虎杖苷十一碳烯酸酯的酶法合成與動力學研究

刁怡涵 李明依 畢艷紅 杜文迎 楊榮玲 王朝宇

(淮陰工學院生命科學與食品工程學院, 江蘇 淮安 223003)

黃酮苷類化合物是自然界中普遍存在的一類植物多酚代謝產(chǎn)物，具有獨特的化學結(jié)構(gòu)及生物和藥理活性[1-2]。在保持該類化合物基本骨架結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對某些官能團進行化學修飾是當前天然產(chǎn)物類新藥開發(fā)的重要手段之一[3]。天然產(chǎn)物化學家David J. Newman分析了34年來FDA(Food and Drug Administration)批準上市的1 562種天然產(chǎn)物類藥物，發(fā)現(xiàn)46%的藥物是攜帶有天然藥效基團的衍生物或者類似物[4]。

虎杖苷(Ploydatin)是中藥材虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt)的主要藥效成分，具有改善心肌損傷、抗動脈硬化、抗癌以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[5-6]。然而，虎杖苷的多羥基結(jié)構(gòu)導致其在脂質(zhì)體系中存在生物利用度低、溶解度差及結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等缺陷，限制了其在功能性食品、藥品及化妝品中的工業(yè)化應(yīng)用[7]。將黃酮苷類化合物的分子結(jié)構(gòu)進行適當修飾(如引入烷基鏈)，使其成為脂溶性藥物是解決上述問題的有效途徑[8]，如攜帶有不同結(jié)構(gòu)烷基鏈的蘆丁、芒果苷、櫻桃苷和柚皮苷均表現(xiàn)出更優(yōu)的生物活性[9-11]。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，含有雙鍵或苯環(huán)等功能性基團的烷基鏈與活性化合物的結(jié)合往往可以合成具有雙重功能的前導化合物，這為新藥的發(fā)現(xiàn)提供了思路[12-13]。

天然產(chǎn)物的化學法酰化修飾一般采用酰氯、酸酐等作為?；噭?，還需要進行繁瑣的保護/去保護步驟，導致副反應(yīng)多，污染環(huán)境[14-15]。與化學法相比，酶法?；揎椌哂羞x擇性高、減少雙鍵異構(gòu)化及產(chǎn)物組成簡單等優(yōu)勢，酶法?；揎椧阎饾u成為天然產(chǎn)物酰化修飾的主流方法[16-17]。本研究擬采用酶催化的方式，將虎杖苷與具有抗真菌抗病毒藥效的十一碳烯酸連接以制備具有潛在藥用價值的虎杖苷十一烯酸酯雙前藥(圖1)，并對酶促合成過程的動力學行為進行詳細研究，以期為綠色酶催化合成技術(shù)改進傳統(tǒng)化學合成過程提供借鑒。

圖1 酶促虎杖苷與十一碳烯酸乙烯酯的?；磻?yīng)Fig.1 Enzymatic regioselective acylation of polydatin with vinyl undecenoate

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固定化棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosuslipase，TLL，55 U·g-1)、固定化南極假絲酵母脂肪酶B(CandidaantarcticaB lipase，CAL-B，44 U·g-1)和固定化根霉脂肪酶(Rhizomucormiehelipase，RML，12.6 U·g-1)購于中國Novozymes公司；固定化洋蔥布克氏菌脂肪酶(Burkholderiacepacialipase，PSIM，12.4 U·g-1)購于日本Amano公司。虎杖苷(≥98%)和2-甲基四氫呋喃(2-MeTHF)(≥99%)購于中國Aladdin公司；十一碳烯酸乙烯酯(≥98%)購于上海TCI公司。乙腈和甲醇均為色譜純，購于廣東西隴化工公司。反應(yīng)介質(zhì)均需經(jīng)4 ?分子篩脫水48 h后使用。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀、Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，美國Agilent Technologies公司；BrukerAVANCE Digital 400 MHz超導核磁共振譜儀，德國Bruker公司；B-491旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI Labortechnik公司；CT15RE臺式高速離心機，日本Hitachi Koki公司；FA2004B電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司。

1.3 反應(yīng)初速度、底物轉(zhuǎn)化率、區(qū)域選擇性的計算

反應(yīng)初速度(V0)=(C0-Ct)/t，底物轉(zhuǎn)化率(C)=(C0-Ct)/C0×100%，區(qū)域選擇性6″-Regioselectivity=Cpi/Ctotal×100%。其中，C0和Ct分別代表反應(yīng)前后虎杖苷的濃度，Cpi和Ctotal分別代表?；a(chǎn)物和所有酰化產(chǎn)物的濃度之和。

1.4 不同脂肪酶對?；磻?yīng)的影響

取5個10 mL反應(yīng)瓶，分別加入3 mL 2-MeTHF和0.03 mmol虎杖苷，0.21 mmol十一碳烯酸乙烯酯，置于恒溫振蕩器中恒溫10 min(40℃，200 r·min-1)，其中4個反應(yīng)瓶分別加入2.75 U不同來源的脂肪酶(TLL、CAL-B、PSIM、RML)啟動反應(yīng)，另一反應(yīng)瓶不加脂肪酶作空白對照，定時取樣離心(10 000 r·min-1，4℃)10 min后進行液相色譜分析。

1.5 反應(yīng)介質(zhì)對酰化反應(yīng)的影響

取4個10 mL反應(yīng)瓶，分別加入3 mL不同溶劑(丙酮、2-甲基四氫呋喃、叔丁醇、四氫呋喃)和0.03 mmol虎杖苷，置于恒溫振蕩器中恒溫10 min(40℃，200 r·min-1)，分別加入0.21 mmol十一碳烯酸乙烯酯和2.75 U TLL啟動反應(yīng)，定時取樣離心(10 000 r·min-1， 4℃)10 min后進行液相色譜分析。

1.6 底物摩爾比對?；磻?yīng)的影響

取6個10 mL反應(yīng)瓶，分別加入3 mL丙酮和0.03 mmol虎杖苷，置于恒溫振蕩器中恒溫10 min(40℃，200 r·min-1)， 分別加入?；w(十一碳烯酸乙烯酯與虎杖苷摩爾比為3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1)和2.75 U TLL啟動反應(yīng)，定時取樣離心(10 000 r·min-1， 4℃)10 min后進行液相色譜分析。

1.7 溫度對?；磻?yīng)的影響

取6個10 mL反應(yīng)瓶，分別加入3 mL丙酮和0.03 mmol虎杖苷，分別置于不同反應(yīng)溫度(35、40、45、50、55和60℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1)的恒溫振蕩器中，加入0.27 mmol十一碳烯酸乙烯酯和2.75 U TLL啟動反應(yīng)，定時取樣離心(10 000 r·min-1，4℃)10 min后進行液相色譜分析。

1.8 酶促虎杖苷十一碳烯?；磻?yīng)的動力學研究

取24個10 mL反應(yīng)瓶，分別加入3 mL 2-MeTHF、丙酮、四氫呋喃和叔丁醇和不同濃度虎杖苷(4、6、8、10、12、14和16 mmol·L-1)，置于恒溫振蕩器中恒溫10 min(50℃，200 r·min-1)，以9∶1的摩爾比加入?；w及2.75 U TLL啟動反應(yīng)，定時取樣離心(10 000 r·min-1， 4℃)10 min后進行液相色譜分析，測定反應(yīng)初速度(V0)，根據(jù)Hans-Woolf 曲線得Km和Vmax。其中，Km為米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速率。

1.9 高效液相色譜分析與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

高效液相色譜儀，檢測波長為305 nm，流速1.0 mL·min-1?；⒄溶占磅サ谋Ａ魰r間分別為2.29和4.65 min。將1.7中的反應(yīng)放大20倍，過濾除去酶，以石油醚(petroleum ether，PE)/乙酸乙酯(ethyl acetate，EA)作為洗脫劑，進行快速柱層析，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到虎杖苷十一碳烯酸酯，并進行核磁共振分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源脂肪酶對虎杖苷十一碳烯?；磻?yīng)的影響

以反應(yīng)初速度、底物轉(zhuǎn)化率和6″-區(qū)域選擇性為衡量指標，研究了4種不同來源的固定化脂肪酶對酰化反應(yīng)的影響。由表1可知，不同來源的酶在催化相同的酰化反應(yīng)時表現(xiàn)出不同的催化特征，以來源于Thermomyceslanuginosus的固定化酶TLL的催化效果最佳，反應(yīng)初速度和底物轉(zhuǎn)化率分別達13.9 mmol·L-1·h-1和71.6%；其次是CAL-B，但其初速度僅為TLL的50.4%，為7.0 mmol·L-1·h-1。 就PSIM和RML而言，較低的反應(yīng)初速度和底物轉(zhuǎn)化率均表明二者的催化活性較低，特別是RML的底物轉(zhuǎn)化率僅為16.4%。同時，經(jīng)核磁共振分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可知，所用酶的催化位點均為虎杖苷分子結(jié)構(gòu)中的6″-OH，表現(xiàn)出了優(yōu)異的區(qū)域選擇性(100%)。

表1 不同來源脂肪酶催化虎杖苷十一碳烯酰化反應(yīng)Table 1 Regioselective undecenoylation of polydatin catalyzed by various lipases

2.2 反應(yīng)介質(zhì)對酶促虎杖苷十一碳烯?；磻?yīng)的影響

由表2可知，TLL在4種溶劑中均能催化虎杖苷的?；磻?yīng)，尤其以丙酮中最好，反應(yīng)初速度為17.3 mmol·L-1·h-1，底物轉(zhuǎn)化率亦高達86.0%。其次為2-MeTHF，效果較差的為叔丁醇和THF溶劑，不適宜作為本試驗中?；磻?yīng)的介質(zhì)。由表2還可知，酶的催化行為與溶劑的LogP、粘度和溶解度無相關(guān)性。如LogP在非水相酶催化中是重要的溶劑參數(shù)指標[18]，但TLL在LogP值最低的丙酮和最高的2-MeTHF中均表現(xiàn)出了較好的催化活性。此外，TLL在粘度相近的2-MeTHF和THF中表現(xiàn)出較大的催化差異。雖然虎杖苷在THF中溶解度是在其他溶劑中溶解度的數(shù)倍，高達72.1 mmol·L-1，但在THF中反應(yīng)初速度僅為2.3 mmol·L-1·h-1，底物轉(zhuǎn)化率僅為19.3%。由此可見，溶劑的多種性質(zhì)與酶促反應(yīng)活性并未呈現(xiàn)直接相關(guān)性，其對酶催化活性的影響是多方面的。

表2 反應(yīng)介質(zhì)對TLL催化虎杖苷十一碳烯?；磻?yīng)的影響Table 2 Effect of medium on enzymatic acylation of polydatin with vinyl undecenoate

2.3 底物摩爾比對酶促虎杖苷十一碳烯?；磻?yīng)的影響

TLL介導的?；磻?yīng)中?；w的量會對反應(yīng)有一定影響[17]。本研究將虎杖苷的濃度固定為10 mmol·L-1， 通過改變?；w的濃度來探究底物摩爾比對反應(yīng)的影響。如圖2所示，當?shù)孜锬柋冉橛?∶1 到9∶1 之間時，酶促反應(yīng)初速度及底物轉(zhuǎn)化率隨摩爾比的增大而明顯提高。當摩爾比升至9∶1時，二者升高至18.8 mmol·L-1·h-1和99.0%，進一步升高底物摩爾比對反應(yīng)的影響甚微。在所選擇的底物濃度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)的6″-區(qū)域選擇性始終保持在100%。表明在該?；磻?yīng)中存在水解反應(yīng)，當?；w和底物摩爾比達到9∶1時反應(yīng)初速度和轉(zhuǎn)化率達到峰值。

圖2 底物摩爾比對TLL催化虎杖苷十一碳烯?；磻?yīng)的影響Fig.2 Effect of the molar ratio on TLL-catalyzed acylation of polydatin

2.4 溫度對酶促虎杖苷十一碳烯酰化反應(yīng)的影響

由圖3可知，35℃時酶促反應(yīng)初速度為16.0 mmol·L-1·h-1， 隨著溫度上升，反應(yīng)初速度呈上升趨勢并在50℃時達到最大值20.8 mmol·L-1·h-1，因此50℃為反應(yīng)的最適溫度。繼續(xù)升高溫度，反應(yīng)速度迅速下降。本研究還發(fā)現(xiàn)，溫度的改變并未改變反應(yīng)的最大底物轉(zhuǎn)化率和區(qū)域選擇性，始終保持在100%，顯示出TLL較好的溫度適應(yīng)性。

圖3 溫度對TLL催化虎杖苷十一碳烯酰化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of the temperature on TLL-catalyzed acylation of polydatin with vinyl undecenoate

2.5 TLL催化虎杖苷十一烯?；磻?yīng)的過程曲線

酶促反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和區(qū)域選擇性隨反應(yīng)時間變化的規(guī)律如圖4所示，在20～100 min時，底物轉(zhuǎn)化率從11.5%上升到了80.0%，于200 min時達到98.4%；240～280 min時，底物轉(zhuǎn)化率則始終趨近100%，之后底物轉(zhuǎn)化率逐漸降低，在500 min時降至85.6%。在研究的時間范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)的產(chǎn)物始終是虎杖苷-6″-十一碳烯酸酯，顯示出穩(wěn)定的區(qū)域選擇性。

圖4 TLL催化虎杖苷十一碳烯?；磻?yīng)的過程曲線Fig.4 Process curve of TLL-catalyzed acylation of polydatin with vinyl undecenoate

2.6 不同反應(yīng)介質(zhì)中的酶促反應(yīng)的動力學研究

本研究利用米氏方程，并依據(jù)Hanes-Woolf曲線對酶促反應(yīng)的動力學參數(shù)進行了研究(圖5)。在所考察的介質(zhì)中，TLL在丙酮中的反應(yīng)初速度最大，為68.9 mmol·L-1·h-1。而就米氏常數(shù)而言，丙酮中的Km值為24.7 mmol·L-1，遠低于2-MeTHF(28.9 mmol·L-1)、叔丁醇(29.3 mmol·L-1)及THF(41.9 mmol·L-1)中的相應(yīng)值。催化效率(Vmax/Km)是衡量酶促反應(yīng)是否具有工業(yè)化應(yīng)用價值的重要標準，在丙酮中，該反應(yīng)Vmax/Km值為2.79 h-1，是在2-MeTHF、叔丁醇和THF中的1.3～6.6倍。

圖5 在丙酮(A)，2-甲基四氫呋喃(B)，叔丁醇(C)，四氫呋喃(D)中虎杖苷濃度對酶促酰化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of polydatin concentration on enzymatic acylation in acetone (A), 2-MeTHF (B), t-butanol (C), and THF (D) (Inset of Hanes-Woolf plot)

3 討論

酶的活性中心是影響酶促反應(yīng)的核心要素[19-20]。Pleiss等[21]曾將脂肪酶的活性中心劃分成裂縫狀、煙囪狀和隧道狀等不同形狀；且研究發(fā)現(xiàn)不同形狀的酶活性中心會影響底物分子中的活性基團與酶活性中心催化基團的結(jié)合，進而導致出現(xiàn)不同催化行為[22]。黃酮苷類化合物具有羥基眾多、空間結(jié)構(gòu)復雜的特點，不同位點的?；鶗a(chǎn)生一系列具有不同藥理活性的衍生物。虎杖苷結(jié)構(gòu)中糖基上6″-伯羥基相比于其他仲羥基具有更小的空間位阻和更高的催化活性，這可能有助于其進入裂縫狀的TLL活性中心，以親和、攻擊?；?酶過度中間體。進而形成優(yōu)勢產(chǎn)物6″-單酯[23-24]。同時，酰基供體采用乙烯酯能使該反應(yīng)成為準不可逆反應(yīng)，其副產(chǎn)物乙醛易與酶蛋白中賴氨酸的末端氨基形成Schiff′s堿，從而使酶失活[25]，但這種失活程度由酶中特定賴氨酸殘基的親核性決定，與脂肪酶的來源、分子量等性質(zhì)有關(guān)，這也是不同脂肪酶表現(xiàn)出不同催化活性的原因之一。此外，Kuo等[26]還發(fā)現(xiàn)有些脂肪酶可高效催化苷元中的4′-OH以形成相應(yīng)的酯，但是本研究并未發(fā)現(xiàn)4′-OH被?；孪牖⒄溶罩芯哂械妮^大空間位阻的糖基是導致上述現(xiàn)象的原因。

反應(yīng)介質(zhì)的性質(zhì)對酶催化行為有顯著影響[27-29]。如Laane等[18]認為酶在LogP>4的溶劑中表現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性，而在LogP<2的溶劑中幾乎沒有活性。但在本研究中，酶促反應(yīng)與溶劑的LogP并無直接相關(guān)性，粘度和溶解度同樣如此。Yang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，溶劑分子可占據(jù)酶的活性中心影響雙底物與活性中心的結(jié)合，而影響程度則取決于溶劑分子的類型以及空間構(gòu)型。由此可見，溶劑的多種性質(zhì)影響酶的催化行為。此外，溶劑的改變并未改變催化反應(yīng)的區(qū)域選擇性，這主要歸因于底物分子的特殊結(jié)構(gòu)。

TLL酶促虎杖苷?；磻?yīng)體系中存在產(chǎn)物酶促水解的副反應(yīng)，增加底物摩爾比有助于反應(yīng)向酯合成方向進行，且在摩爾比為9∶1時反應(yīng)速度和底物轉(zhuǎn)化率達到峰值。溫度對酶促反應(yīng)的影響主要涉及酶蛋白的熱失活及溶劑體系的熱改變[31]。如升高溫度可以賦予酶蛋白中化學鍵更高的能量，使其運動性增強，繼而帶來酶活性中心的結(jié)構(gòu)變化，最終導致酶催化行為的改變。此外，升高溫度還會導致反應(yīng)溶劑粘度下降，從而降低酶促反應(yīng)的傳質(zhì)阻力，提高反應(yīng)速度。當反應(yīng)時間超過280 min(圖4)，底物的最大轉(zhuǎn)化率略有降低，主要是由于隨著反應(yīng)的進行，酶促6″-十一碳烯酸酯的水解逐漸占據(jù)優(yōu)勢，導致產(chǎn)物減少。

非水相介質(zhì)中酶促雙底物?；磻?yīng)大都符合乒乓反應(yīng)機制。TLL在丙酮中的Km值最低，Vmax/Km值最大，表明在該溶劑中酶與底物的親和力更強，催化效率更高，這也與溶劑篩選的結(jié)果相一致(圖5)。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，CAL-B催化虎杖苷與山梨酸乙烯酯?；瘯r，CAL-B在2-MeTHF中展現(xiàn)出最佳的催化特性，表明相同介質(zhì)中酶促反應(yīng)的特征也會因酶源、底物的差異而不同，表明酶與溶劑的生物相容性會因反應(yīng)的改變而不同[23]。

4 結(jié)論

本研究以TLL為催化劑建立了綠色、高效、高選擇性合成虎杖苷十一碳烯酸酯雙前藥的生物催化體系，考察了酶源、反應(yīng)介質(zhì)、底物摩爾比及溫度等對反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，反應(yīng)介質(zhì)是影響酶催化活性的重要因素，但其LogP值、粘度以及溶解度等性質(zhì)參數(shù)卻與催化反應(yīng)活性無直接相關(guān)性，表明溶劑對酶催化行為的影響是多方面的；進一步的動力學研究也表明酶的催化行為會因酶源、底物的改變而不同。本研究為黃酮苷類化合物的合成提供了新途徑，還為綠色生物催化體系改造傳統(tǒng)化學合成過程提供了借鑒。