microRNAs在糖尿病視網(wǎng)膜病變中作用的研究進(jìn)展

朱安民，譚 薇

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的一種常見并發(fā)癥，也是老年人視力喪失的主要原因[1]。在所有患有糖尿病≥20a的患者中，高達(dá)80%的患者會(huì)受到DR的影響[2]。在一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)10a的大型前瞻性隊(duì)列研究中，首次診斷為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)時(shí)，糖尿病病程平均為14.8a，但進(jìn)展至中至重度NPDR和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)的速度非?？?，約在診斷為輕度NPDR后的2～3a內(nèi)發(fā)生[3]。以上數(shù)據(jù)均提示及早發(fā)現(xiàn)DR的必要性，以降低這種疾病的高發(fā)病率。此外，目前DR的治療主要針對(duì)DR引起的血管病變且療效有限[4]，DR早期的神經(jīng)病變尚無(wú)有效的治療方法[5]。研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的microRNAs(miRNAs)與DR的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[6]，因此更深入了解循環(huán)中的miRNAs在DR中的作用，可能對(duì)及早診斷DR、監(jiān)測(cè)DR的嚴(yán)重程度及治療DR有重要的意義。

1 miRNAs與DR

miRNAs是一種具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能的非編碼小RNA分子，約由19～25個(gè)核苷酸組成[7]。miRNAs可以通過使mRNA翻譯受阻或者過表達(dá)參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控[8]，最終導(dǎo)致靶蛋白表達(dá)減少，從而影響細(xì)胞發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、凋亡和新陳代謝等生理及病理過程[9]。最近的研究表明，miRNAs可以在包括血清、血漿在內(nèi)的許多生物液中由細(xì)胞和組織釋放[10]，稱為循環(huán)miRNAs。循環(huán)miRNAs可以經(jīng)受反復(fù)的冷凍/解凍循環(huán)和RNA酶處理，其顯著穩(wěn)定性增加了它們作為疾病生物標(biāo)志物的可能性。miRNAs目前被認(rèn)為是新的疾病生物標(biāo)志物和開發(fā)新干預(yù)措施的潛在治療靶點(diǎn)[11-12]。異常的循環(huán)miRNAs最初發(fā)現(xiàn)于癌癥患者[13]，如今已擴(kuò)展到其他疾病，包括DR[14]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，循環(huán)miRNAs表達(dá)水平可用于DR的診斷，具有較高的敏感性和特異性，可能為DR的篩查提供一種新的微創(chuàng)生物標(biāo)志物[15]。循環(huán)miRNAs在糖尿病的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，它們可能是監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展的一種比目前可用的工具更敏感的方法[16]。另外，miRNAs在疾病的發(fā)病機(jī)制中也具有重要的功能[17]，如miRNAs參與DR相關(guān)的新生血管形成[18]，通過調(diào)節(jié)miRNAs表達(dá)水平可能能夠延緩DR進(jìn)展[19]。

2 miRNAs用于診斷DR及治療

2.1在血清中

2.1.1hsa-let-7a-5p和hsa-miR-newchr5_15976及hsa-miR-28-3p Liang等[20]首先通過RNA-seq和RT-qPCR方法在2型糖尿病伴視網(wǎng)膜病變(type 2 diabetes mellitus with diabetic retinopathy，T2DM-DR)、2型糖尿病不伴視網(wǎng)膜病變(type 2 diabetes mellitus without diabetic retinopathy，T2DM-no-DR)的患者和健康對(duì)照者之間篩選出與T2DM-DR顯著相關(guān)的miRNAs。然后通過受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評(píng)價(jià)候選miRNAs的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)3種miRNAs(hsa-let-7a-5p、hsa-miR-newchr5_15976和hsa-miR-28-3p)組合鑒別T2DM-DR和T2DM-no-DR的ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)值為0.937(敏感性92.3%，特異性95.0%)，提示其具有較高的診斷準(zhǔn)確性，能夠作為診斷DR的生物標(biāo)志物。此外，他們還發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的hsa-let-7a-5p在人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs)中過表達(dá)可顯著提高HRMECs的增殖率，抑制hsa-let-7a-5p可能是治療DR的新型治療靶點(diǎn)，而hsa-miR-newchr5_15976和hsa-miR-28-3p需進(jìn)一步研究來(lái)闡明在DR發(fā)病機(jī)制中的詳細(xì)分子機(jī)制。

2.1.2miR-2116-5p和miR-3197 Ji等[21]在包括45例T2DM-DR患者和45例T2DM-no-DR患者的研究中，發(fā)現(xiàn)T2DM-DR患者中的miR-2116-5p和miR-3197的表達(dá)與T2DM-no-DR患者相比顯著上調(diào)，AUC值分別為0.765(敏感性93.3%，特異性91.1%)和0.966(敏感性62.2%，特異性77.8%)，兩種miRNAs組合后的AUC值高達(dá)0.972(敏感性97.8%，特異性88.9%)，提示miR-2116-5p對(duì)DR的診斷具有一定準(zhǔn)確性，miR-3197對(duì)DR的診斷準(zhǔn)確率較高，兩種miRNAs組合后對(duì)DR的診斷準(zhǔn)確率更高。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)miR-2116-5p的靶基因是notch同源2(notch homolog 2，NOTCH2)，需進(jìn)一步驗(yàn)證miR-2116-5p是否通過調(diào)控NOTCH2參與DR發(fā)病。miR-3197在DR發(fā)病機(jī)制中的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.1.3早期診斷研究發(fā)現(xiàn)3種miRNAs(hsa-let-7a-5p、hsa-miR-28-3p和hsa-miR-newchr5_15976)組合后在區(qū)分T2DM-NPDR和T2DM-no-DR時(shí)AUC值為0.901(敏感性87.5%，特異性92.7%)，診斷早期DR的準(zhǔn)確性較高，提示可作為早期診斷DR的標(biāo)志物[20]。Li等[22]分別從10例T2DM-NPDR和11例T2DM-no-DR患者的空腹外周血清中提取miRNAs，并通過RNA-seq進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)miR-4448、miR-338-3p、miR-485-5p和miR-9-5p在DR患者血清中表達(dá)下調(diào)，miR-190a-5p表達(dá)上調(diào)，通過ROC曲線評(píng)估了單個(gè)miRNAs的診斷能力，發(fā)現(xiàn)5種差異表達(dá)的miRNAs的AUC值均大于0.70，其中miR-4448和miR-9-5p的AUC值最高(0.836)。然后利用5個(gè)差異表達(dá)的miRNAs構(gòu)建了加權(quán)多基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)多基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)測(cè)能力具有較高的準(zhǔn)確性(AUC=0.909)。另外，這些miRNAs被認(rèn)為控制了血管的生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生，表明它們既可以作為早期DR風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，也可以作為探索DR分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)的工具。Greco等[23]研究納入5例T2DM-NPDR患者和5例T2DM-no-DR患者，通過RT-qPCR和ROC曲線進(jìn)行了最相關(guān)miRNAs的驗(yàn)證和診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)，研究結(jié)果表明差異表達(dá)的miR-1281診斷NPDR的AUC值為0.965，診斷準(zhǔn)確率較高，提示其可用于DR早期的檢測(cè)。同時(shí)他們?cè)谌艘暰W(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal vascular endothelial cells，HUVECs)中發(fā)現(xiàn)miR-1281可以通過上調(diào)血管內(nèi)皮生成因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)的表達(dá)在DR的發(fā)生發(fā)展中起到致病作用，調(diào)節(jié)miR-1281的水平可能延緩DR的進(jìn)展。目前miRNAs在DR早期診斷和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)方面的研究較少，闡明miRNAs在DR早期診斷中的作用將對(duì)及早發(fā)現(xiàn)DR帶來(lái)巨大的幫助。

2.2在血漿中

2.2.1miR-93 Zou等[24]應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)75例T2DM-DR患者、65例T2DM-no-DR患者和127例健康對(duì)照者的miR-93表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)T2DM-DR組miR-93水平明顯高于T2DM-no-DR組和健康對(duì)照者，ROC曲線分析顯示AUC值為0.866(敏感性73.33%，特異性89.24%)，證明miR-93表達(dá)對(duì)診斷T2DM-DR具有一定的診斷準(zhǔn)確性。另外，研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-93的表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithelium，HRPE)細(xì)胞凋亡[25]，提示miR-93可能是新的治療靶點(diǎn)。

2.2.2miR-320a Prado等[26]采用RT-qPCR方法檢測(cè)62例DM-DR患者、48例DM-no-DR患者以及60例健康人的候選miRNAs的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與DM-no-DR患者和健康受試者相比，DR患者的循環(huán)血漿miR-320a水平顯著下調(diào)。但未對(duì)miR-320a的診斷性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，因此其可能是診斷DR的一種生物標(biāo)志物。有學(xué)者提出miR-320a可抑制Müller細(xì)胞水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)的表達(dá)進(jìn)而減輕Müller細(xì)胞的缺氧損傷，提示miR-320a可能通過抑制AQP4的表達(dá)成為DR治療的潛在靶點(diǎn)[27]。

2.2.3miR-25-3p和miR-320B及miR-495-3p Santovito等[28]將20例T2DM-DR患者與10例T2DM-no-DR患者和10例健康對(duì)照者的血漿miRNAs表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在T2DM-DR患者中miR-25-3p和miR-320B顯著上調(diào)，而miR-495-3p顯著下調(diào)。這些miRNAs組合后的AUC值為0.931(敏感性85%，特異性85%)，對(duì)DR的診斷具有較高的準(zhǔn)確性。但是這些miRNAs具體通過哪種途徑參與了DR的發(fā)病，目前還尚不清楚。

上述關(guān)于miRNAs在血清、血漿研究中的DR患者的納入標(biāo)準(zhǔn)均包括NPDR和PDR患者，DR患者與無(wú)糖尿病視網(wǎng)膜病變的糖尿病(no diabetic retinopathy，NDR)患者和健康受試者相比較，差異表達(dá)的miRNAs可用于診斷DR，但不能對(duì)早期DR進(jìn)行診斷。早期診斷需鑒定出NPDR和NDR患者之間差異表達(dá)的miRNAs。

3 miRNAs用于監(jiān)測(cè)DR進(jìn)展及治療

目前，眼底熒光血管造影(fundus fluorescence angiography，F(xiàn)FA)是診斷不同階段DR的金標(biāo)準(zhǔn)，這是一種侵入性操作，會(huì)給患者帶來(lái)不適，要在較大范圍內(nèi)進(jìn)行FFA檢查是很困難的[29]。血清和血漿中的某些miRNAs被認(rèn)為可以監(jiān)測(cè)DR的進(jìn)展且具有治療意義。

3.1在血清中

3.1.1miR-20b和miR-17-3p Shaker等[30]研究納入30例NDR患者、50例DR患者(30例NPDR患者、20例PDR患者)和81例健康受試者，用RT-qPCR、ROC曲線分別檢測(cè)和評(píng)價(jià)血清miR-20b、miR-17-3p的表達(dá)和診斷價(jià)值，分析表明miR-20b、miR-17-3p可區(qū)分NDR患者和健康對(duì)照者，AUC值分別為0.858(敏感性66.7%，特異性100.0%)和0.678(敏感性為73.3%，特異性為69.2%)，區(qū)分DR(包括NPDR和PDR)和NDR患者的AUC值分別為0.636(敏感性為62.0%，特異性為60.0%)和0.821(敏感性為92.0%，特異性為56.7%)，區(qū)分PDR和NPDR患者的AUC值分別為0.701(敏感性為70.0%，特異性為76.7%)和0.550(敏感性為50.0%，特異性為80.0%)。另外，研究發(fā)現(xiàn)miR-20b可能通過抑制AKT3的表達(dá)阻止高糖條件下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮通透性增加和新生血管形成[31]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外源miRNA-17-3p能夠通過抑制STAT1抑制DR小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡[32]。表明miR-20b、miR-17-3p既能診斷DR，也可監(jiān)測(cè)DR的進(jìn)展，且對(duì)DR具有治療意義。

3.1.2miR-210 Yin等[33]研究了40例NDR患者，110例DR患者(60例NPDR患者、50例PDR患者)和60例健康對(duì)照者，發(fā)現(xiàn)T2DM-DR患者血清miR-210的表達(dá)上調(diào)，區(qū)分DR(包括NPDR和PDR)患者和健康對(duì)照者的AUC值為0.991(敏感性95.5%，特異性95.0%)，區(qū)分DR和NDR患者的AUC值為0.892(敏感性為83.6%，特異性為80.0%)，區(qū)分PDR和NPDR患者的AUC值分別為0.810(敏感性為82.0%，特異性為75.0%)，升高的血清miR-210可用于診斷DR及監(jiān)測(cè)DR的進(jìn)展。此外，他們發(fā)現(xiàn)miR-210的過表達(dá)促進(jìn)HUVECs增殖，而在高葡萄糖條件下抑制miR-210產(chǎn)生相反的作用，提示抑制miR-210可能是DR新的治療靶點(diǎn)。

3.1.3miR-21和miR-181c及miR-1179 Qing等[34]收集90例NPDR患者、90例PDR患者和20例健康受試者的血清標(biāo)本，通過RT-qPCR對(duì)候選miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)PDR患者miR-21、miR-181c和miR-1179的表達(dá)均明顯高于NPDR患者和健康受試者，AUC值分別為0.830、0.803和0.873。miR-21、miR-181c和miR-1179組合后AUC值更高(0.89)。提示3種miRNAs可區(qū)分PDR和NPDR進(jìn)而用于監(jiān)測(cè)DR的進(jìn)展且組合后AUC值更高。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-21的過表達(dá)可能通過抑制PTEN的表達(dá)而激活PI3K/Akt/VEGF信號(hào)通路，從而刺激DR大鼠的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞活性和血管生成[35]。因此miR-21具有作為DR治療靶點(diǎn)的潛力，而miR-181c和miR-1179在DR發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。

3.1.4miR-122 Pastukh等[36]為了解DR不同階段血清miRNAs水平變化情況，采用RT-qPCR方法對(duì)候選miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-122水平隨著視網(wǎng)膜病變嚴(yán)重程度的增加而增加，從健康人到NDR，從NDR到NPDR。但當(dāng)疾病進(jìn)展到PDR時(shí)，miR-122水平明顯下降。miR-122的診斷價(jià)值未得到驗(yàn)證，其可能作為新的生物標(biāo)志物用于監(jiān)測(cè)DR的進(jìn)展。另外，Wang等[37]首次證實(shí)了miR-122通過抑制TIMP3的表達(dá)促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HRPE細(xì)胞的凋亡，使miR-122成為DR治療的一個(gè)有前途的靶點(diǎn)。

3.2在血漿中

3.2.1miR-21 Jiang等[38]研究納入65例NDR、124例DR(73例NPDR、51例PDR)的T2DM患者和115例健康對(duì)照者，首先采用RT-qPCR檢測(cè)，與健康對(duì)照組相比，NDR組的miR-21無(wú)明顯差異，NPDR組和PDR組miR-21的表達(dá)顯著升高。此外，PDR組miR-21的表達(dá)明顯高于NPDR組。ROC曲線分析miR-21對(duì)DR和PDR的診斷價(jià)值，AUC值分別為0.825(敏感性為66.1%，特異性為90.4%)和0.830(敏感性72.5%，特異度79.5%)。表明血漿miR-21表達(dá)水平可作為判斷DR嚴(yán)重程度的指標(biāo)且對(duì)DR和PDR具有一定診斷價(jià)值。

3.2.2miR-126 Liu等[39]發(fā)現(xiàn)在血漿中，特發(fā)性黃斑裂孔組患者的miR-126的表達(dá)水平明顯低于T2DM-PDR Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期組，T2DM-PDR Ⅳ期組的miR-126表達(dá)水平明顯低于T2DM-PDR Ⅴ期組和T2DM-PDR Ⅵ期組，Ⅴ期組的miR-126表達(dá)水平明顯低于Ⅵ期組。由于未進(jìn)行診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)，僅提示miR-126可能作為監(jiān)測(cè)PDR病情進(jìn)展的重要指標(biāo)。另一項(xiàng)研究中，miR-126通過下調(diào)PLk4的表達(dá)抑制HRMECs增殖和遷移從而延緩DR的進(jìn)展[40]，表明過表達(dá)miR-126可能是DR的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，循環(huán)miRNAs作為非侵入性生物標(biāo)志物用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)DR的進(jìn)展、診斷不同時(shí)期的DR。早期篩查和有效診斷對(duì)避免DR進(jìn)展至更嚴(yán)重的晚期具有重要幫助，另外循環(huán)miRNAs的突出為延緩DR的進(jìn)展提供了新的思路。

4總結(jié)與展望

循環(huán)miRNAs作為DR的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)可及早地發(fā)現(xiàn)糖尿病引起的眼部損害，并更早地治療DR，從而防止糖尿病患者的視力喪失。值得注意的是，某些miRNAs既能作為診斷DR的標(biāo)志物，又能早期診斷DR和/或監(jiān)測(cè)DR的進(jìn)展；某些miRNAs既能在血清中差異表達(dá)，又能在血漿中差異表達(dá)。為了在糖尿病患者的臨床環(huán)境中全面驗(yàn)證這些結(jié)果，還需要對(duì)更多患者進(jìn)行進(jìn)一步的研究。單一的生物標(biāo)志物本身對(duì)疾病的診斷和預(yù)測(cè)不夠敏感或特異，聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)標(biāo)志物可提高特異性或診斷能力，這需要在未來(lái)的研究中得到更多的驗(yàn)證。進(jìn)一步探索miRNAs治療DR的有效性，開發(fā)對(duì)人類安全、有效和耐受的miRNAs制劑將對(duì)DR的正確治療產(chǎn)生積極影響。