體外消化對(duì)油茶蒲提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響

林心健 夏旭東 戚向陽 楊震峰 陳秋平

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)是世界四大木本植物之一[1]，隸屬于山茶科山茶屬，是一種食用油料作物[2]。我國是主要的油茶資源生產(chǎn)國，擁有豐富的油茶資源[3]，其主要分布在湖南、貴州、江西等11省(市、區(qū))的全部或部分地區(qū)[4]。改革開放以來，油茶籽的產(chǎn)量逐年增加，尤其是近十年油茶籽的產(chǎn)量飛速增加，2019年達(dá)到268萬噸左右[5]。然而，我國目前對(duì)油茶的開發(fā)和利用大多是直接將油茶籽壓榨成茶油，而油茶加工副產(chǎn)物油茶蒲大多被廢棄或當(dāng)作燃料來使用，造成資源浪費(fèi)。

糖尿病作為常見的慢性病之一，其在全球的患病人數(shù)和死亡人數(shù)均呈上升趨勢[6]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation，IDF)的數(shù)據(jù)顯示，2019年我國糖尿病人數(shù)大約為1.16億，預(yù)計(jì)到2030年和2045年將增長至1.40億和1.47億[7]。餐后高血糖與II型糖尿病密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)降低餐后高血糖的藥物在II型糖尿病和糖尿病前期的治療中起著關(guān)鍵作用[8]。α-葡萄糖苷酶對(duì)碳水化合物具有消化作用，通過抑制α-葡萄糖苷酶可以減緩消化過程中對(duì)碳水化合物的降解，減緩其吸收，從而降低餐后高血糖水平[9]。目前α-糖苷酶抑制劑被認(rèn)為是最有效的降低餐后高血糖的藥物，代表性藥物有阿卡波糖(acarbose)、福格列波糖(voglibose)、米格列醇(miglitol)等，但長期服用上述藥物會(huì)產(chǎn)生一定的副作用[10-12]。因此，開發(fā)天然安全高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。

近年來，國內(nèi)外有大量研究通過模擬人體外消化過程來探究消化對(duì)食物成分的影響，并以此為依據(jù)來評(píng)估食品的營養(yǎng)價(jià)值[13]。與體內(nèi)消化試驗(yàn)相比，體外消化具有成本低、實(shí)驗(yàn)周期短、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且其作為食品和藥品分析的常用方法，多用于分析食品及藥品消化前后結(jié)構(gòu)變化，生物利用度以及消化率[14]。相關(guān)研究顯示，油茶蒲具有抗癌、抗氧化、降血糖、預(yù)防肥胖等作用[15-16]，但消化對(duì)其活性成分影響的相關(guān)研究甚少。本課題以油茶蒲為原料，通過模擬體外消化探究消化前后油茶蒲提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，為以油茶蒲為原料開發(fā)預(yù)防糖尿病和降血糖相關(guān)的功能性食品及藥物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶蒲采自衢州常山農(nóng)戶；α-淀粉酶(1 000 U)、胃蛋白酶(≥250 U·mg-1)、 胰蛋白酶(1 000～2 000 U·mg-1)， 美國Sigma公司；2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]、福林酚，北京索萊寶科技有限公司；乙酸乙酯、正丁醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BSA224S電子分析天平，塞多利斯(北京)儀器有限公司；7230G可見分光光度計(jì)，上海瞬宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TU-1810可控溫紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；ZHWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；RE-2001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；2998液相色譜儀，上海市沃特世科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 油茶蒲提取物的制備 參考陳亞琪等[17]的方法，將油茶蒲粉碎后，過60目篩。稱取50 g油茶蒲粉末，加入500 mL 50%乙醇攪拌，超聲提取30 min，減壓過濾，取部分提取液減壓濃縮后冷凍干燥，得到油茶蒲提取物。將剩余提取液旋蒸發(fā)濃縮后，選擇極性從小到大的有機(jī)溶劑(乙酸乙酯、正丁醇、水)進(jìn)行分級(jí)萃取，依次得到不同的萃取物。將三相萃取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，得油茶蒲分級(jí)萃取物。

1.3.2 模擬體外消化 參考Gullon等[18]的方法，稍加修改。取樣品用蒸餾水定容至2 g·L-1，取25 mL定容至50 mL作為油茶蒲提取物；另取25 mL加入1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9，加入1 mL模擬唾液(100 U·mL-1α-淀粉酶唾液)，恒溫水浴37℃充分振搖5 min后用1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2，加入1 mL胃消化液(0.108 g胃蛋白酶溶解于10 mL HCl溶液)37℃恒溫?fù)u床65 r·min-1振蕩2 h，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7，加入1 mL腸消化液(80 mg胰蛋白酶溶解于0.05 mol·L-1KH2PO4溶液)37℃恒溫?fù)u床65 r·min-1振蕩2 h，定容至50 mL作為消化樣液，消化前后終濃度均為1 g·L-1。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶活性的測定 在比色皿中加入0.1 mol·L-1pH值6.8的磷酸鹽緩沖液1.8 mL，37℃下孵育5 min后，再加入底物100 μL 2.5 mmol·L-1對(duì)硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG)，最后快速加入10 μL 5 U·mL-1α-葡萄糖苷酶啟動(dòng)反應(yīng)，在恒溫紫外可見光分光光度計(jì)中監(jiān)測其在400 nm波長下1 min內(nèi)吸光度的變化，計(jì)算酶活性[19-20]。重復(fù)3次，取平均值。

在比色皿中加入0.1 mol·L-1pH值6.8的磷酸鹽緩沖液1.8 mL，在37℃下孵育5 min后加入PNPG底物100 μL，再加入90 μL樣品，最后快速加入10 μL 5 U·mL-1α-葡萄糖苷酶啟動(dòng)反應(yīng)，在恒溫紫外可見光分光光度計(jì)中監(jiān)測其1 min內(nèi)在400 nm波長處吸光度的變化，計(jì)算α-葡萄糖苷酶的活性。重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)公式計(jì)算抑制率：

1.3.4 總酚含量的測定 參考王月華等[21]的方法，采用比色法測定不同濃度沒食子酸在765 nm波長下吸光值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.825x+0.046(R2=0.999)， 樣品測定方法同上。

1.3.5 油茶蒲提取物成分分析 參考陳亞琪[22]的方法，稍加修改。色譜條件：色譜柱：ChromCore AQ C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長254 nm(200～400 nm全波段掃描)；流動(dòng)相A：0.1%乙酸乙腈溶液，流動(dòng)相B: 0.1%乙酸水溶液；梯度洗脫：0～10 min，5%～10% A；10～15 min，10%～15% A；15～25 min，15%～30% A；25～26 min；30%～5% A；26～35 min，5% A。

3-O-甲基鞣花酸-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3-O-methylellagic acid-4′-O-β-D-glucopyranoside，MEAG)標(biāo)準(zhǔn)曲線：采用上述色譜條件，測定不同濃度下的峰面積，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=14 528.93x+57 709.93(R2=0.999)。

1.3.6 分子對(duì)接試驗(yàn) 分子對(duì)接試驗(yàn)采用分子計(jì)算模擬軟件AutoDock V4.2完成。α-葡萄糖苷酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:3A4A)從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫中獲得。采用ChemDraw18.0繪制配體沒食子酸(gallic acid，GA)、鞣花酸(ellagic acid，EA)和MEAG的結(jié)構(gòu)，并用Chem3D18.0進(jìn)行結(jié)構(gòu)能量優(yōu)化。對(duì)接前對(duì)蛋白和配體進(jìn)行除水、加氫原子、加 Gasteiger電荷處理。在進(jìn)行 Auto Grid 前設(shè)定 Grid Box 參數(shù)，x、y、z值均選定為126 ?，中心為(21.248，-2.088，15.868)，0.375 ?，使酶的活性催化中心被包含在設(shè)定的盒子內(nèi)部。在進(jìn)行AutoDock運(yùn)算時(shí)，選擇拉馬克遺傳算法進(jìn)行對(duì)接運(yùn)算并設(shè)定100次，其余計(jì)算參數(shù)使用軟件默認(rèn)值。根據(jù)對(duì)接結(jié)果，分析蛋白和配體的結(jié)合能、氫鍵、疏水作用等[23-24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Calcusyn 2.0、SPSS 22.0和Office Excel 2019軟件分析和處理數(shù)據(jù)，Origin 2018軟件繪制圖表，PyMOL和LigPlus制做分子對(duì)接圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶蒲提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制

由圖1可知，在相同濃度下油茶蒲提取物、水相、正丁醇相及乙酸乙酯相消化后的樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率要低于消化前的樣品，表明4組樣品經(jīng)消化后對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用出現(xiàn)了不同程度地下降。由圖2可知，消化前和消化后組樣品的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值均表現(xiàn)為乙酸乙酯相<正丁醇相<油茶蒲提取物<水相，即α-葡萄糖苷酶活性抑制強(qiáng)弱依次為乙酸乙酯相>正丁醇相>油茶蒲提取物>水相。經(jīng)體外消化后，4組樣品的IC50值存在不同程度地增長，其中油茶蒲提取物增長了61.85%，乙酸乙酯相增長23.49%，正丁醇相增長了28.55%，水相增長了101.92%。

注：A：油茶蒲提取物；B：水相；C：正丁醇相；D：乙酸乙酯相。圖4同。Note：A: Oiltea camellia extracts. B: Aqueous phase. C: n-Butanol phase. D: Ethyl acetate phase. Figure 4 are the same as.圖1 油茶蒲提取物消化前后對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of Oiltea Camellia extracts before and after digestion on α-glucosidase

圖2 油茶蒲提取物消化前后IC50Fig.2 IC50 of Oiltea Camellia extracts before and after digestion

2.2 油茶蒲提取物的總酚含量

由圖3可知，消化前后總酚含量依次表現(xiàn)為乙酸乙酯相>正丁醇相>油茶蒲提取物>水相；體外消化后油茶蒲提取物和正丁醇相的總酚含量分別下降16.52%和13.53%，水相上升24.48%，而乙酸乙酯相僅上升0.77%。乙酸乙酯相總酚含量最高，且經(jīng)體外消化后具有較好的穩(wěn)定性，總酚含量基本不變，表明油茶蒲提取物中存在大量中等極性的多酚物質(zhì)，且這部分酚類物質(zhì)在體外消化中能保持較好的穩(wěn)定性。油茶蒲提取物與正丁醇相經(jīng)體外消化后總酚含量下降，這與α-葡萄糖苷酶抑制率的變化趨勢一致。水相中總酚含量最少，體外消化后總酚含量上升，與α-葡萄糖苷酶抑制率的變化趨勢相反，且由圖2可以看出水相的IC50值上升了101.92%，遠(yuǎn)高于其他3組，表明水相的成分組成與其他3組樣品不同，且有效成分在體外消化條件下更不穩(wěn)定。

圖3 各樣品消化前后總酚含量對(duì)比Fig.3 Comparison of total phenolic content before and after digestion in each sample

2.3 油茶蒲提取物成分分析

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)結(jié)果如圖4所示，對(duì)4組樣品消化前后HPLC色譜圖中的23個(gè)峰進(jìn)行積分，分析峰面積與該樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶IC50值的相關(guān)性，共篩選出7個(gè)峰，按照出峰時(shí)間從早到晚排序，在圖4中標(biāo)注出1～7號(hào)峰。根據(jù)課題組前期試驗(yàn)[25]已知圖4中1、6、7號(hào)峰分別為GA、MEAG和EA。在消化前的樣品中，乙酸乙酯相中大部分成分含量遠(yuǎn)高于其他3組，正丁醇相成分組成與油茶蒲提取物相近，但多數(shù)峰面積高于油茶蒲提取物，并且MEAG含量最高；經(jīng)過體外消化后，油茶蒲提取物、正丁醇相和乙酸乙酯相中EA的含量上升明顯。

圖4 消化前后油茶蒲提取物及其分級(jí)萃取物色譜圖Fig.4 Chromatograms of Oiltea Camellia extracts and its fractionated extracts before and after digestion

根據(jù)HPLC數(shù)據(jù)結(jié)果分析，乙酸乙酯萃取能很好地從油茶蒲提取物中富集酚酸，有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，并且能減小體外消化對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的影響；正丁醇萃取也可以從油茶蒲提取物中富集部分多酚，對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制和在體外消化中主要活性成分的穩(wěn)定性優(yōu)于油茶蒲提取物弱于乙酸乙酯相；而水相中的成分含量遠(yuǎn)小于油茶蒲提取液，推測其主要成分為極性鞣質(zhì)物質(zhì)。

相關(guān)性分析結(jié)果如表1所示，其中1(GA)和7(EA)號(hào)峰的相關(guān)系數(shù)較低且P>0.05，2～6號(hào)峰峰面積與α-葡萄糖苷酶的IC50呈顯著相關(guān)(P<0.05)，表明其含量的增加會(huì)提高對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制。此外，2～5號(hào)峰為未知物質(zhì)，需后續(xù)利用液質(zhì)聯(lián)用等其他技術(shù)進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和活性驗(yàn)證。

表1 相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis

進(jìn)一步對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性相關(guān)性高的MEAG進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖5所示。MEAG在消化過程中相對(duì)穩(wěn)定，經(jīng)口攝入時(shí)，能夠保持其活性不受損失。此外，分級(jí)萃取有利于MEAG的富集，其中正丁醇相中MEAG的濃度為油茶蒲提取物的198.39%。

圖5 各樣品組中MEAG的濃度Fig.5 The concentration of MEAG in each sample group

2.4 分子對(duì)接

α-葡萄糖苷酶由一條亞基(589個(gè)氨基酸)構(gòu)成，蛋白晶體結(jié)構(gòu)分辨率為1.6 ?。在對(duì)接試驗(yàn)中，根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果中的結(jié)合自由能分析確定，篩選出化合物與α-葡萄糖苷酶結(jié)合自由能最低的構(gòu)象，做進(jìn)一步相互作用分析[26]。

AutoDock分析結(jié)果如表2所示，酚類物質(zhì)在氫鍵和疏水作用力共同作用下與α-葡萄糖苷酶相互作用，MEAG比GA和EA有更低的結(jié)合能和估計(jì)抑制常數(shù)，說明MEAG對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制優(yōu)于GA和EA。結(jié)合位點(diǎn)以及作用力分析如圖6和表3所示，MEAG的氫鍵數(shù)量以及疏水作用相關(guān)的氨基酸殘基都是三者中最多的，結(jié)果與表2一致。

表2 GA、EA和MEAG與α-葡萄糖苷酶模擬結(jié)合能Table 2 GA, EA, and MEAG with α-glucosidase mimetic binding energies

表3 GA、MEAG和EA與α-葡萄糖苷酶的分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of MEAG and EA with molecules of α-glucosidase

圖6 GA、EA和MEAG與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合位點(diǎn)處作用力分析Fig.6 Analysis of force at the binding site of GA, EA and MEAG to α-glucosidase

通過比較MEAG與EA的分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EA糖基化后提供了更多的羥基產(chǎn)生氫鍵，而另一側(cè)甲基增強(qiáng)了其疏水作用，使MEAG與α-葡萄糖苷酶的氨基酸殘基作用的氫鍵以及疏水作用力數(shù)量都多于EA。氫鍵與疏水作用力在多酚與α-葡萄糖苷酶相互作用中發(fā)揮了重要作用，在有些酚類中疏水作用力起到更重要的作用[27]，EA的氫鍵數(shù)少于GA但是其結(jié)合能低于GA，可能是因?yàn)镋A比GA有更短的氫鍵Asn472(2.57?)、更多的疏水作用氨基酸殘基數(shù)以及更強(qiáng)的疏水性。

圖7 MEAG與α-葡萄糖苷酶的3D結(jié)構(gòu)構(gòu)象Fig.7 3D conformation of MEAG and α-glucosidase

3 討論

相關(guān)研究顯示，通過抑制腸道中α-葡萄糖苷酶活性，可以降低其水解寡糖的速率，使得葡萄糖的生成減緩，防止血糖快速升高[28-29]。本研究結(jié)果表明，油茶蒲提取物在體外消化后對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性會(huì)降低，乙酸乙酯相對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果更好，在體外消化過程中具有更好的穩(wěn)定性；水相對(duì)α-葡萄苷酶的抑制效果最差，并且水相中的活性成分在體外消化過程中易被降解。推測油茶蒲提取物中抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要成分更容易被中等極性的乙酸乙酯富集，并且這部分活性成分在體外消化過程中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，具有開發(fā)利用價(jià)值。安莉[30]和沈忠明等[31]的研究顯示從植物中提取的鞣質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用，油茶蒲提取物中鞣質(zhì)含量可達(dá)6.75%[32]，但部分鞣質(zhì)在消化過程中會(huì)受到腸道pH值的影響發(fā)生降解，這可能是體外消化后油茶蒲提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制下降的原因之一。因此以油茶蒲為原料開發(fā)α-葡萄糖苷酶可能要考慮利用包埋等手段來降低消化對(duì)其活性的影響，同時(shí)可以分離篩選出油茶蒲在消化過程中較為穩(wěn)定的活性物質(zhì)。

利用分子對(duì)接等技術(shù)手段有助于發(fā)現(xiàn)新型α-葡萄糖苷酶抑制劑[33]，研究顯示分子對(duì)接的結(jié)合自由能與酶抑制效果呈負(fù)相關(guān)，即結(jié)合自由能越小，抑制效果越好[34]。陳海君等[35-36]利用超濾親和-液質(zhì)聯(lián)用和分子對(duì)接技術(shù)從毛菊苣根、毛菊苣種子中篩選出對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較高抑制作用的化合物。本研究發(fā)現(xiàn)MEAG與α-葡糖糖苷酶活性具有顯著相關(guān)性，分子對(duì)接結(jié)果表明，MEAG有最佳的結(jié)合能和估計(jì)抑制常數(shù)，且MEAG在體外消化中有很好的穩(wěn)定性。此外，EA的結(jié)合能與MEAG相近，并且消化后EA濃度顯著增長，但是這并未導(dǎo)致油茶蒲提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制的增強(qiáng)，而EA在體外消化后濃度大量增長主要來自于消化過程中鞣花酸鞣質(zhì)的降解[37]，推測鞣花酸鞣質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制比鞣花酸強(qiáng)或者相近。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了體外消化過程中油茶蒲提取物對(duì)α-葡糖糖苷酶活性抑制的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示其部分活性物質(zhì)在體外消化過程不穩(wěn)定，導(dǎo)致其在體外消化過程中活性減弱。同時(shí)，油茶蒲提取物中較為穩(wěn)定且對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)抑制活性的成分可以被正丁醇和乙酸乙酯富集，且乙酸乙酯富集效果最佳。相關(guān)性結(jié)果顯示有5種物質(zhì)與α-葡萄糖苷酶的IC50具有顯著負(fù)相關(guān)性，其中4中物質(zhì)未知，有待后續(xù)鑒定分析，僅有MEAG已知，并且MEAG在消化過程中有良好的穩(wěn)定性，具有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值。