達(dá)格列凈對(duì)高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響

汪 洋，王 可，劉寶蘭

0引言

據(jù)調(diào)查研究顯示，截止2035年全球糖尿病發(fā)病率將增加55%，7次全國(guó)性糖尿病調(diào)查中，我國(guó)糖尿病發(fā)病率增長(zhǎng)了17倍，糖尿病可引起多種并發(fā)癥，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變是其主要并發(fā)癥之一，視網(wǎng)膜血管病變、視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變等是糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要臨床表現(xiàn)[1-4]。達(dá)格列凈屬于鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的抑制劑，可減少機(jī)體對(duì)葡萄糖的吸收，其可用于控制2型糖尿病，但關(guān)于其對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的影響及其作用機(jī)制尚未闡明[5]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O4(Forkhead Box Protein O4，F(xiàn)OXO4)在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平升高，miR-96-5p可靶向FOXO4抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞損傷[6]。但達(dá)格列凈是否可調(diào)控FOXO4而參與高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRVECs)損傷過程尚未可知。因此，本研究采用高糖誘導(dǎo)HRVECs建立細(xì)胞損傷模型，探討達(dá)格列凈對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡、氧化應(yīng)激的影響及其對(duì)FOXO4的調(diào)控作用。

1材料和方法

1.1材料達(dá)格列凈(20191103)購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司；HRVECs購(gòu)自美國(guó)ScienCell；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；pcDNA購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司；SOD(20191002)、MDA(20191005)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；si-NC(UGUCAGUCGAUGCUAGUCGAU)、si-FOXO4(UAGUCAGUCGUAGCUAGUCGAUCG)、pcDNA(CAUGUACGUAGCUGAUC)、pcDNA-FOXO4(AUGUCGAUCGUAGCUAUC)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RIPA裂解液(20190905)、BCA定量檢測(cè)試劑盒(20190506)、ECL試劑(20190916)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人FOXO4多克隆抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組HRVECs細(xì)胞培養(yǎng)后，在6孔板中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)于含5.5mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)液中，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h為正常糖組。HRVECs培養(yǎng)于含25mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)液中，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h[7]為高糖組。HRVECs分別培養(yǎng)于含有不同濃度(1、5、10ng/L)達(dá)格列凈與25mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)液中[8]，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h分別為高糖+達(dá)格列凈低劑量組、高糖+達(dá)格列凈中劑量組、高糖+達(dá)格列凈高劑量組。將si-NC、si-FOXO4分別轉(zhuǎn)染入HRVECs后加入25mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，分別為高糖+si-NC組、高糖+si-FOXO4組。pcDNA、pcDNA-FOXO4分別轉(zhuǎn)染入HRVECs后加入10ng/L達(dá)格列凈與25mmol/L D-葡萄糖的培養(yǎng)液中，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h分別為高糖+達(dá)格列凈高劑量+pcDNA組、高糖+達(dá)格列凈高劑量+pcDNA-FOXO4組。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取各組HRVECs，采用PBS洗滌細(xì)胞后加入0.25%胰蛋白酶，將DMEM培養(yǎng)液加入其中后制備細(xì)胞懸液，將其放入15mL的離心管內(nèi)，1 000r/min轉(zhuǎn)速離心5min后棄上清，將預(yù)冷PBS加入其中后離心棄上清，加入100μL Binding Buffer后分別將5μL Annexin V-FITC與1μL PI染液加入其中，室溫避光孵育15min后將400μL Binding Buffer加入其中，于1h內(nèi)應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3檢測(cè)SOD和MDA的水平嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用反復(fù)凍融法裂解各組HRVECs，用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD的水平，用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA的水平。

1.2.4Westernblot檢測(cè)FOXO4蛋白表達(dá)取各組HRVECs加入500μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒說明書操作檢測(cè)蛋白濃度，將5×SDS上樣緩沖液加入蛋白樣品中，將其置于沸水中煮10min蛋白變性，取50μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳反應(yīng)，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜后使用5%脫脂奶粉封閉2h，分別加入一抗稀釋液(1∶1000)后置于4℃條件下孵育24h，采用TBST洗滌后加入稀釋比為1∶5000的二抗稀釋液，將其置于室溫條件下孵育1h，采用TBST洗滌后滴加ECL顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。同時(shí)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-FOXO4、pcDNA、pcDNA-FOXO4分別轉(zhuǎn)染至HRVECs后按照上述方法檢測(cè)FOXO4蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1達(dá)格列凈對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡的影響各組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常糖組比較，高糖組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+達(dá)格列凈中劑量組、高糖+達(dá)格列凈高劑量組細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 達(dá)格列凈對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡的影響 A:正常糖組;B:高糖組;C:高糖+達(dá)格列凈低劑量組;D:高糖+達(dá)格列凈中劑量組;E:高糖+達(dá)格列凈高劑量組。

2.2達(dá)格列凈對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs氧化應(yīng)激的影響各組SOD和MDA比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常糖組比較，高糖組SOD的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MDA的水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+達(dá)格列凈中劑量組、高糖+達(dá)格列凈高劑量組SOD的水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MDA的水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3達(dá)格列凈對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs中FOXO4蛋白表達(dá)水平的影響各組FOXO4蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常糖組比較，高糖組FOXO4蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+達(dá)格列凈中劑量組、高糖+達(dá)格列凈高劑量組FOXO4蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖2。

圖2 達(dá)格列凈對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs中FOXO4蛋白表達(dá)情況的影響。

表1 達(dá)格列凈對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡和氧化應(yīng)激的影響

2.4FOXO4過表達(dá)和抑制轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)與si-NC組(0.25±0.03)比較，si-FOXO4組FOXO4蛋白表達(dá)水平(0.11±0.01)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.668，P=0.002)；與pcDNA組(0.24±0.03)比較，pcDNA-FOXO4組FOXO4蛋白表達(dá)水平(0.69±0.07)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.234，P=0.001)，見圖3。

圖3 FOXO4蛋白表達(dá)情況。

2.5抑制FOXO4對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡和氧化應(yīng)激的影響與高糖+si-NC組比較，高糖+si-FOXO4組細(xì)胞凋亡率降低，SOD的水平升高，MDA的水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2，圖4。

表2 抑制FOXO4對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡和氧化應(yīng)激的影響

圖4 抑制FOXO4對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡和FOXO4蛋白表達(dá)的影響 A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；B：Western blot檢測(cè)FOXO4蛋白表達(dá)量。

2.6過表達(dá)FOXO4對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡和氧化應(yīng)激的影響與高糖+達(dá)格列凈高劑量+pcDNA組比較，高糖+達(dá)格列凈高劑量+pcDNA-FOXO4組凋亡率升高，SOD的水平降低，MDA的水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3，圖5。

表3 過表達(dá)FOXO4對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡和氧化應(yīng)激的影響

圖5 過表達(dá)FOXO4對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡及FOXO4蛋白表達(dá)的影響 A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；B：Western blot檢測(cè)FOXO4蛋白表達(dá)量。

3討論

體內(nèi)持續(xù)高糖水平是誘導(dǎo)患者視網(wǎng)膜病變的重要原因之一，氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等是促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要誘導(dǎo)因素，目前糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因而深入探究糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制，以及研發(fā)有效預(yù)防及治療藥物均具有重要意義，既往研究證實(shí)，天麻素通過調(diào)節(jié)SIRT1/TLR4/NF-κBp65信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[9]。山奈酚靶向雌激素相關(guān)受體α，并在高葡萄糖條件下抑制人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成[10]。綠原酸可通過降低VEGF的表達(dá)并抑制VEGF介導(dǎo)的視網(wǎng)膜新血管生成而減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變[11]。但仍有部分藥物對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制尚未闡明。

達(dá)格列凈是一種新型的降糖制劑，其具有降壓、降血糖等作用，并可預(yù)防及減輕糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展[12]。達(dá)格列凈可明顯改善糖尿病心肌缺血大鼠心功能，并可恢復(fù)其心肌及血管功能[13]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的HRVECs凋亡率升高，而達(dá)格列凈可明顯降低高糖誘導(dǎo)的HRVECs凋亡率，且達(dá)格列凈高劑量細(xì)胞凋亡率明顯低于達(dá)格列凈中劑量組，提示達(dá)格列凈可抑制高糖誘導(dǎo)的HRVECs凋亡。氧化應(yīng)激是高糖誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的重要原因之一，SOD屬于抗氧化酶，若MDA等過氧化酶類生成量過多可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而通過一系列通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14-15]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的HRVECs中SOD的水平降低，MDA的水平升高，與上述研究報(bào)道結(jié)果相似，而達(dá)格列凈可明顯提高高糖誘導(dǎo)的HRVECs中SOD的水平，降低MDA的水平，且達(dá)格列凈中劑量組、達(dá)格列凈高劑量組間SOD、MDA的水平比較具有明顯差異，提示達(dá)格列凈可抑制高糖誘導(dǎo)的HRVECs氧化應(yīng)激而抑制細(xì)胞凋亡從而減輕細(xì)胞損傷。

為進(jìn)一步探究達(dá)格列凈治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制，本研究采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FOXO4的表達(dá)量，本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的HRVECs中FOXO4蛋白水平升高，而達(dá)格列凈可明顯降低高糖誘導(dǎo)的HRVECs中FOXO4蛋白水平，且達(dá)格列凈高劑量組FOXO4蛋白水平明顯低于達(dá)格列凈中劑量組，提示達(dá)格列凈可能通過下調(diào)FOXO4而發(fā)揮作用。FOXO4屬于叉頭框蛋白家族成員，其可通過影響細(xì)胞生物學(xué)行為而發(fā)揮作用，研究表明FOXO4表達(dá)異常與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)，糖尿病視網(wǎng)膜病變中FOXO4的表達(dá)水平升高，抑制FOXO4表達(dá)可明顯降低高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激及抑制細(xì)胞凋亡[16]。FOXO4高表達(dá)可促進(jìn)心肌梗塞后的早期炎癥反應(yīng)[17]。miR-328-3p通過靶向FOXO4減輕低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，pcDNA組是空載體，是過表達(dá)的對(duì)照，F(xiàn)OXO4過表達(dá)與達(dá)格列凈高劑量聯(lián)合處理高糖誘導(dǎo)的HRVECs，結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率升高，SOD的水平降低，而MDA的水平升高，提示FOXO4過表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)達(dá)格列凈對(duì)高糖誘導(dǎo)HRVECs凋亡及氧化應(yīng)激的作用。

綜上所述，達(dá)格列凈可通過抑制FOXO4的表達(dá)而抑制高糖誘導(dǎo)的HRVECs氧化應(yīng)激及抑制細(xì)胞凋亡從而減輕細(xì)胞損傷，F(xiàn)OXO4可能作為達(dá)格列凈治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在靶標(biāo)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。