木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因在軟籽和硬籽石榴中的表達(dá)及代謝物分析

史江莉， 王颯， 王磊， 仝瑞冉， 王森， 胡青霞， 萬(wàn)然， 簡(jiǎn)在海， 鄭先波， 陳延惠

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/河南省果樹(shù)瓜類(lèi)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

石榴是千屈菜科(Lytharceae)石榴屬(PunicagranatumL．)落葉灌木或小喬木[1-2]，富含類(lèi)黃酮、花青苷、鞣花單寧、酚酸等抗氧化活性物質(zhì)，對(duì)人類(lèi)健康具有醫(yī)療和保健功效[3-7]。石榴的可食用部位是籽粒，包含假種皮、種皮、種仁3部分。石榴根據(jù)種皮的硬度差異，國(guó)內(nèi)外有不同的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。陸麗娟等[8]將其分為軟籽(<3.67 kg·cm-2)、半軟籽(3.67～4.2 kg·cm-2)和硬籽石榴(>4.2 kg·cm-2)3類(lèi)。ZAREI等[9]將其分為4類(lèi)，即軟籽(8.16～15.31 kg·cm-2)，半軟籽(20.41～22.45 kg·cm-2)，半硬籽(30.61～42.86 kg·cm-2)，硬籽(45.92～64.29 kg·cm-2)。由于品種、儀器及測(cè)試者個(gè)人力度差異等因素的影響，石榴硬度分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)存在較大差異。種子硬度作為鮮食品質(zhì)的重要指標(biāo)，直接影響石榴的可食性和消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)意向。硬籽石榴的種皮木質(zhì)素含量較高，不方便食用，而軟籽石榴的種皮木質(zhì)素含量較低，可直接食用，無(wú)需吐渣，更受消費(fèi)者的青睞[10-11]，尤其是風(fēng)靡全國(guó)各地的軟籽石榴品種‘突尼斯軟籽’石榴[12-13]。軟籽石榴在生產(chǎn)與消費(fèi)市場(chǎng)潛力巨大，也是珍貴的石榴種質(zhì)資源，成為石榴育種的重要方向。

木質(zhì)素作為植物細(xì)胞壁的重要組分，不僅能增強(qiáng)植物體機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞壁的硬度，并且在抵御逆境脅迫方面也發(fā)揮重要作用[14]。但是，石榴種子硬度與木質(zhì)素含量密切相關(guān)，木質(zhì)素的含量越高，種子硬度越高，并且硬籽石榴種子中的木質(zhì)素含量高于軟籽石榴[10,15-17]，因此，調(diào)節(jié)木質(zhì)素的生物合成是降低石榴籽粒硬度，培育軟籽石榴新種質(zhì)的重要途徑。目前，木質(zhì)素生物合成途徑已被闡明，木質(zhì)素是植物苯丙氨酸代謝途徑中的次生代謝產(chǎn)物。以苯丙氨酸為起點(diǎn)，經(jīng)過(guò)一系列脫氨基、羥基化、甲基化等反應(yīng)，生成木質(zhì)素單體，即，對(duì)香豆醇(p-coumaryl alcohols)、松柏醇(coniferyl alcohols)和芥子醇(sinapyl alcohols)，再進(jìn)一步氧化，聚合生成對(duì)-羥基苯基木質(zhì)素(H木質(zhì)素)、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G木質(zhì)素)和紫丁香基木質(zhì)素(S木質(zhì)素)3種木質(zhì)素。在雙子葉植物中，木質(zhì)素主要有兩種，即S木質(zhì)素和G木質(zhì)素[18-20]。ZAREI等[16]通過(guò)對(duì)比軟籽石榴和硬籽石榴的種子不同發(fā)育階段與細(xì)胞壁形成相關(guān)的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)S單體含量越高，種皮越柔軟，S/G單體比例的差異可能是石榴種子軟化的主要原因。QIN等[11]通過(guò)對(duì)比石榴種子發(fā)育不同階段的木質(zhì)素合成途徑中代謝物的累積，發(fā)現(xiàn)松柏醇和芥子醇在石榴種皮中大量累積，并且S和G是石榴種皮中主要的木質(zhì)素單體。然而，木質(zhì)化是一個(gè)復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的生物學(xué)過(guò)程，其生物合成途徑包含12種酶，受許多基因和代謝物的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[21]。其中，轉(zhuǎn)錄因子家族WRKY、MYB、NAC的基因成員參與木質(zhì)素代謝，在硬籽石榴中的表達(dá)水平高于軟籽石榴，從而調(diào)控植物木質(zhì)素的生物合成[10]。軟籽石榴和硬籽石榴的蛋白組學(xué)的對(duì)比研究還表明，木質(zhì)素生物合成相關(guān)的差異表達(dá)蛋白在軟籽石榴品種花后60 d表達(dá)水平較低[17]。

與硬籽石榴相比，軟籽石榴不僅品種資源較少，研究基礎(chǔ)較薄弱，而且木質(zhì)素生物合成在不同籽粒硬度品種中的差異尚不清晰。因此，本研究通過(guò)對(duì)比分析硬籽石榴‘泰山紅’和軟籽石榴‘突尼斯軟籽’在種子發(fā)育期的種子硬度、木質(zhì)素含量差異、木質(zhì)素代謝途徑的12個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)，并結(jié)合成熟種子中代謝物的富集差異，探究石榴種子硬度形成機(jī)制，進(jìn)而挖掘降低種子木質(zhì)素含量的優(yōu)異基因，為培育軟籽石榴新種質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’石榴種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹(shù)試驗(yàn)站，位于(河南省鄭州市金水區(qū)(34.46°N；113.40°E)。2019年分別采集‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’新梢上幼嫩的莖和葉片，并于盛花期后30、45、70、120 d 4個(gè)種子發(fā)育時(shí)期各采集6個(gè)果實(shí)(大小一致、著色相同、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)損傷)，立即帶至河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，用游標(biāo)卡尺測(cè)定果實(shí)的橫徑和縱徑(保留兩位小數(shù)，3次重復(fù)，計(jì)算平均值)；果實(shí)切開(kāi)，隨機(jī)混合籽粒，去掉假種皮，分為兩組。一組用于測(cè)定種子硬度、木質(zhì)素含量等。另一組種子及葉片和莖迅速于液氮中冷凍，并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱，用于木質(zhì)素途徑小分子物質(zhì)檢測(cè)及相關(guān)分子試驗(yàn)。

1.2 種子硬度和木質(zhì)素含量的測(cè)定

采用數(shù)顯GY-4果實(shí)硬度計(jì)(艾德堡儀器有限公司，浙江省樂(lè)清市)分別測(cè)定20粒石榴種子硬度，3次重復(fù)，計(jì)算平均值，單位為kg·cm-2，將石榴種子于80 ℃烘干至質(zhì)量恒定，粉碎并過(guò)0.425 mm孔徑的篩子，稱(chēng)取2 mg，參照木質(zhì)素含量試劑盒說(shuō)明書(shū)(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，浙江省)，測(cè)定木質(zhì)素含量，3次重復(fù)。

1.3 木質(zhì)素代謝過(guò)程中小分子物質(zhì)的測(cè)定

‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’盛花期后120 d的成熟種子送武漢邁特維爾生物科技有限公司，采用超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC；Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)和串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem Mass Spectrometry，MS/MS；Applied Biosystems 4500 QTRAP)聯(lián)用檢測(cè)木質(zhì)素途徑小分子物質(zhì)的含量，3次重復(fù)。樣品提取流程：將石榴的種子樣品進(jìn)行真空冷凍干燥，用研磨儀(MM 400，Retsch)30 Hz研磨1.5 min至粉末狀。稱(chēng)取100 mg種子粉末，溶解于0.6 mL提取液；溶解后的樣品于4 ℃冰箱過(guò)夜，其間渦旋6次；10 000×g離心10 min，吸取上清液，用微孔濾膜(0.22 μm pore size)過(guò)濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。根據(jù) fold change≥2或fold change≤0.5 的標(biāo)準(zhǔn)確定最終差異代謝物。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

石榴種子總RNA提取采用生工柱式植物總RNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，中國(guó))，參照HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國(guó))說(shuō)明書(shū)合成第一鏈cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)采用Applied Biosystems 7500 Fast儀器，95 ℃預(yù)變性5 min，40個(gè)循環(huán)：95 ℃變性10 s，60℃退火和延伸30 s。根據(jù)公式用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[22]。木質(zhì)素代謝途徑12個(gè)關(guān)鍵酶，即PAL(苯丙氨酸解氨酶，phenylalanine ammonialyase)、CAD(肉桂醇脫氫酶，cinnamyl alcohol dehydrogenase)、4CL(4-香豆酸輔酶A連接酶，4-coumarate: CoA ligase)、COMT(咖啡酸鄰位甲基轉(zhuǎn)化酶，caffeic acid O-methyltransferase)、C4H(肉桂酸4-羥化酶，cinnamate 4-hydroxylase)、CCOMT(咖啡酰輔酶A-鄰甲基化轉(zhuǎn)移酶，caffeoyl-CoA O-methyltransferase)、CCR(肉桂酸輔酶A還原酶，cinnamoyl-CoA reductase)、F5H(阿魏酸5-羥化酶，ferulate 5-hydroxylase)、C3H(對(duì)香豆酸3-羥化酶，p-coumaroyl-CoA 3-hydroxylase)、HCT(奎尼酸/莽草酸對(duì)羥化肉桂?；o酶A轉(zhuǎn)移酶，shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase)、POD(過(guò)氧化物酶，peroxidase)、LAC(漆酶，laccase)的基因引物序列見(jiàn)表1。PgActin基因(GenBank Accession No. LOC116200207)作為內(nèi)參。Real-time PCR采用20 μL的反應(yīng)體系：1 μL的反轉(zhuǎn)錄模板；正反向引物各1 μL；10 μL的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國(guó))；7 μL ddH2O。每個(gè)處理3次重復(fù)，計(jì)算平均值。

表1 木質(zhì)素代謝途徑關(guān)鍵基因?qū)崟r(shí)定量PCR特異引物Table 1 Special primers of key genes in lignin metabolism pathway for real-time PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2016分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，SPSS Statistics v.20 (IBM，Chicago，IL，USA)用于數(shù)據(jù)的顯著性分析(P<0.05)。Origin 8軟件繪制坐標(biāo)圖，R軟件 (v 3.5.1)的prcomp函數(shù)繪制主成分分析(PCA)散點(diǎn)圖，TBtools軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同石榴種子發(fā)育時(shí)期的果實(shí)大小及種子硬度和木質(zhì)素含量比較

如圖1-A和1-B所示，隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’果實(shí)的橫徑和縱徑明顯增大。在相同的發(fā)育時(shí)期，‘泰山紅’的果實(shí)比‘突尼斯軟籽’略大，并且，圖1-E的果實(shí)表型觀(guān)察進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)結(jié)果。此外，‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’石榴果實(shí)橫徑在盛花期后120 d具有顯著性差異，而縱徑自盛花期后70 d就具有顯著性差異。

從圖1-C和1-D可以發(fā)現(xiàn)，伴隨著種子發(fā)育和成熟，2個(gè)石榴品種的種子硬度和木質(zhì)素含量均逐漸增加，‘突尼斯軟籽’中始終低于‘泰山紅’，并具有顯著性差異。在盛花期后30 d，‘泰山紅’種子硬度比‘突尼斯軟籽’高1.98 kg·cm-2，木質(zhì)素含量高6.29%；在盛花期后120 d，‘泰山紅’種子硬度比‘突尼斯軟籽’高3.67 kg·cm-2，木質(zhì)素含量高5.14%。石榴種子的硬度和木質(zhì)素含量相關(guān)性分析表明，兩者呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.939(P<0.01)。

2.2 不同品種石榴成熟種子的木質(zhì)素代謝物差異

為探究種子硬度形成的差異和原因，運(yùn)用UPLC-ESI-MS/MS的方法從硬籽石榴‘泰山紅’和軟籽石榴‘突尼斯軟籽’成熟果實(shí)的種子中，共檢測(cè)到木質(zhì)素代謝途徑中的11種代謝物，其中5種為差異代謝物。這11種代謝物的二維PCA散點(diǎn)圖表明，2個(gè)主成分PC1和PC2分別解釋了總變異的68.46%和15.05%(圖2)。‘泰山紅’(H)和‘突尼斯軟籽’(T)的3個(gè)重復(fù)分別聚集在PC1的兩側(cè)，表明該方法穩(wěn)定，樣品重復(fù)性好，并且兩組樣品具有明顯差異。

T：‘突尼斯軟籽’，H：‘泰山紅’。

為進(jìn)一步探究木質(zhì)素代謝途徑中代謝物累積模式，本研究對(duì)比分析了2個(gè)石榴品種成熟期種子中11種代謝物累積差異。如圖3聚類(lèi)熱圖所示，2個(gè)品種被聚為2個(gè)主要分支，左側(cè)為軟籽石榴‘突尼斯軟籽’的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(T1，T2，T3)，右側(cè)為硬籽石榴‘泰山紅’的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(H1，H2，H3)。表明這些代謝物在兩個(gè)品種之間存在顯著差異，并且這個(gè)結(jié)果與圖2的主成分分析結(jié)果一致。同時(shí)，這11種代謝物中，有8種物質(zhì)，包括苯丙氨酸、松柏醛、芥子酸、松柏醇、對(duì)香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、對(duì)香豆醛，在軟籽石榴中的含量高于硬籽石榴。而肉桂酸和芥子醇的含量在2個(gè)石榴品種無(wú)明顯差異。僅有芥子醛的含量在‘突尼斯軟籽’中顯著低于‘泰山紅’。

T：‘突尼斯軟籽’，H：‘泰山紅’

2.3 石榴不同組織中木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)

為解析木質(zhì)素代謝在軟籽石榴和硬籽石榴中的差異，本研究在石榴不同植物組織中，包括葉片(L)、外果皮(P)、種子(S)、莖(M)，檢測(cè)了木質(zhì)素代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)。通過(guò)對(duì)比木質(zhì)素代謝途徑中相關(guān)基因在2個(gè)品種的4種植物組織中的表達(dá)水平(圖4)，發(fā)現(xiàn)PgPAL基因在‘泰山紅’的莖中表達(dá)量最高，且明顯高于‘突尼斯軟籽’，而在‘突尼斯軟籽’的4個(gè)植物組織中，葉片中PgPAL基因表達(dá)量最高。PgC4H和Pg4CL均在2個(gè)品種的葉片中高表達(dá)，并且在‘泰山紅’葉片中的表達(dá)量最高。PgCCR、PgCOMT、PgCCOMT、PgC3H、PgHCT、PgLAC均在石榴莖中表達(dá)量最高，對(duì)比2個(gè)石榴品種，PgCCR和PgC3H在‘突尼斯軟籽’中的表達(dá)高于‘泰山紅’，其余PgHCT、PgCOMT、PgCCOMT、PgLAC則在‘泰山紅’中表達(dá)量高于‘突尼斯軟籽’。PgF5H基因在石榴種子中表達(dá)量最高，且在‘突尼斯軟籽’種子中表達(dá)量高于‘泰山紅’。但是，PgCAD和PgPOD基因表達(dá)在2個(gè)石榴品種的植物組織中存在差異，PgCAD基因分別在‘泰山紅’的葉和‘突尼斯軟籽’的種子中表達(dá)量最高；PgPOD基因分別在‘突尼斯軟籽’莖中和‘泰山紅’的外果皮中表達(dá)量最高。

2.4 果實(shí)不同發(fā)育期木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)

為揭示木質(zhì)素生物合成在硬籽石榴和軟籽石榴中的差異，本研究對(duì)比分析了硬籽石榴和軟籽石榴木質(zhì)素代謝途徑中12個(gè)關(guān)鍵基因在種子發(fā)育期的表達(dá)(圖5)。結(jié)果表明，這些基因在不同籽粒硬度品種種子發(fā)育期的表達(dá)具有顯著差異。隨著‘突尼斯軟籽’種子發(fā)育，有9個(gè)基因，即PgPAL、PgC4H、PgC3H、PgHCT、Pg4CL、PgCCR、PgLAC、PgF5H、PgCCOMT的表達(dá)量逐漸升高，均在盛花期后70 d達(dá)到峰值，而后表達(dá)量下降。除了PgC4H基因，其余8個(gè)基因在‘突尼斯軟籽’盛花期后70 d的表達(dá)量均高于‘泰山紅’。在硬籽石榴‘泰山紅’中，PgPAL、Pg4CL、PgHCT、PgLAC、PgCOMT5個(gè)基因隨著種子生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)呈逐漸下降的趨勢(shì)；PgC4H基因和PgF5H基因在‘泰山紅’盛花期后70 d表達(dá)量最高，與‘突尼斯軟籽’中的表達(dá)趨勢(shì)一致；PgCCR和PgCOMT基因在‘泰山紅’盛花期后45 d表達(dá)量最高。PgCAD和PgPOD基因在‘突尼斯軟籽’種子發(fā)育過(guò)程中表達(dá)水平逐漸下降，但PgCAD在‘泰山紅’盛花期后70 d基因表達(dá)量最高，PgPOD隨著‘泰山紅’的種子發(fā)育，表達(dá)水平無(wú)明顯變化。石榴PgCOMT基因在2個(gè)品種的表達(dá)趨勢(shì)則相反，在‘泰山紅’種子發(fā)育過(guò)程中逐漸下降，而在‘突尼斯軟籽’中逐漸上升。

TL：‘突尼斯軟籽’葉片，HL：‘泰山紅’葉片，TP：‘突尼斯軟籽’果皮，HP：‘泰山紅’果皮，TS：‘突尼斯軟籽’種子，HS：‘泰山紅’種子，TM：‘突尼斯軟籽’莖，HM：‘泰山紅’莖。

本研究進(jìn)一步分析了石榴成熟果實(shí)種子中木質(zhì)素代謝途徑的小分子物質(zhì)含量，有助于解析石榴籽粒硬度形成的機(jī)制。從圖5可以看出，在木質(zhì)素代謝途徑前期，‘突尼斯軟籽’中的對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、及下游的松柏醇含量均顯著高于‘泰山紅’，僅有芥子醛的含量在‘泰山紅’中高于‘突尼斯軟籽’。

綠色字體表示與‘泰山紅’相比，代謝物含量在‘突尼斯軟籽’中顯著下調(diào)，紅色字體表示代謝物含量在‘突尼斯軟籽’中顯著上調(diào)。長(zhǎng)方框內(nèi)4個(gè)圓圈從左到右分別代表種子4個(gè)發(fā)育時(shí)期(花后30，45，70，120 d)，藍(lán)色長(zhǎng)方框?yàn)椤荒崴管涀选?，紅色長(zhǎng)方框?yàn)椤┥郊t’。

3 結(jié)論與討論

石榴籽粒硬度影響石榴口感和可食性，種子中的木質(zhì)素含量是構(gòu)成石榴籽粒硬度的主要因素。本研究測(cè)定了‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’成熟果實(shí)的種子硬度，分別為2.97和6.63 kg·cm-2。根據(jù)陸麗娟等[8]的標(biāo)準(zhǔn)，‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’分別屬于軟籽石榴和硬籽石榴。隨著石榴種子發(fā)育，種子的硬度逐漸增加，并且木質(zhì)素含量的增加與種子硬度增加呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.939)。同時(shí)，種子硬度和木質(zhì)素含量在‘突尼斯軟籽’中始終低于‘泰山紅’，表明軟籽石榴和硬籽石榴種皮中木質(zhì)素的含量差異是影響種子硬度的重要因素，與前人的報(bào)道一致[10,17]。

研究表明，木質(zhì)素代謝途徑中相關(guān)基因在草本植物生長(zhǎng)前期高表達(dá)可以增強(qiáng)植物的抗倒伏性[26-28]；在梨果實(shí)發(fā)育前期的高表達(dá)增加了木質(zhì)素的含量[29-30]。劉玉倩[29]發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素代謝途徑中大部分基因，在刺梨果實(shí)發(fā)育前期(花后40 d前)具有較高的表達(dá)水平，并且果實(shí)中木質(zhì)素單體以及木質(zhì)素含量也較為豐富。劉盼盼[30]發(fā)現(xiàn)，梨的PAL、HCT-2、HCT-3、HCT-4、4CL-2等基因在果實(shí)發(fā)育期的表達(dá)規(guī)律與果肉中木質(zhì)素含量的變化規(guī)律相似，呈先升高后降低的趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著石榴種子發(fā)育，木質(zhì)素代謝途徑的12個(gè)關(guān)鍵基因在2個(gè)籽粒硬度不同的石榴品種中，表達(dá)趨勢(shì)存在明顯差異。在‘泰山紅’種子發(fā)育前期(盛花期后30和45 d)，12個(gè)基因中有8個(gè)基因，即PgPAL、Pg4CL、PgCCR、PgLAC、PgC3H、PgHCT、PgCOMT、PgCCOMT在硬籽石榴‘泰山紅’中的表達(dá)量明顯高于‘突尼斯軟籽’石榴，盡管在盛花期后70和120 d，這8個(gè)基因雖然在‘突尼斯軟籽’石榴中的表達(dá)量明顯高于‘泰山紅’，但‘泰山紅’的種子硬度和木質(zhì)素含量始終顯著高于‘突尼斯軟籽’，而且種子中木質(zhì)素前期增長(zhǎng)量(盛花期后45 d比30 d增加7.66%)高于后期增長(zhǎng)量(盛花期后120 d比70 d增加3.27%)兩倍多，據(jù)此推測(cè)，硬籽石榴和軟籽石榴種子硬度差異主要在種子發(fā)育前期完成，并且‘泰山紅’的種子硬度形成早于‘突尼斯軟籽’。NIU等[17]在軟籽石榴種子發(fā)育的早期(盛花期后60 d)，也發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素生物合成相關(guān)的差異表達(dá)蛋白具有較低的的表達(dá)水平。因此，這8個(gè)基因在硬籽石榴和軟籽石榴中的特異性表達(dá)為從軟籽石榴中篩選籽粒較軟的基因提供了重要信息。

木質(zhì)素合成途徑十分復(fù)雜。本研究從‘泰山紅’和‘突尼斯軟籽’成熟種子的木質(zhì)素代謝途徑中確定了11種代謝物。其中，‘突尼斯軟籽’石榴種子中對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、松柏醇的含量顯著高于硬籽石榴‘泰山紅’。因此，這4種代謝物在‘突尼斯軟籽’種子中顯著富集，可能是導(dǎo)致種子硬度低，木質(zhì)素含量低的關(guān)鍵物質(zhì)。而且，硬籽石榴‘泰山紅’中芥子醇的合成前體物質(zhì)芥子醛顯著高于‘突尼斯軟籽’，這與QIN等[11]認(rèn)為，芥子醇在硬籽石榴‘大笨子’中的累積高于‘突尼斯軟籽’結(jié)果類(lèi)似。此外，‘突尼斯軟籽’成熟種子中松柏醇含量較高，松柏醇通過(guò)氧化聚合反應(yīng)直接生成愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)，因此，這些代謝物在不同籽粒硬度的石榴種子中的累積模式有助于進(jìn)一步解析木質(zhì)素生物合成機(jī)制。

有研究表明，硬籽石榴的整個(gè)種皮都出現(xiàn)木質(zhì)化，軟籽石榴籽粒種皮只有部分細(xì)胞木質(zhì)化[31-32]。根據(jù)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，硬籽石榴‘泰山紅’的枝條比‘突尼斯軟籽’石榴的枝條硬。通過(guò)對(duì)比4個(gè)植物組織中12個(gè)木質(zhì)素代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，這些基因具有明顯的組織特異性表達(dá)，并且在石榴莖中高表達(dá)的基因，如PgPAL、PgCOMT、PgCCOMT、PgHCT，在硬籽石榴‘泰山紅’中的表達(dá)水平明顯高于‘突尼斯軟籽’石榴。因此,這4個(gè)基因可能潛在地影響石榴枝條木質(zhì)化程度，是枝條硬度形成的關(guān)鍵候選基因。

木質(zhì)素是植物體內(nèi)一種重要的有機(jī)物質(zhì)，木質(zhì)素的含量及組成對(duì)鮮食石榴的果實(shí)品質(zhì)有重要影響。本研究通過(guò)對(duì)比分析在軟籽和硬籽石榴的種子發(fā)育期，木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵基因的表達(dá)特性和成熟種子中代謝物富集差異，豐富并完善了石榴種子硬度形成機(jī)制，為從木質(zhì)素合成領(lǐng)域改良石榴果實(shí)品質(zhì)提供了基因資源。