暈可平糖漿中19 種無機(jī)元素的形態(tài)分析

丁愛華，潘富榮，謝 斌，陳玲玲，支榮榮，周會芹*

1 鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，鹽城 224055;2 江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，鹽城 224005

微量元素是人體必需的組成部分，也是中藥中普遍含有的一類成分。早期元素研究主要集中在總量的測定，自20 世紀(jì)50 年代日本水俁病事件發(fā)生后，科學(xué)家認(rèn)識到形態(tài)分析的重要性。不同形態(tài)的元素具有不同的理化性質(zhì)、毒性或療效。例如，砷在亞砷酸鹽[As（Ⅲ）]和砷酸鹽[As（V）]等無機(jī)形式中通常都是有毒的，但在砷甜菜堿和砷膽堿等高度甲基化的有機(jī)形式中卻是無毒的；鋅的無機(jī)態(tài)在生物體內(nèi)生物利用率較低且有毒副作用，而與多糖或蛋白結(jié)合的有機(jī)鋅更易于吸收，且具有抗氧化、抗高血脂或保護(hù)神經(jīng)元的作用[1-3]。因此，形態(tài)分析對了解中藥中元素藥性和毒性至關(guān)重要，也是其有效化學(xué)成分研究的補(bǔ)充和發(fā)展，這為闡明中藥的作用機(jī)制提供了有力的證據(jù)。

暈可平糖漿由生赭石、夏枯草、法半夏、車前草4 味中藥組成，主治肝旺痰阻型的內(nèi)耳眩暈癥、頭暈、目眩癥。生赭石是方中君藥，是氧化物類礦物剛玉族赤鐵礦，主含三氧化二鐵（Fe2O3），其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)值得深入研究。

目前赭石及其他3 味中藥中Fe、Mg、Ca、Mn、Ni、Cu、Zn 等元素的檢測已有報道[4-6]，前期研究對暈可平糖漿中Fe 及重金屬元素進(jìn)行了檢測[7，8]，而暈可平糖漿中元素的形態(tài)分析尚未見報道。因此，以中草藥元素形態(tài)分析的層次模式[9，10]為基礎(chǔ)，結(jié)合正辛醇-水分配系數(shù)（KOW）評價體系[11，12]，采用傳統(tǒng)化學(xué)分離技術(shù)和電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測方法（ICP-MS），對暈可平糖漿中19 種元素進(jìn)行形態(tài)分析，計算有關(guān)形態(tài)分析參數(shù)，為闡明以赭石為君藥的暈可平糖漿的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

iCAP RQ 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司）；Multiwave PRO 微波消解儀（奧地利安東帕（中國）公司）；Milli-Q 超純水處理裝置（美國Millipore 公司）。所用器皿均經(jīng)20%硝酸浸泡24 h 以上，再用超純水沖洗3 遍，晾干備用。

1.2 藥品與試劑

暈可平糖漿（100 mL/瓶，精華制藥集團(tuán)股份有限公司，批號為61200402）；多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1，批號為20D8383），鍺（Ge）、銦（In）、鉍（Bi）的混合內(nèi)標(biāo)溶液（10 μg·mL-1，批號為20D3605）國家有色金屬及電子材料分析測試中心；鋇（Ba）、鉍（Bi）、鈰（Ce）、鈷（Co）、銦（In）、鋰（Li）、鈾（U）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的調(diào)諧溶液（1.0 μg·L-1，賽默飛世爾科技公司）；001×7（732）陽離子交換樹脂（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；D401 型螯合樹脂（江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)）；三氯甲烷、正辛醇為分析純；硝酸為UP 級；水為超純水。

2 方 法

2.1 儀器條件

用質(zhì)譜調(diào)諧液調(diào)試儀器至測定要求。射頻功率：1550 W；等離子體氣體、輔助氣體、霧化器、碰撞氣體流量分別為14、0.8、1、5 L·min-1，采集深度為5.0 mm，延遲時間為0.03 s，積分時間為7.8 s。數(shù)據(jù)采集重復(fù)次數(shù)3 次，掃描次數(shù)為10 次，采集模式為KED 模式，定量分析。

2.2 混合對照溶液的制備

精密量取22 種多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2%硝酸溶液稀釋成含各元素為0.2、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、125、200、500、1000 ng·mL-1的系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

精密量取Ge、In、Bi 混合內(nèi)標(biāo)溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成50 ng·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)溶液（配制時加入Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，最終濃度為100 ng·mL-1）。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 初級形態(tài)分離取暈可平糖漿（供試品溶液A）100 mL，經(jīng)高速離心后，將離心液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，所得濾液為可溶態(tài)供試品B；離心及濾膜上的殘渣為懸浮態(tài)供試品C。

可溶態(tài)比重（%）=含量可溶態(tài)B/含量供試品A× 100%

2.3.2 次級形態(tài)分離樹脂的預(yù)處理[13]：用75%的乙醇浸泡過夜，用超純水清洗干凈。用1 mol·L-1NaOH 浸泡2 h，用超純水洗至近中性，改用1 mol·L-1HCl 處理2 h，最后用超純水洗至近中性，備用。

游離態(tài)與非游離態(tài)的分離：精密量取可溶態(tài)溶液B 5 mL，通過001×7 陽離子交換樹脂柱（Φ10 mm×100 mm），流速0.5～1 mL·min-1，用超純水（60 mL）淋洗樹脂柱，收集流出液和水洗液，濃縮轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容至刻度，得非游離態(tài)D-Ⅰ。柱截留物用2 mol·L-1硝酸（150 mL）洗脫，收集洗脫液，濃縮轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，定容至刻度，得游離態(tài)D-Ⅱ。

穩(wěn)定態(tài)與不穩(wěn)定態(tài)的分離：可溶態(tài)溶液B 用D401 螯合樹脂柱處理，處理方法同001×7 陽離子交換樹脂柱，柱截留物為不穩(wěn)定態(tài)E-Ⅰ，穿過物為穩(wěn)定態(tài)E-Ⅱ。

無機(jī)態(tài)與有機(jī)態(tài)的分離：精密量取可溶態(tài)溶液B 10 mL，用三氯甲烷萃?。?0 mL×3 次），每次振蕩3 min。水相為無機(jī)態(tài)F-Ⅰ，差減法計算有機(jī)態(tài)F-Ⅱ的含量。

非游離態(tài)比重（%）=含量非游離態(tài)D-Ⅰ/含量可溶態(tài)B×100%游離陽離子態(tài)比重、穩(wěn)定態(tài)比重、不穩(wěn)定態(tài)比重、無機(jī)態(tài)比重、有機(jī)態(tài)比重，計算均同非游離態(tài)比重。

2.3.3 正辛醇/水分配體系模擬試驗 精密量取可溶態(tài)溶液B 各10 mL，用稀硝酸和0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)pH 為1.3（胃液酸度）和7.6（小腸液堿度），置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中保溫12 h后，每份加正辛醇10 mL，水浴恒溫振蕩2 h，萃取2次，合并2 次萃取的水相和有機(jī)相，水相濃縮轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶，定容至刻度，分別得到模擬胃液和小腸液條件下各元素的水溶態(tài)G-Ⅰ、H-Ⅰ，差減法計算醇溶態(tài)的含量G-Ⅱ、H-Ⅱ。KOW值為正辛醇吸收模型中醇溶態(tài)含量和水溶態(tài)含量的比值。

2.3.4 試樣的消解精密量取上述A、B、D-Ⅰ～F-Ⅰ、G-Ⅰ、H-Ⅰ溶液各2 份，每份1 mL，置微波消解罐內(nèi)，加入硝酸5 mL，密塞，放入微波消解儀。消解完畢后，放冷，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，用少量超純水洗滌消解罐3 次，洗液合并于量瓶中，加入Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 μg·mL-1）200 μL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取1 mL 置100 mL 量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋成至刻度，搖勻，作為測定Mg、Si、K、Ca 的供試品溶液。除不加Au單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外，余同法制備試劑的空白溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及各形態(tài)樣品無機(jī)元素含量測定

儀器的內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管在儀器分析過程中始終插入內(nèi)標(biāo)溶液中，依次將儀器樣品管插入各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液中進(jìn)行測定（濃度依次遞增），以測量值（3 次的平均值）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。重復(fù)測定空白溶液11 次，各元素信號響應(yīng)的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（3SD）對應(yīng)的元素濃度即為儀器檢測限。依次將儀器樣品管插入各形態(tài)供試品溶液及相應(yīng)的空白溶液中進(jìn)行測定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算得相應(yīng)的濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 分析方法的可靠性

本實(shí)驗中所采用分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限結(jié)果見表1。

表1 各元素線性關(guān)系及檢測限

精密量取1 mL 可溶態(tài)溶液B，平行6 份，做重復(fù)性試驗，同時對同一份溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，做進(jìn)樣精密度試驗。另精密量取1 mL 可溶態(tài)溶液B，平行6 份，精密加入多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，做回收率試驗。按可溶態(tài)處理方法進(jìn)行消解測定，各元素的重復(fù)性試驗結(jié)果的RSD 為2.9%～14.1%；精密度試驗結(jié)果的RSD 為2.0%～9.5%；平均回收率為81.4%～119.0%、RSD 為1.0%～9.5%，均滿足方法學(xué)考察要求。

3.2 糖漿中微量元素的傳統(tǒng)形態(tài)分析結(jié)果

實(shí)驗建立了暈可平糖漿中19 種微量元素的形態(tài)分析方法（Cr、Se、Sn、Pb 未檢出），根據(jù)糖漿中各形態(tài)分析測定結(jié)果，計算形態(tài)分析參數(shù)，結(jié)果見表2和表3。

由表2、表3 可知，在暈可平糖漿中含量較高的有Mg、Si、K、Ca、Ti、Mn、Fe 等元素，其中含量最高的K 濃度達(dá)4633.485 μg·mL-1，同時也含有少量對人體有害的Cu、As、Cd、Sb 等重金屬。糖漿中Si、V、Mn、Fe、Cu、As 元素的懸浮態(tài)比重較高，其中Cu 懸浮態(tài)的含量高于可溶態(tài)。在可溶態(tài)中，Mg、K、Ca、Ti、Mn、Co、Ni、Zn、Cd 大部分以游離態(tài)及不穩(wěn)定態(tài)的形態(tài)存在；Si、V、Cu、As、Sb 存在比重較高的非游離態(tài)及穩(wěn)定態(tài)，其中Si、As、Sb 非游離態(tài)及穩(wěn)定態(tài)的比重高達(dá)90%以上；Cu、Cd 不穩(wěn)定絡(luò)合態(tài)比重（非游離態(tài)比重與穩(wěn)定態(tài)比重之差）較高，分別為43.3%、35.2%；Fe 的非游離態(tài)及穩(wěn)定態(tài)各占50%左右。在可溶態(tài)中，F(xiàn)e 的有機(jī)態(tài)比重最高，為30.8%，Cu 次之，為14.2%。

表2 暈可平糖漿中各元素形態(tài)分析測定結(jié)果(μg·mL-1)

3.3 胃腸酸度變化對糖漿中微量元素形態(tài)的影響

正辛醇結(jié)構(gòu)性質(zhì)與人體碳水化合物和脂肪類似，中藥藥理學(xué)常以正辛醇-水分配系數(shù)（KOW）模擬元素在人體胃、腸中的分配情況，評價中藥中相關(guān)元素的親脂性和生物活性[14,15]。KOW參數(shù)越大，表明正辛醇醇溶態(tài)中的微量元素親脂性及生物活性越強(qiáng)。由表2 和表3 可知，無論在堿性還是酸性條件下，各元素的KOW值均小于1，其中Fe 和Cu 的KOW值接近于1，表明糖漿中各元素的親脂性和生物活性均較弱，F(xiàn)e 和Cu 是其中生物活性相對較強(qiáng)的元素。pH 變化對Mg、K、Ti、Sb 等的影響不大，其余微量元素的含量隨pH 變化而變化。

表3 暈可平糖漿中各元素形態(tài)分析參數(shù)結(jié)果

4 討論

由于中藥樣品基體復(fù)雜且待測組分含量低，形態(tài)分析比常規(guī)測定元素的總量要困難得多。目前，氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳等分離技術(shù)聯(lián)用ICP-MS 可用于多元素形態(tài)的檢測；但成本偏高，可同時分析的元素種類相對較少。傳統(tǒng)化學(xué)分離前處理方式聯(lián)合ICP-MS，具有快速、簡便、易推廣、不受元素種類限制的優(yōu)點(diǎn)，是前期挖掘和篩選元素形態(tài)信息的便捷技術(shù)途徑。

本實(shí)驗對暈可平糖漿中19 種無機(jī)元素進(jìn)行形態(tài)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重金屬元素As、Sb 主要以穩(wěn)定態(tài)存在，KOW值也遠(yuǎn)小于1，表明As、Sb 很難被人體吸收、轉(zhuǎn)化成為其他分子形態(tài)。Cu、Cd 的不穩(wěn)定絡(luò)合態(tài)比重較高，易被打破平衡參與新的化學(xué)反應(yīng)；但鑒于其KOW值小于1，所致健康風(fēng)險在安全范圍內(nèi)[8]，因此后期安全性監(jiān)控主要是檢測Cu、Cd 的含量。

本實(shí)驗還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e 可能是暈可平糖漿的藥效部位之一。糖漿中含量高的元素主要是Mg、Si、K、Ca、Mn、Ti 和Fe，除Fe 以外的其他元素基本以游離態(tài)存在，不易與糖漿中的各種配體發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；此外，F(xiàn)e 的有機(jī)態(tài)比重最高，KOW值接近于1，因此推測Fe 是糖漿發(fā)揮藥效最相關(guān)的元素。當(dāng)生赭石與方中其他藥物共煎時，游離態(tài)Fe 與有機(jī)酸、黃酮等配體成分絡(luò)合達(dá)到動態(tài)平衡[16-18]；Fe 進(jìn)入人體后，在不同靶位配合平衡被打破，通過游離態(tài)的調(diào)整進(jìn)入新的平衡，出現(xiàn)新的生物活性。相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e 在線粒體的氧代謝、氧攝取、電子傳遞、能量代謝、肌肉功能、造血、免疫保護(hù)等方面發(fā)揮著重要作用[19]。后期將對不同形態(tài)Fe 與糖漿中有機(jī)成分以及生物體之間的作用進(jìn)行深入的研究。