24 h,蔗糖脫水后,使用冰凍切片機進行冠狀切片,腦片厚度40 μm。切片經(jīng)封閉后加入GAD67抗體(1∶200),4℃孵育48 h,室溫孵育Alexa Fluor 594標記的二抗(1∶600)1 h。使用熒光封片劑(DAPI)封片,激光共聚焦顯微鏡拍照。免疫熒光圖片處理使用Image J軟件進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,實驗結(jié)果以平均值 ± 標準誤差(±)表示。使用Clampfit軟件導(dǎo)出sIPSC和mIPSC,再使用Minianalysis軟件分析平均頻率和平均幅度。使用pClamp 10.7 軟件采集并分析誘發(fā)的突觸后電流數(shù)據(jù)IPSC PPR。使用Image J軟件分析免疫熒光圖片的熒光強度。本研究數(shù)據(jù)在滿足方差齊性檢驗的條件下,進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA),采用Holm-Sidak法進行多重比較。統(tǒng)計學(xué)顯著性水平為P< 0.05。

2 結(jié)果

2.1 有氧運動對尼古丁戒斷小鼠復(fù)吸行為的影響

CPP得分的雙因素方差分析結(jié)果(見圖2)顯示尼古丁戒斷和有氧運動對CPP得分有顯著交互效應(yīng)(P< 0.05)。與SS組相比,NS組得分顯著升高(P< 0.05);與NS組相比,NE組得分顯著降低(P< 0.05)。以上結(jié)果提示,有氧運動改善尼古丁戒斷小鼠的條件性位置偏愛,即有氧運動減少尼古丁成癮小鼠戒斷期的復(fù)吸行為。

圖2 各組小鼠CPP得分Note. A. Timeline of CPP paradigm. B. CPP scores of mice in each group. Compared with the SS group, *P < 0.05. Compared with the NS group, #P < 0.05. (The same in the following figures)Figure 2 CPP score of mice in each group

2.2 有氧運動對尼古丁戒斷小鼠VTA多巴胺神經(jīng)元sIPSC的影響

各組小鼠sIPSC記錄原始圖見圖3A。對sIPSC的平均頻率和平均幅度進行雙因素方差分析(圖3B,3C),結(jié)果顯示尼古丁戒斷和有氧運動的交互效應(yīng)顯著(平均頻率,P< 0.05;平均幅度,P< 0.05)。多重比較結(jié)果顯示,與SS組相比,NS組sIPSC的平均頻率(P< 0.001)和平均幅度(P< 0.01)顯著升高;與NS組相比,NE組sIPSC的平均頻率(P< 0.01)和平均幅度(P< 0.001)顯著降低。以上結(jié)果提示,尼古丁戒斷增強VTA多巴胺神經(jīng)元接受的GABA能輸入;有氧運動使尼古丁戒斷小鼠VTA多巴胺神經(jīng)元接受的GABA能輸入降低。

圖3 各組小鼠VTA多巴胺神經(jīng)元sIPSCNote. A. Representative sIPSC traces recorded by patch clamp. B. The mean frequency of sIPSC in these four groups. C. The mean amplitude of sIPSC in these four groups. Compared with the SS group, **P < 0.01, ***P < 0.001. Compared with the NS group, ##P < 0.01, ###P < 0.001.(The same in the following figures)Figure 3 sIPSC from VTA dopamine neurons of mice in each group

2.3 有氧運動對尼古丁戒斷小鼠VTA多巴胺神經(jīng)元mIPSC的影響

GABA能輸入的變化可能由動作電位驅(qū)動突觸前GABA釋放增加和/或突觸前囊泡隨機釋放增加所致。本研究為探究其可能機制,在人工腦脊液中加入TTX,阻斷動作電位,記錄由突觸前囊泡隨機自發(fā)地釋放GABA所產(chǎn)生的抑制性突觸后電流。各組小鼠mIPSC記錄原始圖見圖4A。對mIPSC的平均頻率和平均幅度進行雙因素方差分析(圖4B,4C),結(jié)果顯示尼古丁戒斷和有氧運動的交互效應(yīng)顯著(平均頻率,P< 0.05;平均幅度,P< 0.05)。

圖4 各組小鼠VTA多巴胺神經(jīng)元mIPSCNote. A. Representative mIPSC traces recorded by patch clamp. B. The mean frequency of mIPSC in these four groups. C.The mean amplitude of mIPSC in these four groups.Figure 4 mIPSC from VTA dopamine neurons of mice in each group

多重比較結(jié)果顯示,與SS組相比,NS組mIPSC的平均頻率(P< 0.05)和平均幅度(P< 0.05)顯著升高;與NS組相比,NE組mIPSC的平均頻率(P< 0.05)和平均幅度(P< 0.05)顯著降低。

sIPSC和mIPSC的結(jié)果提示,尼古丁戒斷導(dǎo)致VTA多巴胺神經(jīng)元突觸前的GABA以動作電位觸發(fā)和隨機自發(fā)的機制釋放增加,突觸后GABAA受體數(shù)量增多和/或功能增強,從而增強抑制性突觸傳遞效能;有氧運動減少尼古丁戒斷小鼠VTA多巴胺神經(jīng)元突觸前動作電位驅(qū)動的GABA釋放和隨機自發(fā)的GABA釋放,下調(diào)突觸后GABAA受體數(shù)量和/或功能,從而減弱抑制性突觸傳遞效能。

2.4 有氧運動對尼古丁戒斷小鼠VTA多巴胺能神經(jīng)元IPSC PPR的影響

由于sIPSC和mIPSC幅度的變化可能導(dǎo)致頻率變化,因此單純通過sIPSC和mIPSC的頻率與幅度判斷抑制性傳遞突觸前和突觸后機制的變化具有一定局限性[19]。為了進一步區(qū)分抑制性突觸傳遞效能的變化是突觸前還是突觸后的效應(yīng),本研究檢測了VTA多巴胺神經(jīng)元的抑制性突觸后電流(IPSC)配對脈沖比(PPR = IPSC2/IPSC1),以此反映多巴胺神經(jīng)元的突觸前抑制性遞質(zhì)釋放概率。各組小鼠誘發(fā)的IPSC記錄原始圖見圖5A。對在20 ms、50 ms、100 ms和200 ms刺激間隔記錄的IPSC PPR分別進行雙因素方差分析,結(jié)果顯示在20 ms(圖5B)和50 ms(圖5C)刺激間隔時,尼古丁戒斷和有氧運動的交互效應(yīng)顯著(20 ms,P< 0.05;50 ms,P< 0.05);在100 ms和200 ms刺激間隔時,尼古丁戒斷和有氧運動的交互效應(yīng)不顯著(P> 0.05)。多重比較結(jié)果顯示,在20 ms和50 ms刺激間隔時,同SS組相比,NS組IPSC PPR顯著降低(20 ms,P< 0.01;50 ms,P< 0.01);同NS組相比,NE組IPSC PPR顯著升高(20 ms,P< 0.01;50 ms,P< 0.05)。其它刺激間隔時各組間IPSC PPR均無顯著性差異(P> 0.05,圖5D,5E)。以上結(jié)果提示,尼古丁戒斷增強VTA多巴胺神經(jīng)元突觸前GABA釋放概率;有氧運動降低尼古丁戒斷誘導(dǎo)的VTA多巴胺神經(jīng)元突觸前GABA釋放概率。

圖5 各組小鼠VTA多巴胺神經(jīng)元IPSC PPRNote. A. Representative IPSC traces at 20 ms interstimulus intervals recorded by patch clamp. B. IPSC PPR at 20 ms interstimulus intervals in these four groups. C. IPSC PPR at 50 ms interstimulus intervals in these four groups. D. IPSC PPR at 100 ms interstimulus intervals in these four groups. E. IPSC PPR at 200 ms interstimulus intervals in these four groups. Figure 5 IPSC PPR from VTA dopamine neurons of mice in each group

2.5 有氧運動對尼古丁戒斷小鼠VTA GAD67表達的影響

VTA GAD67免疫熒光染色的效果圖見圖6A,圖中紅色熒光為GAD67陽性染色,藍色熒光為細胞核染色。對VTA中GAD67的熒光強度進行雙因素方差分析(圖6B),結(jié)果顯示尼古丁戒斷和有氧運動的交互效應(yīng)顯著(P< 0.001)。多重比較結(jié)果顯示,同SS組相比,NS組的熒光強度顯著降低(P< 0.01);同NS組相比,NE 組的熒光強度顯著升高(P< 0.001)。以上結(jié)果提示,尼古丁戒斷下調(diào)VTA GAD67蛋白表達;有氧運動上調(diào)尼古丁戒斷小鼠VTA GAD67蛋白表達。

圖6 各組小鼠VTA GAD-67的表達Note. A. Immunostaining of GAD67 in VTA. B. Fluorescence intensity of GAD67 in VTA in these four groups. Figure 6 Expression of GAD67 in VTA of mice in each group

3 討論

運動干預(yù)是一種潛在的治療和控制成癮性疾病的新策略,可能發(fā)展成為控制成癮性疾病或毒癮戒斷的獨立干預(yù)措施或重要輔助方法[20-21],但運動促進成癮記憶消除、減少復(fù)吸的中樞機制遠未明了。本研究發(fā)現(xiàn),有氧運動可以減少成癮模型在戒斷期對尼古丁的復(fù)吸;有氧運動對尼古丁戒斷誘導(dǎo)的VTA多巴胺神經(jīng)元GABA能抑制性輸入異常具有改善作用,即減少突觸前GABA釋放,下調(diào)突觸后GABAA受體的數(shù)量和/或功能,從而減弱多巴胺神經(jīng)元接受的抑制性突觸傳遞效能。本研究為運動干預(yù)改善成癮、減少復(fù)吸提供了一定的實驗依據(jù)。

從神經(jīng)生物學(xué)角度來看,成癮性疾病是一種慢性、高復(fù)發(fā)性的腦部疾病。戒斷后再次復(fù)吸是導(dǎo)致成癮性疾病戒斷失敗的重要原因,因此減少復(fù)吸是治療成癮的關(guān)鍵。本研究所使用的CPP模型是一種巴甫洛夫條件反射形式,被認為是評價藥物精神依賴的簡單有效的方法之一[22]。CPP實驗過程中,控制給藥與不給藥時訓(xùn)練環(huán)境的不同,最后在不給藥的情況下測試動物是否對給藥箱產(chǎn)生偏愛,其對環(huán)境的偏愛程度代表動物對藥物的渴求與依賴程度。已有文獻對不同運動強度和運動方式對藥物成癮復(fù)吸渴求度的影響進行了研究。趙琦等[18]的研究發(fā)現(xiàn),中等強度(65% ~ 70%最大心率)和高強度(80% ~ 85%最大心率)運動均能有效降低成癮患者的主觀渴求度。周躍輝等[23]發(fā)現(xiàn)中等強度運動通過上調(diào)前額葉皮層α7 nAChRs蛋白表達增強尼古丁成癮大鼠的抑制能力,進而降低尼古丁大鼠的依賴性。Jung等[24]也發(fā)現(xiàn)2周中等強度有氧運動改善成癮模型的行為學(xué)變化,其機制與紋狀體谷氨酸能突觸傳遞的信號分子表達變化有關(guān)。但是信號分子的變化與突觸傳遞的變化并不完全一致,因此以上機制研究并未在功能學(xué)層面提供證據(jù)。本研究實驗結(jié)果顯示,戒斷期2周的有氧運動可以減少小鼠對尼古丁箱體的條件性位置偏愛,表明2周有氧運動可以減少成癮模型戒斷期對尼古丁的復(fù)吸,這一結(jié)果與前人的研究一致[25-26]。本研究的結(jié)果一方面再次證實運動具有減少復(fù)吸、改善成癮的作用;另一方面也說明CPP是研究運動改善成癮的可靠模型。

GABA能抑制性輸入對VTA多巴胺神經(jīng)元的興奮性起到重要調(diào)控作用[27]。研究發(fā)現(xiàn),VTA多巴胺神經(jīng)元接受的GABA能突觸傳遞在成癮形成期和戒斷期的變化特征不同。在成癮的形成期,成癮物質(zhì)的暴露以直接或間接的形式減弱GABA能輸入,從而使多巴胺神經(jīng)元“去抑制”,表現(xiàn)為興奮性過度增強。如嗎啡通過與阿片受體結(jié)合抑制VTA GABA能神經(jīng)元興奮性,從而增加多巴胺水平[28]。而在戒斷期間多巴胺神經(jīng)元接受的抑制性突觸傳遞又表現(xiàn)為相反的效果,即戒斷導(dǎo)致GABA能傳遞增強,從而使得多巴胺分泌減少,最終導(dǎo)致戒斷期的負性情緒,觸發(fā)復(fù)吸行為,但這一假設(shè)尚缺少充分的功能學(xué)證據(jù)。Jiang等[29]最新的研究發(fā)現(xiàn),嗎啡戒斷導(dǎo)致的負性情緒與獎賞環(huán)路功能下調(diào)有關(guān);使用電生理學(xué)手段發(fā)現(xiàn)嗎啡戒斷使得中央杏仁核(CeA)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)神經(jīng)元向VTA嗎啡獎賞神經(jīng)元集群的抑制性突觸連接增強,而光遺傳抑制該神經(jīng)通路可以緩解戒斷模型的藥物復(fù)吸。本研究發(fā)現(xiàn),尼古丁戒斷使VTA多巴胺神經(jīng)元sIPSC和mIPSC的頻率及幅度增加,IPSC PPR降低,表明尼古丁戒斷導(dǎo)致VTA多巴胺神經(jīng)元接受的抑制性傳遞增強,這種改變涉及突觸前與突觸后機制,即突觸前GABA遞質(zhì)釋放概率增加、突觸后GABAA受體的數(shù)量增加和/或功能增強,本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致,從功能學(xué)的角度再一次證實VTA多巴胺神經(jīng)元抑制性突觸傳遞效能增強是導(dǎo)致戒斷癥狀的重要機制。

對戒煙人群的研究發(fā)現(xiàn),運動可以減輕戒煙者戒斷期間的焦慮等負性情緒,從而減少復(fù)吸[20]。動物實驗也發(fā)現(xiàn)嗎啡戒斷期進行運動干預(yù)可以減輕戒斷模型的焦慮程度和壓力狀態(tài),緩解戒斷癥狀[30]。已有文獻表明,運動可以增加多巴胺釋放以彌補藥物戒斷導(dǎo)致的快感缺失,有利于減輕戒斷癥狀[31]。Kami等[32]的研究發(fā)現(xiàn)運動可以增強病理性疼痛大鼠背外側(cè)被蓋區(qū)和下丘腦外側(cè)區(qū)至VTA的投射,增強VTA多巴胺神經(jīng)元的興奮性。Medrano等[33]的研究發(fā)現(xiàn)運動上調(diào)VTA多巴胺神經(jīng)元AMPA/NMDA ratio,增強興奮性傳遞效能。但是運動對VTA抑制性環(huán)路的調(diào)節(jié)作用目前研究較少。本研究發(fā)現(xiàn),有氧運動降低了由尼古丁戒斷引起的小鼠VTA多巴胺神經(jīng)元GABA能輸入增強:有氧運動導(dǎo)致成癮模型戒斷期VTA多巴胺神經(jīng)元sIPSC和mIPSC的頻率下降、IPSC PPR比值升高,表明有氧運動降低了突觸前動作電位驅(qū)動的GABA釋放(sIPSC頻率降低)和GABA隨機自發(fā)的釋放概率(mIPSC頻率降低);同時,有氧運動使sIPSC和mIPSC的幅度顯著下降,表明有氧運動下調(diào)了突觸后GABAA受體的數(shù)量和/或減弱了GABAA受體功能。結(jié)合本研究行為學(xué)的結(jié)果,提示有氧運動降低尼古丁戒斷模型VTA多巴胺神經(jīng)元抑制性突觸傳遞效能可能是有氧運動減少尼古丁復(fù)吸的中樞機制之一。但本研究對有氧運動改善VTA多巴胺神經(jīng)元抑制性突觸傳遞效能只有電生理學(xué)的證據(jù),并未闡釋運動減少突觸前GABA釋放的分子機制,也未闡明突觸后GABAA受體的蛋白表達和亞基組成特征的變化,這是本研究的不足,將在后期研究中進行此方面研究。VTA多巴胺神經(jīng)元同時接受來自VTA局部GABA能輸入和外部腦區(qū)(伏隔核、腹側(cè)蒼白球、吻內(nèi)側(cè)被蓋核等)的GABA能輸入,不同的GABA能投射在藥物成癮形成、戒斷等不同階段的作用機制可能不同,那么運動對多巴胺神經(jīng)元接受的局部GABA輸入和外部GABA輸入是否具有不同調(diào)節(jié)作用?

GAD67是GABA合成的限速酶,主要位于胞漿中,能反應(yīng)VTA局部GABA能神經(jīng)元GABA的合成情況,從而間接反應(yīng)VTA局部的GABA能傳遞情況。本研究發(fā)現(xiàn),尼古丁戒斷使VTA的GAD67表達降低,提示VTA局部GABA能神經(jīng)元GABA合成減少。結(jié)合本研究電生理結(jié)果,即尼古丁戒斷期間VTA多巴胺神經(jīng)元抑制性突觸傳遞效能增強,我們推測戒斷期VTA多巴胺神經(jīng)元接受的來自外部腦區(qū)的GABA輸入增強而VTA局部的GABA輸入減弱。尼古丁戒斷導(dǎo)致VTA局部GABA能傳遞減弱可能和以下兩方面原因有關(guān):第一,內(nèi)源性大麻素介導(dǎo)的負反饋調(diào)節(jié)。前期研究表明,成癮物質(zhì)暴露誘導(dǎo)VTA多巴胺神經(jīng)元過度激活,釋放內(nèi)源性大麻素,與突觸前GABA神經(jīng)元上的CB1受體結(jié)合,激活鉀離子通道,直接或間接阻滯鈣通道,從而抑制突觸前神經(jīng)元GABA的釋放[34],推測這種調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放的突觸前機制一直持續(xù)至戒斷期。第二,神經(jīng)環(huán)路之間的調(diào)控。VTA接受的外部腦區(qū)的抑制性輸入,如NAc和喙內(nèi)側(cè)被蓋核(rostromedial tegmental nucleus,RMTg)等,也和VTA局部GABA能神經(jīng)元形成投射關(guān)系。戒斷使外部腦區(qū)的抑制性輸入增強,從而抑制VTA局部的GABA能神經(jīng)元的遞質(zhì)釋放。VTA局部的GABA能神經(jīng)元興奮性降低,從而減弱對外側(cè)韁核(lateral habenula,LHb)谷氨酸能神經(jīng)元的抑制作用,使LHb的谷氨酸能神經(jīng)元興奮性增強[35],再通過LHb→RMTg(tVTA)投射增強RMTg的GABA能神經(jīng)元的興奮性,進而通過RMTg→VTA環(huán)路抑制VTA多巴胺神經(jīng)元興奮性[36],減少多巴胺釋放,觸發(fā)復(fù)吸,因此推測VTA局部GABA能神經(jīng)元在通過VTA GABA神經(jīng)元→LHb→RMTg→VTA多巴胺神經(jīng)元環(huán)路降低多巴胺神經(jīng)元興奮性過程中起到“正反饋”(圖7),形成惡性循環(huán)。Meye等[37]發(fā)現(xiàn)成癮物質(zhì)導(dǎo)致LHb谷氨酸能神經(jīng)元興奮性增強,LHb→RMTg的興奮性傳遞增強。Lyu等[38]發(fā)現(xiàn)使用藥理學(xué)手段增加LHb的GABA濃度可以改善帕金森大鼠的抑郁樣行為,提示投射至LHb的抑制性輸入是導(dǎo)致負性情緒的機制之一。以上研究一定程度上支持本文的推測。本研究發(fā)現(xiàn),有氧運動改善尼古丁戒斷導(dǎo)致的VTA GAD67表達降低,提示有氧運動對上述抑制VTA多巴胺神經(jīng)元的環(huán)路具有改善作用。Herrera等[39]研究發(fā)現(xiàn)運動增強大鼠NAc的FosB表達,提示運動可能增強NAc的激活程度,進而增強NAc至VTA GABA能神經(jīng)元的傳遞效能,因此推測本研究中運動增強VTA GAD67表達是由于增強了NAc等腦區(qū)對VTA GABA能神經(jīng)元的抑制性輸入所致。結(jié)合電生理學(xué)的實驗結(jié)果,我們推測VTA GABA合成增加,通過VTA-LHb-RMTg-VTA環(huán)路增強多巴胺神經(jīng)元興奮性,增加多巴胺釋放。Kim等[40]的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激增強LHb的c-fos表達,但中等強度的運動并未增強LHb的c-fos表達,該研究也佐證了本研究的推測,即運動可能抑制LHb谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性,從而緩解負性情緒。綜上所述,本研究的結(jié)果提示VTA多巴胺神經(jīng)元接受的外部腦區(qū)抑制性輸入和VTA局部的抑制性輸入在尼古丁戒斷期間變化特征不同,最終共同作用使多巴胺神經(jīng)元的抑制性傳遞增強,而運動對此具有改善作用。但本研究使用免疫熒光技術(shù)間接反應(yīng)VTA局部GABA能傳遞效能,具有一定局限性,這是本研究的不足,后期將會綜合使用神經(jīng)環(huán)路示蹤技術(shù)、光遺傳和電生理技術(shù)深入研究運動對戒斷模型不同神經(jīng)環(huán)路的調(diào)控機制。

圖7 尼古丁戒斷神經(jīng)環(huán)路調(diào)控機制假說圖Figure 7 Hypothesis of neural circuits in nicotine withdrawal

4 結(jié)論

2周的中等強度有氧運動減少尼古丁戒斷模型VTA多巴胺神經(jīng)元突觸前GABA釋放,下調(diào)突觸后GABAA受體的數(shù)量和/或功能,減弱抑制性突觸傳遞效能,這可能是有氧運動減少復(fù)吸的重要機制之一。