甘薯交替氧化酶基因家族生物信息學與表達分析

周淑倩 陳 璐 陳惠云 李永新 陳 剛 陸國權(quán) 楊虎清，*

(1 浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江 臨安 311300；2 寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，浙江 寧波 315040)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]原產(chǎn)于熱帶美洲，在其生長與貯藏過程中對低溫較為敏感。不適宜的貯藏環(huán)境會導致甘薯失水萎蔫、營養(yǎng)物質(zhì)流失，甚至發(fā)生病害侵染，其中低溫、干旱以及鹽脅迫是阻礙甘薯生長發(fā)育以及貯藏保鮮的重要逆境因子[1]。

交替氧化酶(alterative oxidase, AOX)是交替呼吸途徑的末端氧化酶，位于植物線粒體內(nèi)膜，主要存在于高等植物以及部分真菌和藻類中。交替呼吸途徑的電子流從細胞色素途徑的泛醌處分支，跨過復合物Ⅲ和Ⅳ兩個ATP形成位點，將電子與氧結(jié)合還原成水。AOX由核基因編碼，分屬AOX1和AOX2兩個亞家族，編碼蛋白分子質(zhì)量在32～39 kDa之間，大部分具有4個外顯子和3個內(nèi)含子。大多數(shù)雙子葉植物有AOX1和AOX2基因，而單子葉植物僅有AOX1基因[2]。模式植物和一些重要作物的AOX基因家族成員已經(jīng)被分離和鑒定，如擬南芥[3]、水稻[4]、大麥[4]、小麥[5]、煙草[6]等。此外，伽師瓜[7]、紅掌[8]、黃瓜[9]、鷹嘴豆[10]以及鵝掌楸[11]等植物的AOX基因家族也陸續(xù)被報道。研究表明不同物種間AOX 基因家族成員存在差異，同一物種中不同組織部位的AOX基因表達模式也有所不同，能夠隨著植物的生長發(fā)育而差異性表達[12]。AOX可作為活性氧清除劑，在線粒體呼吸鏈中有效地使分子氧與還原醌相互作用，降低活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生量，從而減少ROS對細胞的傷害，抑制細胞凋亡。AOX在調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)的產(chǎn)生中也發(fā)揮作用，交替呼吸途徑使得通過復合物Ⅲ和 Ⅳ的電子傳遞減少，從而防止電子泄漏到亞硝酸鹽和NO的積累[13-16]。此外，交替氧化酶具有增強植物抵御逆境能力的功能，諸多研究證明低溫[17]、高鹽[18]、輻射[19]、高溫[20-21]、干旱[22]、外源物質(zhì)(例如過氧化氫[18]、氯化鋁[23]、砷[24]以及一氧化氮[25]等)和化學處理[26]等脅迫以及病原體等其他生物或者微生物侵染[27]均可誘導AOX基因表達，提高交替呼吸途徑的運行量。

截止目前，關(guān)于甘薯AOX基因家族的研究尚鮮見報道。本研究通過甘薯數(shù)據(jù)庫篩選AOX 基因家族，從心香甘薯中鑒定AOX基因家族成員，并分析其生物學信息以及其在不同組織和生物及非生物脅迫下的表達模式，旨在為甘薯AOX基因的功能挖掘及抗逆提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

心香甘薯由臨安市靈溪甘薯專業(yè)合作社提供。將脫毒苗進行排苗培育，取莖尖處15 cm，除去下端葉子，僅留2～3片真葉扦插至穴盤，帶盆放在人工氣候箱內(nèi)進行培育(模擬晝夜：光照16 h/黑暗8 h；溫度25℃；濕度75%)，待長至4～6片真葉后分別取24株，進行4℃低溫、200 mmol·L-1鹽溶液以及20%聚乙二醇6000 (PEG-6000)水培處理，混合采集0、1、3、6、12、24、36和48 h后的幼嫩葉片樣品經(jīng)液氮速凍后于-80℃貯存。將其余脫毒苗繼續(xù)培養(yǎng)，在生長過程中采集花蕾樣品，成熟時采集塊根、須根、莖以及葉片4個組織部位樣品，經(jīng)液氮速凍后于-80℃貯存。甘薯塊根采后即刻運回實驗室，選擇大小均勻、無機械損傷和生物損傷的甘薯作為試驗材料，進行4℃低溫處理，分別在處理前(0 d)和處理后1、2、3、7、14、21、28 d隨機取5個塊根，去皮后取表層5 mm組織切丁，液氮速凍后于-80℃ 貯存。

將腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)菌株(KF255997.1)接種于PDA培養(yǎng)基，置于霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d(溫度28℃)。將新鮮甘薯的塊根洗凈，表面用酒精噴洗消毒備用。在塊根一端用打孔器打出約為5 mm深的小孔，接入活化的F.solani菌餅，置于恒溫培養(yǎng)箱(溫度25℃，濕度75%)中培養(yǎng)8 d。每天在距離接種部位1.5 cm處取樣，液氮速凍后于-80℃貯存。

RNAprep Pure Plant Plus Kit(DP441)購自天根生化科技(北京)有限公司，大腸桿菌 DH5α、克隆載體pMD19-T Vector、Taq酶以及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。DNA凝膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自北京擎科生物科技有限公司，引物同樣由該公司合成。

1.2 甘薯AOX基因家族篩選

利用HMMER 3.0軟件(http://hmmer.janelia.org/)，根據(jù)AOX保守Pfam序列(PF01786，https://pfam.xfam.org/)，在甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]基因組數(shù)據(jù)庫(https://ipomoea-genome.org/)中篩選甘薯AOX家族成員。以擬南芥(Arabidopsisthaliana)蛋白序列作為參考序列(在線信息資源庫https://arabidopsis.org/)，通過MEGA 5.0軟件對獲得的所有序列進行比對鑒定。

1.3 甘薯AOX基因家族克隆驗證

以cDNA為模板，設(shè)計全長引物擴增甘薯AOX基因家族各成員，如表1所示。PCR擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性35 s，58℃退火30 s，72℃延伸50 s，32個循環(huán)；72℃終延伸8 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，割膠回收純化的cDNA作為模板，采用pMDTM19-T VectorCloning Kit(TaKaRa，日本)試劑盒進行T-A克隆，回收產(chǎn)物與pMD19-T進行連接，得到pMD19-T-IbAOXs重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化及陽性克隆鑒定，收集陽性重組質(zhì)粒送北京擎科生物科技有限公司進行測序。

表1 甘薯AOX基因家族全長引物Table 1 Full-length primers of AOX gene family in sweetpotato

1.4 甘薯AOX蛋白多重序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用MEGA 5.0軟件對甘薯、擬南芥、番茄以及旋蒴苣苔等物種的AOX蛋白序列進行比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，bootstrap值設(shè)定為1 000[28]。

1.5 甘薯AOX基因家族生物信息學分析

利用在線工具ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)預測甘薯蛋白的等電點(pI)、分子量(molecular weight，MW)以及親水性平均系數(shù)(grand average of hydropathicity，GRAVY)等理化性質(zhì)并預測親疏水性圖；CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進行亞細胞定位預測；GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)進行基因結(jié)構(gòu)分析；MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)以及GenomeNet(https://www.genome.jp/)進行Motif分析并使用TBtools軟件美化；PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html 1.1)進行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析并創(chuàng)建蛋白二級結(jié)構(gòu)預測圖；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.6 實時熒光定量PCR分析

根據(jù)甘薯AOX基因序列設(shè)計特異引物，由北京擎科生物科技有限公司合成(表2)。

表2 甘薯AOX基因家族實時熒光定量PCR引物Table 2 qRT-PCR primers for AOX gene family in sweetpotato

使用 RNAprep Pure Plant Kit(Polysaccharides & Polyphenolics-rich) (TIANGEN，北京)試劑盒提取不同甘薯樣品總RNA，使用Primer ScriptTMRT Regent Kit with gDNA Eeaser(Perfect Real time) (TaKaRa，日本)試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，并用TB Green?Primer Ex TaqTM(TaKaRa，日本)試劑盒進行定量，定量PCR儀為StepOnePlusTMReal-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block(Thermo，美國)。

反應體系為20 μL：cDNA 2 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，TB Green Primer Ex Taq (Tli RNase Plus) (2×) 10 μL，ddH2O補齊至20 μL。反應程序采用兩步標準擴增程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，58℃退火30 s，40個循環(huán)；重復3次。以α-Tubulin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法[29]計算基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯AOX基因家族克隆鑒定

如圖1-A所示，PCR擴增得到3條約1 000 bp的條帶，以割膠回收純化的cDNA為模板，T-A克隆后對菌液進行PCR驗證，電泳圖譜如圖1-B所示。隨后送重組質(zhì)粒進行測序驗證，結(jié)果經(jīng)MEGA 5.0序列比對，發(fā)現(xiàn)得到的3個目的條帶序列與甘薯基因組數(shù)據(jù)庫僅有個別堿基不一致，可能是品種間差異導致的。

注：A：M：Marker；1：IbAOX1a；2：IbAOX1b；3：IbAOX2。B：M：Marker；1：pMD19-T-IbAOX1a 重組載體菌液；2：pMD19-T-IbAOX1b 重組載體菌液；3：pMD19-T-IbAOX2 重組載體菌液。Note: A: M: Marker. 1: IbAOX1a. 2: IbAOX1b. 3: IbAOX2. B: M: Marker. 1: PMD19-T-IbAOX1a recombinant carrier bacterial solution. 2: PMD19-T-IbAOX1b recombinant carrier bacterial solution. 3: PMD19-T-IbAOX2 recombinant carrier bacterial solution.圖1 IbAOXs 基因及 pMD19-T-IbAOXs 重組載體的菌液 PCR 擴增電泳Fig.1 PCR amplification of IbAOXs gene and pMD19-T-IbAOXs recombinant vector

進一步將克隆獲得的3個IbAOXs預測蛋白通過NCBI BLAST Protein與數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)比對結(jié)果，將獲得的目的基因依次命名并上傳NCBI，分別為IbAOX1a(GenBank登錄號：MT992313)、IbAOX1b(GenBank登錄號：MT992314)和IbAOX2 (GenBank登錄號：MG450566.1)。

2.2 甘薯AOX結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

經(jīng)基因組篩選和鑒定，獲得3個甘薯AOX基因家族成員，其編碼蛋白均含有AOX保守結(jié)構(gòu)域，其中IbAOX1a和IbAOX1b為AOX1亞家族，IbAOX2為AOX2亞家族成員。3個基因片段大小各不相同，cDNA全長在963～1 080 bp之間，均含4個外顯子和3個內(nèi)含子(圖2)，蛋白長度在320～359 aa之間。用EXPASy網(wǎng)站對甘薯AOX蛋白的理化性質(zhì)進行分析，如表3所示，其中親水性平均值與ExPASy-ProtScale預測結(jié)果一致，說明甘薯AOX蛋白均為親水性蛋白(圖3)。根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)標準(40 以下為穩(wěn)定蛋白)[8]可知，IbAOX1a和IbAOX1b屬于不穩(wěn)定蛋白，而IbAOX2屬于穩(wěn)定蛋白，這可能與IbAOX2恒定表達有關(guān)。根據(jù)CELLO 網(wǎng)站預測結(jié)果可知，甘薯AOX蛋白定位于線粒體。

圖2 甘薯AOX基因家族外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structure analysis of AOX genes from sweetpotato

圖3 甘薯AOX蛋白親疏水性分析Fig.3 Hydrophilic and hydrophobic analysis of AOX protein in sweetpotato

注:顏色由深至淺依次代表同源性達100%、75%、50%及小于50%。IbAOXs：甘薯(MT992313、MT992314、MG450566.1)；AtAOXs：擬南芥(NP_188876.1、NP_188875.1、NP_189399.1、NP_564395.1、AAY78882.1)；SlAOXs：番茄(NP_001234117.2、NP_001234120.1、 NP_001309890.1)；DhAOX：旋蒴苣苔(KZV31497.1)。Note: The color from dark to light represents 100%, 75%, 50% and less than 50% homology. IbAOXs: Ipomoea batatas (MT992313, MT992314, MG450566.1). AtAOXs: Arabidopsis thaliana (NP_188876.1, NP_188871.1, NP_189399.1, NP_564395.1, AAY78882.1). SlAOXs: Solanum lycopersicum(NP_001234117.2, NP_001234120.1, NP_001309890.1). DhAOX: Dorcoceras hygrometricum (KZV31497.1).圖4 甘薯AOX蛋白多重序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of AOX protein in sweetpotato

表3 甘薯AOX基因家族基本理化特性和亞細胞定位預測Table 3 Basic physicochemical characteristics and subcellular localization prediction of AOX gene family in sweetpotato

2.3 甘薯AOX蛋白多重序列比對及其進化分析

為了確定 IbAOXs與其他物種已知的 AOX 蛋白之間的進化關(guān)系，對甘薯、擬南芥和旋蒴苣苔等的 AOX蛋白序列進行了多重比對，并利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。多重序列比對表明(圖4)，AOX蛋白具有保守性，物種間的差異主要存在于N端的蛋白序列，這些非保守區(qū)可能決定著不同物種AOX蛋白的不同功能以及底物的差異選擇。所有序列中都存在特有與鐵離子結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域(EXXH、FXHR和EEE-Y)、可能同金屬離子結(jié)合的組氨酸殘基以及可能與二硫鍵聚合相關(guān)的絲氨酸殘基，這些結(jié)構(gòu)可能決定了AOX在植物中的功能與地位。進化樹表明(圖5)，AOX蛋白明顯分為兩大支，即AOX1和AOX2，從親緣關(guān)系來看，IbAOX1a與番茄SlAOX1b蛋白親緣關(guān)系最近，IbAOX1b與旋蒴苣苔DhAOX1b等蛋白親緣關(guān)系最近，而IbAOX2與擬南芥AtAOX2蛋白親緣關(guān)系最近。因此，甘薯AOX基因家族符合AOX家族在AOX1和AOX2亞家族分類事實。

圖5 甘薯AOX蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of AOX proteinin sweetpotato

2.4 甘薯AOX蛋白Motif序列分析

對3個甘薯AOX進行保守基序預測，共找到20個保守Motif元件(圖6、表4)。整個AOX基因家族的Motif分布較為一致，其中Motif1～7在所有蛋白序列中均存在，有規(guī)律地集中分布在C端，表明其與AOX蛋白保守結(jié)構(gòu)域AOX (PF01786)密切相關(guān)，其中Motif2和Motif4還與Dabb結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)，該結(jié)構(gòu)域功能尚未知，但在多種植物的一類脅迫響應蛋白中發(fā)現(xiàn)，表明該結(jié)構(gòu)域可能具有應對脅迫的功能。根據(jù)SMART和GenomeNet分析可知，Motif10、Motif14和Motif20與LRR_TYP結(jié)構(gòu)域相關(guān)，可能參與多種生物學過程，包括信號轉(zhuǎn)導、抗病性、細胞凋亡和免疫反應等；Motif9～14、Motif16、Motif18和Motif19與FoP_duplication結(jié)構(gòu)域相關(guān)，對于依賴雌激素的基因激活至關(guān)重要；Motif8和Motif17與eIF1a結(jié)構(gòu)相關(guān)Motif，具有翻譯起始因子活性。各個AOX蛋白都存在數(shù)個保守基序的缺失，其中IbAOX1b所含Motif元件最多，僅缺Motif15和Motif20；IbAOX1a缺失了Motif8、Motif9、Motif11、Motif12以及Motif17共5個元件；而IbAOX2保守基序缺失最多，共缺失了Motif10、Motif13、Motif14、Motif16、Motif18以及Motif19等6個元件。從整體來看，序列所含保守基序數(shù)量、類型、分布上的差異，可能揭示了各個基因具有不同的功能。

圖6 甘薯AOX蛋白Motif1～Motif20 分析Fig.6 Analysis of AOX protein Motif1～Motif20 in sweetpotato

表4 甘薯AOX蛋白酸保守序列Table 4 Conserved sequence of AOX protein in sweetpotato

2.5 甘薯AOX蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預測

由表5可知，α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲在IbAOX1a蛋白的二級結(jié)構(gòu)中分別占47.19%、14.06%、7.50%和31.25%；在IbAOX1b蛋白的二級結(jié)構(gòu)中分別占46.80%、12.53%、5.85%和34.82%；在IbAOX2蛋白的二級結(jié)構(gòu)中分別占60.64%、7.00%、4.57%和27.99%；利用SWISS-MODEL進行三級結(jié)構(gòu)預測(圖7)，與蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相符。

表5 甘薯AOX蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Table 5 Analysis of the secondary structure of AOX proteins in sweetpotato /%

圖7 甘薯AOX蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預測Fig.7 Prediction of the secondary and tertiary structure of AOX protein in sweetpotato

2.6 甘薯AOX基因家族的組織表達特性分析

分別提取甘薯塊根、須根、莖、葉片、花蕾的總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，采用qRT-PCR分析IbAOXs基因在甘薯不同組織中的表達模式，結(jié)果如圖8所示。IbAOXs基因的表達具有組織特異性，其中IbAOX1a基因在葉片中表達量極高，其次為須根，在莖和塊根組織中表達量較低，花蕾中幾乎沒有表達；IbAOX1b基因在塊根中表達量最高，其次為須根，在葉片中的表達約為塊根的1/3，在花蕾中表達約為塊根的1/10，在莖中表達量最低。同樣，IbAOX2基因也在塊根中表達量最高，其次分別為葉片、莖和須根，花蕾中幾乎沒有表達。

注: 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level.圖8 甘薯IbAOXs基因塊根、須根、莖、葉片以及花蕾的表達特異性分析Fig.8 Expression analysis of IbAOXs genes in tuberous roots, fibrous roots, stems, leaves and buds of sweetpotato

2.7 甘薯AOX基因家族在脅迫下的表達分析

2.7.1 甘薯幼嫩葉片AOX在低溫脅迫下的表達分析 分析4℃處理下甘薯幼嫩葉片AOX基因的表達模式，如圖9-A所示。IbAOX1a和IbAOX1b基因均表達上調(diào)。其中，IbAOX1a基因在低溫處理3 h后表達量最高，且隨著低溫處理時間的延長，表達量下降；IbAOX1b基因在低溫處理3 h時出現(xiàn)一個小高峰，隨后逐漸降低，在處理24 h時表達量再次上調(diào)。IbAOX2基因則對低溫沒有響應，低溫脅迫下該基因表達量不變。

注: 兩點之間差異大于LSD表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: The difference between the two points is greater than LSD indicate significant differences at 0.05 level. The same as following.圖9 甘薯幼苗中IbAOXs基因響應低溫、干旱及高鹽脅迫表達分析Fig.9 Analysis of IbAOXs gene expression in sweetpotato seedlings in response to low temperature drought and high salt stress

2.7.2 甘薯幼嫩葉片AOX在干旱脅迫下的表達分析 為了進一步研究甘薯AOX基因?qū)ζ渌{迫的響應，對甘薯薯苗進行PEG-6000處理，如圖9-B所示。IbAOX1a和IbAOX1b基因均呈先升后降的表達趨勢，在處理24 h時表達量達到最高，其中IbAOX1a的表達峰值約為IbAOX1b的3倍。同樣，IbAOX2對干旱脅迫沒有響應，干旱脅迫處理下表達量也無顯著變化(P>0.05)。

2.7.3 甘薯幼嫩葉片AOX在高鹽脅迫下的表達分析 用200 mmol·L-1NaCl溶液處理甘薯薯苗，qRT-PCR分析甘薯AOX基因?qū)Ω啕}的響應，結(jié)果如圖9-C所示。IbAOX1a和IbAOX1b基因均在處理6 h時達到表達高峰，峰值和變化趨勢基本一致。IbAOX2基因則呈現(xiàn)組成型表達模式。

2.7.4 甘薯塊根AOX在低溫脅迫下的表達分析 進一步探索甘薯塊根受低溫脅迫時，AOX基因的響應情況。對4℃低溫處理的甘薯塊根進行qRT-PCR分析，結(jié)果如圖10-A所示。IbAOX1a和IbAOX1b基因表達量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在14 d時達到高峰，但塊根IbAOX1a對低溫脅迫的響應強度高于IbAOX1b，其表達高峰約為IbAOX1b的2.5倍。低溫下，IbAOX2基因的表達量恒定。

2.7.5 腐皮鐮刀菌(F.solani)侵染甘薯塊根AOX的表達分析 將甘薯塊根接種F.solani，并測定AOX基因的相對表達量，結(jié)果如圖10-B所示。IbAOX1a在接種4 d時表達增加20倍，而IbAOX1b基因隨著染菌進程而迅速增加，在7 d時達到表達高峰，增加約300倍。生物脅迫下，IbAOX2基因仍然呈現(xiàn)組成型表達模式。

圖10 甘薯塊根中IbAOXs基因響應低溫及F. solani侵染的表達分析Fig.10 Analysis of IbAOXs gene in tuberous roots in response to low temperature and F. solani

3 討論

AOX是由核基因編碼的，定位于植物線粒體中的一類蛋白酶，是線粒體呼吸途徑的重要組分[12]。目前已知AOX基因家族幾乎存在于所有高等植物、真菌、細菌以及藻類中，在少部分低等動物中也有發(fā)現(xiàn)。AOX基因家族是只有2個亞家族的較小基因家族，通常分為AOX1和AOX2[30]。本研究利用已發(fā)表的甘薯基因組數(shù)據(jù)[31]，篩選并克隆得到3個AOX基因IbAOX1a、IbAOX1b和IbAOX2。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明甘薯AOX基因同樣分屬AOX1與AOX2兩個亞家族，該結(jié)果與前人研究一致[12]。不同植物的AOX基因家族構(gòu)成差異較大[3-5,9,32-33]，如擬南芥所含的AOX基因家族包括AtAOX1a、AtAOX1b、AtAOX1c、AtAOX1d和AtAOX2[3]；水稻AOX基因家族僅有AOX1亞家族，分別包括OsAOX1a、OsAOX1b及OsAOX1c[4]；而黃瓜中僅有1個AOX2基因位于4號染色體[9]。本研究結(jié)果進一步表明，不同植物中AOX基因具有多樣性，所含亞家族與基因數(shù)量存在差異[12]。將IbAOXs蛋白序列與其他物種進行同源性分析發(fā)現(xiàn)，不同物種的AOX蛋白序列C端均很保守，存在完全相同的功能位點，而N端差異較大，這可能與AOX基因的功能差異以及活性強弱相關(guān)。將來自不同物種的AOX蛋白進行比對并構(gòu)建進化樹，分析發(fā)現(xiàn)AOX在不同物種中具有較強的保守性，在所有物種中IbAOX1a、IbAOX1b、IbAOX2蛋白分別與SlAOX1b、DhAOX1b、AtAOX2蛋白具有較高的同源性，說明不同物種的AOX蛋白兩兩之間可能具有相似的功能，在后續(xù)研究中可以充分利用物種間的相似性與差異性進行關(guān)聯(lián)分析。

AOX1在大多數(shù)植物中均存在，與逆境脅迫相關(guān)，而AOX2僅存在于雙子葉植物中，通常與組織發(fā)育特性有關(guān)[12]，由此可知甘薯屬于雙子葉植物，同時具有兩個亞家族，與本研究結(jié)果一致。組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)IbAOXs在塊根、須根、莖、葉片以及花蕾中均有表達，且表達差異明顯，在5個組織部位中IbAOX1a基因在葉片中表達量最高，IbAOX1b和IbAOX2基因均在塊根中表達量最高，而IbAOX1a和IbAOX2基因在花蕾中幾乎沒有表達。Saisho等[34]研究發(fā)現(xiàn)，AtAOX1a和AtAOX1c在8周齡的花、芽、莖和根中都有表達，AtAOX1b僅在花和芽中表達，而AtAOX2主要在莖和根中表達。表明植物中AOX基因家族成員存在組織表達特異性，且隨著植物生長發(fā)育而差異表達，這與各個AOX基因的功能與特性有關(guān)。前人研究表明，在AOX基因中AOX1a對脅迫的響應最強烈，受大多數(shù)非生物脅迫誘導，包括干旱，寒冷，高鹽，高光照和缺氮等[35-37]。本試驗進一步證明了該結(jié)論，在本研究中，甘薯AOX1亞家族成員IbAOX1a和IbAOX1b明顯受到脅迫的誘導，但IbAOX2不響應脅迫而恒定表達。甘薯在非脅迫環(huán)境下，細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和代謝呈現(xiàn)動態(tài)平衡。當甘薯受到外界脅迫時，電子傳遞鏈中細胞色素呼吸主路受到抑制，活性氧不斷積累。此時，交替呼吸途徑被誘導啟動，IbAOX1a和IbAOX1b基因表達上調(diào)，清除多余的活性氧，以防過量的活性氧攻擊細胞成分，導致核酸損傷、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化等不良影響。在短期內(nèi)，甘薯可以維持正常的生命活動，由此表明，2個基因?qū)Ω适淼挚姑{迫均有重要作用。本研究分別對甘薯鮮嫩葉片和塊根進行了低溫處理，IbAOX1a和IbAOX1b基因均受到低溫誘導而上調(diào)表達，得以抵抗低溫脅迫。Chen等[38]研究表明，黃體酮有效增強了IbAOX1的轉(zhuǎn)錄水平和AOX的活性，以介導抗氧化系統(tǒng)和脯氨酸的積累，降低了膜通透性、丙二醛水平和活性氧的產(chǎn)生，進而抑制了甘薯冷害的形成。Zhang等[39]通過冷鍛煉和水楊酸肟酸(AOX抑制劑)處理分別誘導和抑制的甘薯AOX基因的表達，結(jié)果表明冷鍛煉預處理顯著降低了甘薯塊根冷害癥狀，而水楊酸肟酸處理加速了甘薯塊根的冷害。由此可推測，甘薯AOX響應脅迫越強烈，其抗冷性越強，本研究結(jié)果為今后利用該基因培育強抗冷性甘薯種質(zhì)資源提供了一定的理論依據(jù)。除此之外，IbAOX1a和IbAOX1b基因還受到干旱、高鹽以及F.solani脅迫的誘導，上述非生物脅迫中IbAOX1a的轉(zhuǎn)錄本豐度均高于IbAOX1b，生物脅迫下IbAOX1b的表達量比IbAOX1a高了十倍，而IbAOX2在脅迫下均呈現(xiàn)恒定表達，3個AOX基因在不同逆境脅迫下的表達模式均不同。

4 結(jié)論

本研究通過篩選甘薯基因組，獲得了3個IbAOX基因，并成功克隆得到全部序列。進一步通過分析甘薯AOX基因家族各成員的表達特異性及脅迫應答模式，發(fā)現(xiàn)甘薯IbAOX1a和IbAOX1b基因強烈響應F.solani的生物脅迫和低溫、干旱及高鹽的非生物脅迫。由此可以推測，兩個基因可能在甘薯應對逆境脅迫中起到重要作用。IbAOX1a和IbAOX1b響應逆境脅迫的表達模式有所不同，其中IbAOX1a對低溫響應更強烈，而IbAOX1b對真菌侵染更為敏感，IbAOX1a和IbAOX1b可能分別在甘薯應對非生物脅迫和生物脅迫中占有更突出的地位。后續(xù)研究可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進一步提高植物AOX基因表達量，從而提高植物抗逆境脅迫的能力。