紫甘藍(lán)花青素智能指示膜的制備及其在牛乳新鮮度監(jiān)測(cè)中應(yīng)用

陳賽艷，趙正禾，胥小清，余惠容，何賓賓，劉 濰，王璐瑤，冀俊杰

·農(nóng)產(chǎn)品加工工程·

紫甘藍(lán)花青素智能指示膜的制備及其在牛乳新鮮度監(jiān)測(cè)中應(yīng)用

陳賽艷1，趙正禾1，胥小清1，余惠容1，何賓賓1，劉 濰1，王璐瑤1，冀俊杰2

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，雅安 625014；2. 山東技師學(xué)院，濟(jì)南 250200）

為研究不同紫甘藍(lán)花青素含量對(duì)大豆分離蛋白基智能指示膜性能的影響，提高指示膜的綜合包裝性能，考察指示膜對(duì)巴氏殺菌乳新鮮度的監(jiān)測(cè)效果。以大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）為原料，添加紫甘藍(lán)花青素（Purple Cabbage Anthocyanins，PCA）制備指示膜，對(duì)其結(jié)構(gòu)、熱性能、機(jī)械性能、色度及其穩(wěn)定性和pH敏感性進(jìn)行表征和分析，并將指示膜應(yīng)用于巴氏殺菌乳新鮮度監(jiān)測(cè)中。結(jié)果表明：相對(duì)于SPI/Na2SO4膜，含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%紫甘藍(lán)花青素的指示膜，拉伸強(qiáng)度從2.46 MPa增加到3.77 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率從105.36%增加到131.96%；與標(biāo)準(zhǔn)白的色差從21.13增加到52.88，指示膜明度降低，色度偏黃綠色，結(jié)晶溫度比SPI/Na2SO4膜升高。指示膜的色度在常溫下5 d內(nèi)不出現(xiàn)可視性色差，但pH敏感性強(qiáng)。將指示膜應(yīng)用于巴氏殺菌乳新鮮度監(jiān)測(cè)中，指示膜的顏色隨著牛乳變質(zhì)由綠變紅，指示膜與原始膜的色差變化與巴氏殺菌乳的pH值變化呈相反趨勢(shì)，且色差可見(jiàn)。因此，該指示膜具有監(jiān)測(cè)巴氏殺菌乳腐敗過(guò)程的潛力，應(yīng)用前景廣闊。

膜；包裝；大豆分離蛋白；紫甘藍(lán)花青素；pH指示膜；新鮮度監(jiān)測(cè)；巴氏殺菌乳

0 引 言

食品腐敗會(huì)降低食品的營(yíng)養(yǎng)，甚至產(chǎn)生有毒成分，危害人體健康。以巴氏殺菌乳為例，微生物在儲(chǔ)存過(guò)程中大量生長(zhǎng)繁殖，極易使巴氏殺菌乳失去初始營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商品價(jià)值，還易導(dǎo)致食源性疾病，危害人體健康[1]。隨著社會(huì)發(fā)展和人們生活水平提高，人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和安全的要求逐漸提高。因此，迫切需要一種簡(jiǎn)單可行的方法來(lái)監(jiān)測(cè)食品新鮮度的變化。

指示性包裝是智能化包裝領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù)，能夠利用食品的代謝產(chǎn)物作為信息來(lái)執(zhí)行感測(cè)、跟蹤和記錄等功能，消費(fèi)者無(wú)需打開(kāi)包裝即可觀察到包裝內(nèi)食品新鮮度變化，檢測(cè)成本低且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[2]。近年來(lái)，隨著白色污染的加劇和世界能源的日漸短缺，綠色、環(huán)保、可生物降解的智能指示膜備受關(guān)注。

大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）作為多羥基天然高分子聚合物，分子中含有大量的氫鍵、疏水鍵和疏水作用的基團(tuán)，具有優(yōu)異的成膜性、生物相容性、生物降解性和低成本性[3]，常被選為成膜基材。但純SPI膜脆性大、機(jī)械強(qiáng)度不足，常與增塑劑、還原劑等共混，同時(shí)通過(guò)熱處理、堿處理以改善性能[2]，達(dá)到擴(kuò)大包裝應(yīng)用的目的。智能指示膜的制備除了需要成膜基材外，還需要指示劑。目前，已有學(xué)者在食品包裝材料中添加對(duì)pH敏感的合成指示劑制備智能指示膜，如溴甲酚綠、甲基紅和溴甲酚紫。這類(lèi)指示劑對(duì)顏色響應(yīng)顯著且迅速，但具有潛在毒性，存在安全隱患，因此亟需尋找一些安全的合成指示劑替代品[4]。

紫甘藍(lán)花青素（Purple Cabbage Anthocyanins，PCA）作為天然指示劑，安全、無(wú)毒、對(duì)環(huán)境pH值敏感，在不同pH環(huán)境下呈現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)和顏色[5]，因此，富含紫甘藍(lán)花青素的包裝膜具有作為食品新鮮度監(jiān)測(cè)膜的潛力。目前，紫甘藍(lán)花青素作為pH指示劑在智能指示膜中的應(yīng)用已被前人所研究。劉丹飛[6]以聚乙烯醇/羧甲基纖維素鈉為成膜基材，紫甘藍(lán)花青素為pH指示劑，制備了智能指示膜并成功應(yīng)用于豬肉和蝦新鮮度監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)含紫甘藍(lán)花青素的指示膜在豬肉和蝦新鮮度監(jiān)測(cè)過(guò)程中都表現(xiàn)出明顯的顏色變化，且花青素含量較低的指示膜顏色響應(yīng)迅速，指示效果明顯，更適合在常溫下監(jiān)測(cè)豬肉和蝦新鮮度的變化。王艷娟[7]以殼聚糖/木薯淀粉為成膜基材，紫甘藍(lán)花青素為pH指示劑，制備了智能指示膜并成功監(jiān)測(cè)了鹿肉新鮮度，鹿肉腐敗過(guò)程中薄膜顏色從淡粉色變?yōu)辄S綠色。Guo等[8]制備了一種基于果膠的紫甘藍(lán)花青素指示膜，用于監(jiān)測(cè)羊肉新鮮度，羊肉腐敗過(guò)程中薄膜顏色從紫紅色變?yōu)榈{(lán)色，指示膜色差顯著，監(jiān)測(cè)效果良好。目前雖有較多關(guān)于大豆分離蛋白復(fù)合膜負(fù)載紫甘藍(lán)花青素制備智能指示膜的研究，但此類(lèi)指示膜多應(yīng)用于肉（豬肉、魚(yú)肉、鹿肉、羊肉等）及肉制品的新鮮度檢測(cè)中，這與花青素的pH響應(yīng)范圍和肉制品變質(zhì)過(guò)程中的微生物繁殖引起的環(huán)境變化有關(guān)。而將此指示膜應(yīng)用于巴氏殺菌乳新鮮度監(jiān)測(cè)中的研究鮮有相關(guān)報(bào)道。

本研究為了制備具有pH指示功能的大豆分離蛋白膜并研究其應(yīng)用效果，以大豆分離蛋白為成膜基材，添加紫甘藍(lán)花青素為指示劑制備pH指示膜，應(yīng)用于巴氏殺菌乳新鮮度監(jiān)測(cè)中，重點(diǎn)考察紫甘藍(lán)花青素指示膜在巴士殺菌乳腐敗變質(zhì)過(guò)程中的指示機(jī)理，以期為紫甘藍(lán)花青素智能指示膜的研究及應(yīng)用提供理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（食品級(jí)純度），哈爾濱高科技大豆食品有限公司；紫甘藍(lán)花青素（食品級(jí)純度），濟(jì)南魯源生物科技有限公司；巴氏殺菌乳：成都新希望乳業(yè)股份有限公司。

無(wú)水亞硫酸鈉、甘油、氫氧化鈉（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HD-B609B-S智能電子拉力試驗(yàn)機(jī)，海達(dá)國(guó)際儀器有限公司；SC-10便捷式色差儀，蘇州欣美和儀器有限公司；WGW光電霧度儀，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；ZUS-4厚度測(cè)試儀，長(zhǎng)春月明小型試驗(yàn)機(jī)有限責(zé)任公司；LRH-150智能生化培養(yǎng)箱，上海飛越儀器有限公司；NICOLETIS10傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛尼高力儀器有限公司；pHS-25酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指示膜的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]的方法稍作調(diào)整。將7 g大豆分離蛋白溶于93 g蒸餾水中，加入2%甘油（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，基于SPI水溶液計(jì)）作指示劑，機(jī)械攪拌20 min，加熱到60 ℃,恒溫水浴30 min。加入0.1%亞硫酸鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，基于SPI水溶液計(jì)）作還原劑，25 ℃下恒溫?cái)嚢?0 min。加入3%、4%和5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，基于大豆分離蛋白質(zhì)量計(jì)）紫甘藍(lán)花青素，在常溫下、10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)10 min，得到含不同濃度紫甘藍(lán)花青素的混合液，再用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為9，于0.09 MPa真空環(huán)境中常溫脫氣1 h，制得成膜液。取85 mL成膜液流延至（15 cm×25 cm）有機(jī)玻璃板上，40 ℃下恒溫干燥7 h，揭膜，置于（25±2） ℃、55%±1%相對(duì)濕度的環(huán)境中平衡24 h，待測(cè)。其中不加花青素的膜標(biāo)記為SPI/Na2SO4，與不添加亞硫酸鈉和花青素均的SPI膜，均作為對(duì)照膜。

1.3.2 指示膜性能測(cè)定與分析

1）機(jī)械性能：按照國(guó)標(biāo)方法GB/T 1040.3—2006測(cè)定指示膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率[11]。

2）色度與透明度：按照國(guó)標(biāo)方法GB/T 7921—2008測(cè)定指示膜的色度，并按式（1）計(jì)算色差Δ[12]。

式中、、為膜的色度值，0=99.49，0=-0.07，0=-0.16為標(biāo)準(zhǔn)白的色度值。

按照國(guó)標(biāo)方法GB/T 2410—2008測(cè)定指示膜的透明度[13]。

3）紅外光譜分析：將膜樣裁成2 cm×2 cm試樣，在60 ℃條件下干燥24 h，利用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定薄膜的吸收光譜，掃描范圍650～4 000 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次[3]。

4）差示掃描量熱分析：根據(jù)許安的方法做少量修改[14]。在氮?dú)猸h(huán)境下，以10 ℃/min的速率從20 ℃升溫至250 ℃，測(cè)定并分析。

5）掃描電鏡分析：將膜樣裁成2 cm×2 cm試樣，在60 ℃干燥24 h，用液氮將膜冷凍斷裂，真空濺射噴金，通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM，Scanning Electron Microscopy）觀察膜的橫截面（放大500倍）及表面（放大3 000倍），加速電壓為5～15 kV[15]。

6）pH值響應(yīng)將指示膜裁剪成3 cm×3 cm，浸于pH值2、4、6、8、10、12的緩沖溶液中，通過(guò)數(shù)碼相機(jī)每5 min拍照一次，記錄膜的顏色變化，直至指示膜顏色穩(wěn)定。同時(shí)采用上文中的方法測(cè)定膜的色度值并計(jì)算色差值，研究指示膜的pH敏感性。

7）顏色穩(wěn)定性

儲(chǔ)藏溫度對(duì)薄膜顏色穩(wěn)定性的影響：將指示膜置于相對(duì)濕度為75%±1%，自然光照，溫度分別為37、25 ℃環(huán)境中，利用便攜式色差儀按一定的時(shí)間間隔測(cè)定薄膜的色度值（，，），總時(shí)長(zhǎng)為10 d。

儲(chǔ)藏光照對(duì)薄膜顏色穩(wěn)定性的影響：將指示膜分別置于室內(nèi)避光（用黑色自封袋）和自然光照（透明自封袋）環(huán)境中，相對(duì)濕度為75%±1%，溫度為25 ℃，利用便攜式色差儀按一定的時(shí)間間隔測(cè)定薄膜的色度值（，，），總時(shí)長(zhǎng)為10 d。

在測(cè)試薄膜的顏色穩(wěn)定性時(shí)，將樣品膜的色度值與初始膜的色度值進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算色差，即式（1）中0，0，0采用初始膜的色度值。

1.3.3 指示膜的應(yīng)用

根據(jù)前人的研究，將pH值、酸度和菌落總數(shù)作為巴士殺菌乳的新鮮度指標(biāo)[16]。準(zhǔn)確移取25 mL巴氏殺菌乳樣品置于培養(yǎng)皿中。將指示膜裁成大小為3 cm×3 cm的小塊，貼于培養(yǎng)皿頂部?jī)?nèi)表面，指示膜不與殺菌乳接觸。用保鮮膜包裹后置于（37±2）℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。每隔3 h采用pHS-25酸度計(jì)測(cè)定巴氏殺菌乳的pH值，根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定巴氏殺菌乳的菌落總數(shù)[17-18]，根據(jù)GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》測(cè)定巴氏殺菌乳的酸度[19]，同時(shí)拍照記錄指示膜的顏色和測(cè)定指示膜的色度，并根據(jù)上文的方法計(jì)算膜的色差值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0、Origin 2019進(jìn)行處理與分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性分析用方差分析法（ANOVA），<0.05表示存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 指示膜的紅外光譜分析

圖1是薄膜的紅外光譜圖。在大豆分離蛋白膜中，在3 100～3 500 cm-1處有一段較寬的吸收譜帶，來(lái)源于O-H拉伸振動(dòng)和N-H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的多重吸收峰[20]，以及SPI分子內(nèi)部及其分子間-H、O-H、C-H鍵的伸縮振動(dòng)[21]。在2 800～3 000 cm-1處有一段較窄的吸收譜帶，這是聚合物基質(zhì)飽和C-H鍵的伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生的拉伸振動(dòng)峰[20]。3 289 cm-1處是O-H鍵的伸縮振動(dòng)和N-H鍵的彎曲振動(dòng)吸收峰，2 959 cm-1處是C-H鍵的吸收峰[20]，1 632 cm-1處是C=O鍵的伸縮振動(dòng)峰來(lái)自于酰胺Ⅰ帶[21]，1 539 cm-1處是N-H鍵的彎曲振動(dòng)吸收峰來(lái)自酰胺Ⅱ帶[22]，1 400 cm-1處是C-OH伸縮振動(dòng)吸收峰來(lái)自于酰胺Ⅲ帶[5]，1 235 cm-1處為C-N和N-H的伸縮振動(dòng)峰，1 110 cm?1處吸收峰表示C-H鍵、O-CH鍵的變形振動(dòng)[23]。加入亞硫酸鈉后，2 880 cm-1處的飽和C-H鍵的伸縮振動(dòng)加強(qiáng)，這是由于亞硫酸鈉作為還原劑，打斷了大豆分離蛋白分子間的S-S鍵，暴露了分子內(nèi)部疏水基團(tuán)，削弱了復(fù)合膜的分子間力。加入花青素之后，3 289 cm-1處的波峰向低波數(shù)偏移，這是由于大豆分離蛋白與紫甘藍(lán)花青素之間產(chǎn)生氫鍵作用[24]，同時(shí)大豆分離蛋白鏈上羥基的O電負(fù)性大，與多酚羥基上的H發(fā)生靜電吸引作用，使-OH的電子更偏向O，-OH共價(jià)鍵被拉伸，H周?chē)碾娮釉泼芏冉档?，羥基峰向低波數(shù)偏移[22]。添加紫甘藍(lán)花青素后指示膜的紅外圖譜與大豆分離蛋白膜的紅外圖譜峰形相似，指示膜的O-H伸縮振動(dòng)峰向右偏移，說(shuō)明花青素與大豆分離蛋白之間為物理結(jié)合，花青素的加入并未破壞大豆分離蛋白的基本結(jié)構(gòu)，主要通過(guò)非共價(jià)鍵（氫鍵或者疏水相互作用）結(jié)合。1 539 cm-1處由N-H鍵的彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰在加入紫甘藍(lán)花青素之后向左發(fā)生偏移，說(shuō)明添加花青素對(duì)復(fù)合膜的N-H有明顯影響[24]。以上結(jié)果說(shuō)明花青素與大豆分離蛋白之間具有較好的相容性。

注：SPI膜為純SPI膜，SPI/Na2SO4膜為SPI中加入Na2SO4的復(fù)合膜，SPI/Na2SO4/PCA 3膜、SPI/Na2SO4/PCA 4膜和SPI/Na2SO4/PCA 5膜分別為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、4%、5%紫甘藍(lán)花青素的指示膜。下同。

2.2 指示膜的掃描電鏡分析

利用掃描電鏡觀察指示膜的微觀結(jié)構(gòu)，如圖2。SPI膜具有光滑、均勻的表面和橫截面結(jié)構(gòu)，表明大豆分離蛋白成膜性良好。加入少量紫甘藍(lán)花青素后，指示膜表面和內(nèi)部均出現(xiàn)少量顆粒和團(tuán)聚的現(xiàn)象，但無(wú)裂痕，這可能是由帶正電的紫甘藍(lán)花青素分子與帶負(fù)電的大豆分離蛋白分子之間的相互吸引出現(xiàn)的少量顆粒[25]，同時(shí)表面出現(xiàn)了少量的粗糙。隨著紫甘藍(lán)花青素含量增加，指示膜的截面出現(xiàn)較多的顆粒，表面的顆粒和團(tuán)聚狀物也隨之增加，表明紫甘藍(lán)花青素與大豆分離蛋白的融合已經(jīng)飽和，過(guò)量的花青素分子浮于指示膜表面。故選擇紫甘藍(lán)花青素與SPI基質(zhì)融合良好、指示膜均勻性和致密性佳的PCA4%添加量的指示膜進(jìn)行分析，因?yàn)橹旅艿慕Y(jié)構(gòu)有可能改善薄膜的機(jī)械性能和阻隔性能，同時(shí)均勻、致密的微觀結(jié)構(gòu)也有利于提高消費(fèi)者對(duì)商品的青睞。

圖2 指示膜的掃描電鏡圖

2.3 指示膜的熱穩(wěn)定性分析

指示膜的熱穩(wěn)定性在一定程度上影響其應(yīng)用。本研究通過(guò)差式掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC）分析指示膜的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3所示。有研究顯示，純SPI 膜的熔融溫度為87.26 ℃[10]。本研究中SPI膜中加入亞硫酸鈉后在167 ℃處出現(xiàn)吸熱峰，發(fā)生熔融；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%紫甘藍(lán)花青素后，結(jié)晶溫度升高了3 ℃，達(dá)到170 ℃，且隨著PCA含量增加，結(jié)晶溫度繼續(xù)升高。這可能是一定量的亞硫酸鈉作為還原劑增強(qiáng)了SPI膜的結(jié)構(gòu)致密性，使其熔融溫度升高；而PCA與SPI分子間強(qiáng)烈的作用力，需要更多的熱能方可對(duì)其進(jìn)行解離。而PCA含量較低時(shí)，PCA與SPI分子間的相互作用力較弱，隨著PCA含量增加，分子間作用力增加，同時(shí)SPI與PCA分子間形成的氫鍵也可以提高復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性，這與紅外圖譜的分析一致。當(dāng)花青素含量繼續(xù)增加時(shí)，熔點(diǎn)稍有降低，如從4%添加量時(shí)的194 ℃下降到5%添加量時(shí)的190 ℃，同時(shí)在添加過(guò)量的花青素之后的指示膜不再出現(xiàn)單一精確的熔融點(diǎn)，而是形成了寬的軟化帶，這可能與過(guò)量花青素在指示膜表面分布不均有關(guān)[10,25]，這種不均會(huì)降低指示膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，進(jìn)而出現(xiàn)寬的軟化溫度區(qū)間。

圖3 指示膜的DSC曲線

2.4 指示膜的厚度與機(jī)械性能分析

指示膜厚度與膜液濃度、膜液溶質(zhì)中分子結(jié)構(gòu)及成膜過(guò)程中的相互作用以及成膜面積有關(guān)[3]。本研究中成膜面積固定，膜液濃度隨著PCA含量增加而升高。這是因?yàn)樘砑拥腜CA增加了成膜液的干物質(zhì)含量，導(dǎo)致相同量的成膜液流延時(shí)質(zhì)量增加，從而指示膜的厚度增加[26]。當(dāng)PCA增加到一定量時(shí)，膜的厚度趨于穩(wěn)定，整個(gè)厚度在115.67～144.91 μm之間。這是因?yàn)镻CA與SPI具有良好的相容性，小分子進(jìn)入SPI大分子的間隙中，膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻而固定，這一點(diǎn)在紅外光譜分析中得到了證實(shí)。過(guò)量的PCA分子不會(huì)進(jìn)入SPI大分子間，故膜的厚度增加不顯著。

在指示膜的應(yīng)用中，需要將指示膜覆蓋于巴士殺菌乳的包裝容器出口處，良好的機(jī)械性能可保障巴士殺菌乳包裝的完整性和安全性，尤其是在運(yùn)輸過(guò)程中[27]。指示膜的機(jī)械性能如表1所示，相比于添加亞硫酸鈉的SPI膜（2.46 MPa），含PCA的指示膜拉伸強(qiáng)度（TS，Tensile strength）和斷裂伸長(zhǎng)率（EAB，Elongation At Break）均較高，這與Huang的研究結(jié)果一致[28]。且隨著PCA濃度增加，指示膜的TS先增后減，EAB遞減。這可能是因?yàn)槿矫娴脑颍阂皇翘砑覲CA后，PCA與SPI相容性佳，混合均勻，提升了復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)致密性；二是帶正電的PCA分子與帶負(fù)電的SPI分子之間由于靜電作用、氫鍵作用形成了高密度的空間立體網(wǎng)絡(luò)[25]；三是PCA中大量的羥基與SPI分子之間產(chǎn)生了強(qiáng)的相互作用，阻礙了SPI分子的鏈段運(yùn)動(dòng)，從而TS增加。而PCA增加到一定量時(shí)，過(guò)量的PCA小分子浮于指示膜表面發(fā)生自身聚集，削弱了SPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的鍵合作用，使指示膜的TS降低。這與前人研究結(jié)果的規(guī)律一致[25]。但由于該指示膜中添加了具有還原性和漂白性的亞硫酸鈉，亞硫酸鈉小分子進(jìn)入SPI大分子間增強(qiáng)了指示膜的結(jié)構(gòu)致密性和機(jī)械性能，漂白作用增強(qiáng)了指示膜的白度，降低其顯色效果。故添加花青素后，膜的顯色響應(yīng)會(huì)更顯著，導(dǎo)致了少量花青素的顯色效果與前人研究中添加較多花青素的顯色效果相當(dāng)。這也是本文中花青素添加量少于前人研究的原因所在。同時(shí)過(guò)量PCA的加入使得指示膜的分子空隙更小，與水分子之間的交聯(lián)更少，從而EAB變小[6]。但本研究指示膜斷裂伸長(zhǎng)率（131.96%）也優(yōu)于其他含花青素的膜，比如馬鈴薯淀粉/硫酸軟骨素/藍(lán)莓花青素復(fù)合膜（42.15%）[29]、大豆分離蛋白/納米氧化鋅/葡萄皮紅復(fù)合膜（113.29%）[3]。以上結(jié)果說(shuō)明，PCA在SPI膜的添加量選擇4%為宜，此時(shí)指示膜的TS比添加亞硫酸鈉的SPI膜增加53.25%，EAB比添加亞硫酸鈉的SPI膜增加25.25%。

表1 指示膜的厚度和機(jī)械性能

注：數(shù)值=均值±標(biāo)準(zhǔn)差（=3），同一列中標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（<0.05），下同。

Note: Values are presented as mean±standard deviation. Different letters in the same column indicate significant differences (<0.05), the same below.

2.5 指示膜的色度與環(huán)境穩(wěn)定性分析

一般來(lái)說(shuō)，指示膜應(yīng)用于食品包裝和銷(xiāo)售過(guò)程中，膜的色度直接影響食品的感官效果和消費(fèi)者接受度，膜的顏色不宜過(guò)深，故對(duì)指示膜的初始色度進(jìn)行測(cè)試。此時(shí)的色差用指示膜的色度與標(biāo)準(zhǔn)白的色度進(jìn)行對(duì)比，色差越低，表明指示膜顏色淺，更適合于銷(xiāo)售。指示膜的色度如表2所示，相比于SPI膜，含PCA的指示膜值和值較小，值和Δ值均較大，說(shuō)明指示膜偏綠偏黃。隨著PCA濃度增加，指示膜的顏色從淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)槟G色，不利于銷(xiāo)售。但若指示劑含量過(guò)低，則指示膜的變色響應(yīng)不夠靈敏，不能滿足應(yīng)用的要求[2]。透明度直接影響食品的感官效果，由表2可見(jiàn)，添加紫甘藍(lán)花青素顯著降低了指示膜的透明度，但均在消費(fèi)者可接受的范圍內(nèi)，故在確保指示膜可接受透明度和pH敏感性響應(yīng)的雙重前提下，選擇4%的PCA添加量為宜。

表2 指示膜的色度

為準(zhǔn)確傳遞所監(jiān)測(cè)食品的新鮮度信息，必須確保指示膜在食品保質(zhì)期內(nèi)的顏色穩(wěn)定性，故對(duì)指示膜進(jìn)行溫度和光照穩(wěn)定性分析，此時(shí)色差用指示膜的實(shí)時(shí)色度與初始色度相比較。而花青素的穩(wěn)定性易受到溫度、光照等環(huán)境的影響[30]。圖4顯示了指示膜在不同溫度、光照環(huán)境下的顏色穩(wěn)定性。與在37℃下相比，25℃環(huán)境下的指示膜顯示出更高的穩(wěn)定性，Δ值更低，這與前人的研究結(jié)果一致[30]。這是因?yàn)閷?duì)花青素具有保護(hù)作用的3-糖苷結(jié)構(gòu)在高溫下易水解，同時(shí)花青素吡喃環(huán)也會(huì)水解，整個(gè)花青素結(jié)構(gòu)被破壞，薄膜顏色發(fā)生改變[31]。Δ>5時(shí)，薄膜顯示出肉眼可見(jiàn)的顏色變化[32]。

光照也是影響薄膜顏色的重要參數(shù)，長(zhǎng)時(shí)間的光照會(huì)誘發(fā)花青素碳骨架在C2位斷裂，形成C4羥基降解的中間產(chǎn)物，之后被氧化成查爾酮，查爾酮進(jìn)一步氧化成如苯甲酸和2，4，6-三羥基苯甲醛等水解產(chǎn)物[33]，同時(shí)光照引起的樣品表面溫度升高也會(huì)引起花青素的分解。由圖4c和d可見(jiàn)，相比于光照條件下，避光下的指示膜顯示出相對(duì)較高的顏色穩(wěn)定性，尤其是PCA-4在光照條件下120 h內(nèi)顏色穩(wěn)定（Δ<5），在避光條件下132 h內(nèi)顏色穩(wěn)定（Δ<5），這得益于SPI的親水中心與紫甘藍(lán)花青素結(jié)合，在避光條件下具有良好的水合作用，從而減少了PCA分子水合降解的機(jī)會(huì)，同時(shí)SPI分子的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)PCA具有一定的包裹作用[34]。同時(shí)不論是光照條件下還是避光條件下，指示膜的顏色穩(wěn)定時(shí)長(zhǎng)均超過(guò)了5 d，符合巴氏殺菌乳的包裝監(jiān)測(cè)要求。

注：PCA 0膜為SPI中加入Na2SO4而不含花青素的復(fù)合膜；PCA 3膜、SPCA 4膜和PCA 5膜分別為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、4%、5%紫甘藍(lán)花青素的指示膜。

2.6 指示膜的pH敏感性分析

根據(jù)上述分析，選擇PCA-4指示膜浸泡在不同pH值的酸堿緩沖液中以顏色變化評(píng)估指示膜的pH敏感性。指示膜的顏色變化見(jiàn)表3。當(dāng)pH值為2時(shí)，指示膜呈紅色。隨著pH值升高，指示膜紅色減淡，這是因?yàn)樽细仕{(lán)花青素此時(shí)近乎無(wú)色。堿性條件下指示膜顏色變深，當(dāng)pH值>12，指示膜呈現(xiàn)黃綠色。這是由于花青素在不同pH環(huán)境下呈現(xiàn)的不同結(jié)構(gòu)所致[35]。當(dāng)花青素在pH值為2～4的強(qiáng)酸性環(huán)境中時(shí)，以紅色黃烊鹽離子為主；隨著pH值升高，PCA失去碳氧環(huán)上的陽(yáng)離子，并與水中的OH-離子結(jié)合后形成無(wú)色甲醇假堿，紅色逐漸變淡；pH值繼續(xù)升高，花青素中的黃酮離子發(fā)生水合作用形成了無(wú)色的查爾酮結(jié)構(gòu)[36]，指示膜顏色變淡；在堿性溶液中，PCA部分結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，黃烊鹽離子失去質(zhì)子，藍(lán)色醌式堿逐漸增加，PCA呈現(xiàn)藍(lán)綠色。如表3所示，在pH值2-12之間，指示膜的值先增大后減??；值逐漸降低，即顏色由紅（+）到綠（-）的變化趨勢(shì)；值先減小后增大，但始終為正。同時(shí)表3數(shù)據(jù)表明，pH值4-8范圍內(nèi)指示膜與初始膜（=46.96，=-4.60，=3.76）的色差值為18.66～21.12，通常認(rèn)為當(dāng)色差Δ值>5時(shí)，該顏色變化可被肉眼識(shí)別；Δ值>12時(shí)，則表示不同的顏色空間[37]。本研究中的指示膜在pH值4～8顏色變化靈敏，具備監(jiān)測(cè)巴氏殺菌乳新鮮度的潛力。

2.7 指示膜在監(jiān)測(cè)巴氏殺菌乳新鮮度中的應(yīng)用

巴氏殺菌乳在腐敗變質(zhì)過(guò)程中，微生物的生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致乳酸累積，降低pH值。實(shí)際檢測(cè)中，常以酸度和pH值作為巴氏殺菌乳新鮮度的重要指標(biāo)[38]。本研究中，將巴氏殺菌乳貯藏于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔3 h檢測(cè)巴氏殺菌乳的酸度和pH值，以及指示膜的色差。將指示膜的初始色度（=46.96，=-4.60，=3.76）作為對(duì)照，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間測(cè)定的指示膜色度與初始色度進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)式（1）計(jì)算得到各個(gè)時(shí)間點(diǎn)指示膜與原始膜的色差值，結(jié)果見(jiàn)表4。巴氏殺菌乳的初始酸度值為12.12°T，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，酸度值持續(xù)增加，且速度越來(lái)越快；同時(shí)pH值持續(xù)降低，尤其是18 h后，巴氏殺菌乳的pH降至5.84，這是由于微生物代謝產(chǎn)生的乳酸積累所致。根據(jù)前人的研究結(jié)論，乳酸菌在pH值較低的4.0～5.0時(shí)，會(huì)導(dǎo)致牛奶出現(xiàn)不良變質(zhì)[39]。同時(shí)檢測(cè)指示膜的色差值，發(fā)現(xiàn)指示膜與初始膜的色差逐步增加，與2.6節(jié)中指示膜在不同pH值條件下的顏色響應(yīng)行為一致，如圖5a所示，指示膜的顏色由綠色逐漸變成紅色。貯存初期（<9 h）新鮮牛乳中的乳糖在微生物作用下分解成丙酮酸，在氧氣充足時(shí)被氧化成二氧化碳和水，同時(shí)也由于乳糖未被大量分解，牛乳酸度增長(zhǎng)緩慢；而后期在氧含量不足時(shí)丙酮酸無(wú)法即時(shí)轉(zhuǎn)化而發(fā)生堆積，于是乳酸脫氫酶將丙酮酸還原成乳酸（圖5b），導(dǎo)致變質(zhì)牛乳的酸度增長(zhǎng)越來(lái)越快，同時(shí)整個(gè)巴士殺菌乳的環(huán)境呈酸性[40]。此時(shí)指示膜處在酸度增加的環(huán)境中，產(chǎn)生的顯色反應(yīng)由紫甘藍(lán)花青素的結(jié)構(gòu)變化所致。紫甘藍(lán)黃花青素的反應(yīng)平衡可以通過(guò)Handerson-Hassel-Balch方程進(jìn)行分析和證明（圖5c）[39]。

表3 不同pH值條件下指示膜的顏色響應(yīng)

表4 巴氏殺菌乳酸度、pH值和指示膜的色差變化

圖5 巴氏殺菌乳腐敗過(guò)程中指示膜色度變化原理

在巴士殺菌乳的保鮮初期，花青素中的黃素陽(yáng)離子（紅色）脫除質(zhì)子形成醌式堿（紫色）/陰性醌式堿（藍(lán)色）[41]，指示膜呈現(xiàn)藍(lán)色或紫色，但本研究中的巴士殺菌乳酸性為主，堿性不足，故指示膜只在6 h內(nèi)呈青色；隨著巴士殺菌乳酸性增強(qiáng)，黃素陽(yáng)離子的雙鍵在周?chē)h(huán)境中發(fā)生擴(kuò)展共軛，形成無(wú)色甲醇假堿和查爾酮，逐漸顯示出黃素陽(yáng)離子的本色，紅色[42]，表現(xiàn)為指示膜在24 h內(nèi)以黃色/紅色系為主（圖5a）。因此，在貯存時(shí)間達(dá)9 h時(shí)，指示膜與前一個(gè)相鄰貯存時(shí)間的色差值為10.27，與初始膜的色差為18.52；貯藏時(shí)間達(dá)12 h后指示膜與初始膜的色差值繼續(xù)增大，巴氏殺菌乳的酸度值已經(jīng)超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的范圍12～18 °T[43]，菌落總數(shù)也超過(guò)了50 000 CFU/mL[43]，巴氏殺菌乳呈不新鮮狀態(tài)，指示膜的顏色由綠變紅。黃正農(nóng)等[44]提取甘藍(lán)紅添加到塔拉膠膜基質(zhì)中，制備指示膜研究其在巴氏殺菌乳體系中的應(yīng)用時(shí)，與本研究結(jié)果相似。本研究中，當(dāng)貯存時(shí)間超過(guò)18 h后，巴氏殺菌乳出現(xiàn)凝乳狀態(tài)，已經(jīng)完全變質(zhì)，同時(shí)pH值顯著下降，酸度值上升，菌落總數(shù)超過(guò)國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)[43]，巴氏殺菌乳發(fā)出酸敗氣味，指示膜紅色加深，Δ值為17.33，視覺(jué)觀察明顯。通常情況下，色差大于5即可肉眼識(shí)別[14]，本研究中指示膜與初始膜的色差值均大于5，表明色差可見(jiàn)。根據(jù)前人的研究成果，包含有葡萄皮紅花青素的pH指示膜在監(jiān)測(cè)新鮮牛奶和變質(zhì)牛奶時(shí)的顏色分別為黃色、略深和略紅，與本文的研究結(jié)果有相似之處[45]。表明本研究具有一定的科學(xué)性和實(shí)踐價(jià)值。

3 結(jié) 論

1）紫甘藍(lán)花青素（Purple Cabbage Anthocyanins，PCA）加入大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）中，與SPI通過(guò)氫鍵和靜電相互作用交聯(lián)，提高了PCA/SPI指示膜的機(jī)械性能。PCA添加量為4%較為合適，與不添加PCA的SPI/Na2SO4膜相比，添加了4%花青素的指示膜拉伸強(qiáng)度上升了53.25%，斷裂伸長(zhǎng)率上升了25.25%。

2）相比較于 SPI 膜，含PCA的指示膜熱穩(wěn)定性增強(qiáng)不明顯。PCA在SPI內(nèi)融合均勻，但在膜表面分布不均。

3）指示膜具備良好的透明度和環(huán)境穩(wěn)定性，5 d內(nèi)色差不可見(jiàn)。pH敏感性強(qiáng)，在不同的pH值環(huán)境下色差可見(jiàn)。

4）指示膜在巴氏殺菌乳新鮮度檢測(cè)中應(yīng)用效果良好，隨著巴氏殺菌乳腐敗變質(zhì)，指示膜與原膜的色差均大于5，色差可見(jiàn)。該指示膜具有作為指示標(biāo)簽用于牛乳新鮮度可視化監(jiān)測(cè)的潛能。

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Preparation of intelligent indicator film based on purple cabbage anthocyanidin for monitoring milk freshness

Chen Saiyan1, Zhao Zhenghe1, Xu Xiaoqing1, Yu Huirong1, He Binbin1, Liu Wei1, Wang Luyao1, Ji Junjie2

(1.,,625014,; 2.,250200,)

A pH-colorimetric film is one of the most important indicators to acquire straightforward information by the visible color changes without opening packages in the food industry. Among them, purple cabbage anthocyanins (PCA) can be expected to serve as a natural anthocyanin pigment with high pH sensitivity. Different color changes can be easily observed in the pH variation, due to the unique structure. The PCA color can be changed from dark to light red in the acid solutions (pH=2-4) as the dominant flavylium cation. At pH level of 5-6, the flavylium cation can react with the hydrogen, and then transform into the carbinol pseudobase (colorless) or chalcone (colorless) and appeared pink. The quinoidal base can also be established with the increase of pH (7-8). Subsequently, the anion quinoidal (blue) is dominant in the alkalinity pH (9-10). The color can turn greenish-blue for the anionic quinoidal base (blue) that is synthesized at pH 11. Soy Protein Isolate (SPI) (a byproduct of the soybean oil industry) can be used to characterize by its low cost, high biodegradability, biocompatible, and excellent film-forming properties. Also, the SPI, as a natural material is easy to fuse with the purple cabbage anthocyanins. Hence, the SPI can be selected as a film-forming material. However, the SPI films share relatively low mechanical properties and thermal stability, due to the hydrophilic bonds (-OH, -NH2, -COOH, and -SH) in the film matrix. The typical C6-C3-C6 carbon skeleton structure in anthocyanins can contain two benzoyl rings and oxygenated hexameric heterocycles with the cations (a typical 2-phenyl-benzopyran cation structure). Two typical and highly reactive structural in the PCA molecules can cross-link with the SPI molecules via the hydrogen bonds and electrostatic interactions, in order to form the homogeneity and low surface roughness of films, due mainly to the excellent fusibility and compatibility of PCA and SPI, indicating the improved mechanical properties and pH sensitivity of SPI/PCA indicator films. Therefore, this study aims to synthesize the SPI/PCA-based pH-indicator films with a uniform structure, excellent mechanical properties, and strong pH sensitivity, and then apply them to monitor the freshness of pasteurized milk. FTIR and SEM demonstrated that the PCA was successfully dispersed in the SPI film matrix, and then interacted with the SPI molecules under electrostatic interactions and hydrogen bonds. In SEM micro graphs, the number of small particles was observed to float on the surface, while small holes were in the section of indicator films with the overdose PCA. The highest limitation of the fusion degree of PCA with SPI was 4%. PCA significantly enhanced the mechanical properties of indicator films. The tensile strength of indicator films increased by 53.25% (from 2.46 to 3.77 MPa), and the elongation at break increased by 25.25% (from 105.36% to 131.96%), compared with the SPI/Na2SO4film. The thermal stability of indicator films with the PCA was similar to the SPI films (167 to 194℃). The color difference (Δ) of indicator films with the PCA from the standard white increased from 21.13 to 52.88. L value, where the indicator film was yellowish-green. The indicator films presented strong chromatic stability without the visible color difference within 5 days at room temperature. A high pH sensitivity was found with the visible color difference under different pH values. Two properties were beneficial to monitor the freshness of the indicator film. The indicator films were also applied to monitor the milk. The color was then changed from green to red, together with the freshness deterioration of pasteurized milk. Also, the color difference with the initial film was visibility (Δ≥5) at any time. Hence, purple cabbage anthocyanins were used to promote the indicator function of pure SPI films. The indicator films can be used to monitor the freshness of pasteurized milk via color change. Therefore, the indicator films can be widely expected to apply in intelligent packaging, due mainly to excellent pH-sensitive properties and color stability. The finding can provide insightful ideas to design and produce SPI/PCA-based pH-indicator films.

film; packaging; soy protein isolate; purple cabbage anthocyanins; pH indicator film; freshness monitoring; pasteurized milk

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.24.025

TS206.4

A

1002-6819(2022)-24-0228-09

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Chen Saiyan, Zhao Zhenghe, Xu Xiaoqing, et al. Preparation of intelligent indicator film based on purple cabbage anthocyanidin for monitoring milk freshness[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(24): 228-236. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.24.025 http://www.tcsae.org

2022-08-01

2022-09-27

四川省科技廳創(chuàng)新苗子工程資助項(xiàng)目（2021106）和四川省科技廳項(xiàng)目（2020YFN0147）資助

陳賽艷，博士，講師，研究方向?yàn)橹悄芑b材料。Email：ssdj1102@163.com