基于PSY2基因單堿基突變的木薯薯肉顏色分子標(biāo)記開發(fā)與利用

樸樸森 尚小紅 許豐收 廖明馨 王 明 嚴(yán)華兵,* 陳 新 王文泉

(1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101；2 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所， 廣西 南寧 530007；3 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228；4 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種 資源研究所，海南 ?？?571101；5 緬甸教育部研究與創(chuàng)新部生物技術(shù)研究院，緬甸 曼德勒 05151)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是大戟科木薯屬的高淀粉塊根作物，廣泛應(yīng)用于淀粉生產(chǎn)，工業(yè)原料，以及作為亞非拉地區(qū)人民的日?？诩Z[1]，為世界近6億人口提供糧食保障，尤其在非洲，主要以木薯為食[2]。自然界中木薯塊根肉質(zhì)顏色以白色為主，長(zhǎng)期以白肉木薯為主食易導(dǎo)致維生素A缺乏并引發(fā)相應(yīng)疾病，如夜盲癥等。根據(jù)類胡蘿卜素含量的差異，木薯可分為粉紅色、淺黃色、黃色和深黃色等不同塊根肉質(zhì)顏色的種質(zhì)資源[3]，這些顏色的木薯比白肉木薯具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此需要培育具有高類胡蘿卜素含量的木薯新品種以改善非洲人的膳食結(jié)構(gòu)，減少維生素A源缺乏現(xiàn)象。木薯塊根中的類胡蘿卜素不僅可以幫助富集維生素A源，提高蛋白質(zhì)含量，還可延緩采后生理衰變(postharvest physiological deterioration，PPD)[4]，而且類胡蘿卜素的累積量與PPD的延遲存在顯著正相關(guān)關(guān)系[5-6]。

近年來(lái)木薯分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的發(fā)展取得了巨大的進(jìn)步。木薯的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖從以同工酶、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)為主[7-8]，過(guò)渡到基于PCR技術(shù)的簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeats，SSR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)和少數(shù)基因特異性標(biāo)記[9-13]，到現(xiàn)階段通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的SNP構(gòu)成[14]。遺傳連鎖圖的標(biāo)記類型和標(biāo)記數(shù)量都有極大的改善，如在國(guó)際木薯遺傳圖譜委員會(huì)2014年發(fā)表的超高密度的遺傳連鎖圖中，標(biāo)記總數(shù)達(dá)22 403個(gè)，其中18個(gè)遺傳連鎖群與染色體組完全對(duì)應(yīng)[15]。隨著木薯基因組精細(xì)圖的陸續(xù)發(fā)表[16-20]，針對(duì)控制關(guān)鍵性狀的分子標(biāo)記定位已經(jīng)達(dá)到單堿基突變的程度，如抗木薯花葉病毒位點(diǎn)被鎖定在6個(gè)關(guān)鍵的SNP位點(diǎn)，木薯的Waxy位點(diǎn)被確定為GBSSI基因第11個(gè)內(nèi)含子上的C→G突變[21]，已開發(fā)成基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記。

木薯塊根類胡蘿卜素合成途徑中，八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，PSY)是類胡蘿卜素合成起始的關(guān)鍵酶，木薯基因組中含有3個(gè)編碼八氫番茄紅素合成酶的基因，分別為PSY1、PSY2、PSY3，其中PSY2基因編碼序列第572個(gè)堿基C→A的突變，導(dǎo)致編碼氨基酸由丙氨酸(Ala)變成天冬氨酸(Asp)，氨基酸的改變使PSY2活性增加3倍以上，從而提高了塊根中類胡蘿卜素的含量[22]。通過(guò)檢索植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(JoinTGenome Institute，JGI)發(fā)現(xiàn)，該基因的突變位點(diǎn)為木薯特有，鮮出現(xiàn)在其他物種中[23]。該突變位點(diǎn)存在限制性內(nèi)切酶AluI的酶切位點(diǎn)，根據(jù)該特性開發(fā)了一對(duì)酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS)分子標(biāo)記，并用于鑒定該位點(diǎn)基因型，結(jié)合基因型和田間塊根顏色表明該標(biāo)記的選擇準(zhǔn)確率達(dá)100%[24]。然而，該CAPS分子標(biāo)記的應(yīng)用需要一些酶切的步驟，相對(duì)于簡(jiǎn)易的分子標(biāo)記過(guò)程復(fù)雜。此外，在已開發(fā)的CAPS分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果中，黃肉與白肉分子標(biāo)記的條帶僅相隔22 bp，條帶在瓊脂糖凝膠電泳圖中太近而不易分辨。以上原因?qū)е略揅APS分子標(biāo)記存在弊端，限制了其實(shí)用性。因此，需要開發(fā)出一種簡(jiǎn)易、快捷且價(jià)格低廉的分子標(biāo)記來(lái)提高木薯分子標(biāo)記輔助育種的效率。

單核苷酸擴(kuò)增多態(tài)性(single-nucleotide amplified polymorphism，SNAP)標(biāo)記技術(shù)是通過(guò)將一條PCR引物的3′末端安排在SNP(single nucleotide polymorphism)位點(diǎn)上，并在第3個(gè)堿基(3′→5′)引入1個(gè)錯(cuò)配的堿基，另一條PCR引物按照傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)；當(dāng)利用這種引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，僅在第3個(gè)堿基存在錯(cuò)配等位基因的PCR產(chǎn)物是第1和第3個(gè)堿基都存在錯(cuò)配等位基因的1 000倍左右，因此通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳可以明確判定PCR擴(kuò)增條帶的“有”和“無(wú)”，進(jìn)而呈現(xiàn)出單堿基變異[25]。SNAP具有操作簡(jiǎn)單、快速便捷等優(yōu)點(diǎn)，已先后應(yīng)用于水稻(OryzasativaL.)[26]、大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.][27-28]、玉米(ZeamaysL.)[29]、油菜(BrassicanapusL.)[30]、黃瓜(CucumissativusL.)[31]等作物的分子標(biāo)記輔助助育種。本研究利用SNAP技術(shù)對(duì)前期開發(fā)的薯肉顏色CAPS標(biāo)記進(jìn)行升級(jí)[24]，直接通過(guò)PCR產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判斷不同薯肉顏色品系PSY2的等位基因類型，并用于食用木薯培育的親本選擇和子代基因型篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白色薯肉木薯品系：華南205、KU50；黃色薯肉木薯品系：SC9、18R和新選048/XX048；XX048自交一代28個(gè)株系，總計(jì)33個(gè)試驗(yàn)材料，于廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建科研基地正常田間種植，常規(guī)管理。

木薯雜交種實(shí)生苗株系62個(gè)：以黃色薯肉品種SC9、CH12和18R為母本，與泰國(guó)優(yōu)良品種HB60以及國(guó)內(nèi)主推品種SC205、SC124、SC8、18R和GR6在2016年配制F1代雜交組合8個(gè)，2017年8月育苗529株并于當(dāng)年11月移栽大田(澄邁大豐農(nóng)場(chǎng))，經(jīng)2018和2019年自然淘汰和人工選擇，于2020年4月保留62個(gè)株系(表1)。

表1 雜交組合配制與實(shí)生苗數(shù)量Table 1 Hybrid combination and the number of their seedlings

國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃(儋州)可食用木薯種質(zhì)45份，種植于儋州寶島新村，常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采集木薯植株幼嫩葉片，用液氮研磨成細(xì)粉狀，然后參照植物DNA提取試劑盒(成都福際生物)的程序提取基因組DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并用UV-2700紫外分光光度計(jì)(日本島津)檢測(cè)濃度，稀釋成50 ng·L-1，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 木薯塊根顏色評(píng)估 田間收獲塊根時(shí)，每個(gè)株系選取3個(gè)來(lái)自不同單株的塊根，橫切后記錄塊根顏色并拍照留存。統(tǒng)計(jì)各株系塊根顏色，并利用Excel軟件進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)。

1.2.3 SNAP引物設(shè)計(jì)PSY2基因的完整序列從美國(guó)能源部生物信息網(wǎng)站(www.phytozome.com)下載，并確定目標(biāo)突變位點(diǎn)的位置，利用網(wǎng)絡(luò)版的SNAPER軟件(http://pga.mgh.harvard.edu/cgibin/snap3websnaper3.cgi)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并將正向引物3′端倒數(shù)第3個(gè)堿基依據(jù)SNAP引物設(shè)計(jì)的原則將A錯(cuò)配為G，以保證引物對(duì)能夠特異地區(qū)分2個(gè)不同的等位基因。引物序列詳見表2。

表2 本試驗(yàn)中PSY2-SNAP引物序列Table 2 Sequence of PSY2-SNAP primer set used in the experiment

1.2.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物多態(tài)性檢測(cè) 通過(guò)優(yōu)化模板DNA濃度和PCR反應(yīng)退火溫度及循環(huán)數(shù)，確定SNAP引物PCR擴(kuò)增體系20 μL，包括50 ng·μL-1模板DNA 2 μL，2× PCR master mixture (Vazyme，南京) 10 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，ddH2O 7μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min，4℃保存。每個(gè)PCR反應(yīng)重復(fù)2次，確保試驗(yàn)結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用Tanon4000凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNAP標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)及其可靠性評(píng)價(jià)

在獲得PSY2基因全序列并確定變異位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)SNAP技術(shù)引物設(shè)計(jì)的基本原則，設(shè)計(jì)能夠區(qū)分變異位點(diǎn)的PCR引物，并依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將正向引物3′端倒數(shù)第3個(gè)堿基A特異地錯(cuò)配為G，對(duì)5個(gè)薯肉顏色存在差異的木薯品種進(jìn)行基因型分析。結(jié)果表明，SC9、18R和XX048在該位點(diǎn)的等位基因均為雜合型AC，即這3個(gè)木薯品種基因組中存在兩種不同的等位基因；SC205和KU50在該位點(diǎn)為純合型CC，在基因組中僅存在一種且變異位點(diǎn)堿基為C的等位基因(圖1-a、b)。綜上，本研究設(shè)計(jì)的引物組合通過(guò)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物電泳檢測(cè)，可明確區(qū)分不同薯肉顏色木薯品系的基因型，PCR產(chǎn)物電泳條帶特異且清晰，是一個(gè)潛在的食用木薯輔助育種分子標(biāo)記。

注：a：5個(gè)木薯品系的薯肉顏色；b：5個(gè)木薯品系SNAP 標(biāo)記展示的基因型；c：3種不同基因型CC/CA/AA 所對(duì)應(yīng)的薯肉顏色。Note: a: The rooTColors of five cassava lines. b: The genotype of five cassava lines by SNAP markers. c: The different rooTColors correspondinGTo CC/CA/AAGenotypes.圖1 PSY2-SNAP標(biāo)記的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)Fig.1 Evaluation on the accuracy of the PSY2-SNAP markers

2.2 薯肉顏色SNAP標(biāo)記準(zhǔn)確性的進(jìn)一步驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本研究開發(fā)的PSY2-SNAP標(biāo)記的可靠性，研究組構(gòu)建了XX048的自交一代群體，最終獲得28個(gè)自交株系。經(jīng)實(shí)生苗擴(kuò)繁成株系后，按照前述方法調(diào)查薯肉顏色，發(fā)現(xiàn)薯肉顏色存在分離(圖1-c)，有白色(8株系)、黃色(16株系)和深黃(4株系)，經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)符合1∶2∶1的遺傳分離比例(χ2=1.71<3.84,P<0.05；群體偏小)。為了確定自交系群體薯肉顏色與基因型的對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用PSY2-SNAP標(biāo)記對(duì)28個(gè)株系的基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在自交群體中確實(shí)存在CC型的純合位點(diǎn)，而且不同基因型分離比為8CC∶16AC∶4AA(圖2)，卡方測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明基因型也符合1∶2∶1的遺傳分離比，進(jìn)一步表明薯肉顏色為顯性單基因控制。

注：a：引物組合PSY-F1/PSY-R的PCR產(chǎn)物；b：引物組合PSY-F2/PSY-R的PCR產(chǎn)物。M：DL2000；P：木薯品種XX048； 1～7和11：白色薯肉株系CC；8～10和12～14：深黃薯肉株系A(chǔ)A；15～28：黃色薯肉株系A(chǔ)C。Note: a: PCR products with PSY-F1/PSY-R. b: PCR products with PSY-F2/PSY-R. M: DL2000 Marker. P: XX048. 1 to 7 and 11: Lines with white root. 8 to 10 and 12 to 14: Lines with deep-yellow root. 15 to 28: Lines with yellow root.圖2 基于PSY2-SNAP標(biāo)記的XX048及其自交群體的基因型Fig.2 The genotypes of XX048 and its self-bred lines basing on the PSY2-SNAP markers

2.3 薯肉顏色SNAP標(biāo)記的應(yīng)用

以62個(gè)木薯雜交種實(shí)生菌株系為材料驗(yàn)證PSY2-SNAP標(biāo)記的實(shí)用性，首先記錄了62個(gè)株系的薯肉顏色，然后利用PSY2-SNAP標(biāo)記對(duì)這62個(gè)株系的基因型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示基因型與表型完全匹配(部分結(jié)果見圖3)，表明PSY2-SNAP標(biāo)記可對(duì)育種中間材料的基因型進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。

注：a：引物組合PSY-F1/PSY-R的PCR產(chǎn)物；b：引物組合PSY-F2/PSY-R的PCR產(chǎn)物。M：DL2000； 1～2、4～13、15～16、19～20和22～25是白色薯肉株系CC；3、14、18和21是黃色薯肉株系A(chǔ)C。Note: a: PCR products with PSY-F1/PSY-R. b: PCR products with PSY-F2/PSY-R. M: DL2000 Marker. 1～2, 4～13,15～16, 19～20 and 22～25 are lines with white root. 3, 14, 18 and 21 are lines with yellow root.圖3 基于PSY2-SNAP標(biāo)記的部分Ⅴ系列株系基因型Fig.3 The genotypes of Ⅴ-series lines basing on the PSY2-SNAP markers

2.4 黃色薯肉特異種質(zhì)和新類型的發(fā)現(xiàn)

為了在更大范圍內(nèi)檢驗(yàn)PSY2-SNAP標(biāo)記的可靠性，并對(duì)現(xiàn)有可食用木薯種質(zhì)資源進(jìn)行基因型檢測(cè)，本試驗(yàn)從國(guó)家木薯種質(zhì)圃抽選出45份木薯品系(表3)，利用PSY2-SNAP標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，并與薯肉顏色進(jìn)行對(duì)應(yīng)，發(fā)現(xiàn)29份薯肉顏色與基因型一致，其中黃色薯肉品系19份，白色薯肉品系10份，其余16份薯肉顏色與基因型不符，薯肉均為黃色(圖4，如ZME333)，但呈白色薯肉基因型(表3)。

在薯肉顏色與基因型一致的19個(gè)黃肉品系中，ZMC723和泰引1號(hào)薯肉顏色深黃，但ZMC723基因型為純合AA，泰引1號(hào)基因型為雜合AC(雜合基因型一般是黃色，類似ZMC608，圖4)，因此泰引1號(hào)薯肉顏色為深黃的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，和ZMC723的育種利用價(jià)值值得進(jìn)一步挖掘。

圖4 4個(gè)不同的黃色薯肉品系Fig.4 Four cassava lines with different yellow-roots

3 討論

3.1 PSY2-SNAP標(biāo)記是一個(gè)具有育種價(jià)值的分子標(biāo)記

SNAP分子標(biāo)記自研發(fā)以來(lái)，在多種作物中開展應(yīng)用。Lestari等[26]基于水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中的SNP位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)出能夠識(shí)別水稻秈粳品種的SNAP分子標(biāo)記，可對(duì)水稻材料進(jìn)行快速選擇；Kim等[27]研究發(fā)現(xiàn)，大豆野生型與突變型在基因GmNARK的959 bp處存在一個(gè)SNP突變，能調(diào)控大豆根結(jié)瘤的合成，根據(jù)這

表3 45份可食用木薯品系SNAP標(biāo)記的基因型和薯肉顏色Table 3 The rooTColors and SNAP based genotypes of 45 edible cassava lines

一位點(diǎn)設(shè)計(jì)的SNAP分子標(biāo)記可快速檢測(cè)出超結(jié)瘤的大豆材料。由此可見，在明確SNP位點(diǎn)功能的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)SNAP分子標(biāo)記，可以快速準(zhǔn)確地區(qū)分作物的性狀。本研究在前期開發(fā)的PSY2-CAPS標(biāo)記基礎(chǔ)上[24]，針對(duì)其操作繁瑣、費(fèi)用較高的缺點(diǎn)，提出簡(jiǎn)化方案，開發(fā)出僅需進(jìn)行PCR檢測(cè)的PSY2-SNAP標(biāo)記，該標(biāo)記的準(zhǔn)確度與PSY2-CAPS標(biāo)記相當(dāng)，且育種中間材料的基因型鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。利用該標(biāo)記對(duì)國(guó)家木薯種質(zhì)圃中的可食用木薯資源進(jìn)行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)了更多由該位點(diǎn)控制的黃色薯肉種質(zhì)資源，不僅解釋了這些種質(zhì)資源薯肉顏色的成因，也拓寬了今后開展食用木薯育種可選擇的親本范疇，而且雜交子代可以使用PSY2-SNAP標(biāo)記進(jìn)行早期選擇，提高育種效率。

在作物顏色分子標(biāo)記的研發(fā)中，葛宇等[32]研究發(fā)現(xiàn)成熟南瓜黃色果肉受一對(duì)完全顯性基因控制，黃肉為顯性，并獲得一個(gè)與黃色果肉緊密連鎖的SSR標(biāo)記PU132712，遺傳距離為6.72 cM。許蕓梅等[33]通過(guò)BSA-Seq方法，把調(diào)控馬鈴薯薯肉花青素合成的主效位點(diǎn)定位在第10號(hào)染色體上，并利用分子標(biāo)記將該基因定位于51.47～51.85 Mb的377 kb區(qū)間內(nèi)，包含5個(gè)候選基因。上述研究中開發(fā)出的顏色相關(guān)的分子標(biāo)記均為區(qū)段，未能精準(zhǔn)地對(duì)作物的顏色性狀進(jìn)行區(qū)分。本研究開發(fā)的PSY2-SNAP分子標(biāo)記，可以針對(duì)關(guān)鍵突變位點(diǎn)，對(duì)木薯黃白薯肉顏色進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分，具有良好的育種價(jià)值。

3.2 木薯塊根薯肉顏色變異的分子機(jī)理亟待挖掘

木薯塊根薯肉顏色除常見的白色外，還有黃色和粉紅色等。除PSY2基因編碼序列第572個(gè)堿基C→A的突變，導(dǎo)致八氫番茄紅素合成酶活性增強(qiáng)進(jìn)而提高塊根類胡蘿卜素的含量外[13]，還有位點(diǎn)PSY2_549和lcyE_1066可能影響類胡蘿卜素的含量[14]。本研究在對(duì)國(guó)家木薯種質(zhì)圃抽選出的45份木薯品系進(jìn)行PSY2-SNAP分子標(biāo)記檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，16個(gè)薯肉顏色與基因型不符，其中ZMC723和泰引1號(hào)薯肉顏色均為深黃，但ZMC723的基因型為純合AA，而泰引1號(hào)的基因型為雜合AC(其他基因型雜合AC品系薯肉顏色均為黃色)，因此深入挖掘泰引1號(hào)薯肉顏色深黃的分子機(jī)制，可以幫助選育塊根類胡蘿卜素含量更高的木薯新品系。

利用PSY2-SNAP標(biāo)記對(duì)食用木薯種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)部分黃色薯肉品系不受C→A突變模式控制，推測(cè)為PSY2基因內(nèi)其他位點(diǎn)突變，或?yàn)轭惡}卜素合成途徑中其他基因突變導(dǎo)致存在其他的控制位點(diǎn)，為新類型的黃色薯肉種質(zhì)資源。需要設(shè)計(jì)試驗(yàn)找到新的提高類胡蘿卜素含量的突變位點(diǎn)或基因，并開發(fā)成相應(yīng)的分子標(biāo)記，從而對(duì)多個(gè)提高類胡蘿卜素含量的位點(diǎn)進(jìn)行聚合，進(jìn)一步改良木薯塊根類胡蘿卜素的合成效率。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)的PSY2-SNAP分子標(biāo)記可快速鑒定木薯塊根肉質(zhì)顏色，如PSY-F1/PSY-R引物對(duì)能擴(kuò)增出388 bp的條帶，則木薯材料為白肉；如PSY-F2/PSY-R引物對(duì)能擴(kuò)增出388 bp的條帶，則木薯材料為深黃色；如PSY-F1/PSY-R和PSY-F2/PSY-R均能擴(kuò)增出388 bp的條帶，則木薯材料為黃色。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)存在受其他基因突變位點(diǎn)控制的黃色薯肉種質(zhì)資源，有待進(jìn)一步開發(fā)利用。