利用分子標(biāo)記輔助選擇Pigm-1基因改良恢復(fù)系R20的稻瘟病抗性

何旎清 楊德衛(wèi) 鄭向華 黃鳳凰 程朝平 葉 寧

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 福建 福州 350018)

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是一種世界性病害[1]，也是我國水稻新品種審定中實(shí)行“一票否決制”的水稻病害，近年來其危害性和蔓延面積呈不斷上升的趨勢(shì)。稻瘟病不僅會(huì)引起水稻大幅減產(chǎn)(10%～35%)[2]，嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無收[3]，而且能影響稻米品質(zhì)。國內(nèi)外研究者利用不同的研究方法和不同的遺傳定位群體，已鑒定了500多個(gè)稻瘟病相關(guān)基因，這些基因分別位于水稻12條不同的染色體上[2]。其中，研究者利用圖位克隆等方法，已從水稻中克隆了Pit、Pi2、Pi9、Piz-t、Pigm、Pib和Pita等25個(gè)稻瘟病抗性R基因[2]。

谷梅4號(hào)是起源于我國農(nóng)家品種的育種材料。近期，何祖華研究團(tuán)隊(duì)從起源于我國農(nóng)家品種的育種材料谷梅4號(hào)中鑒定了1個(gè)廣譜持久的抗瘟性新位點(diǎn)Pigm[3]。Pigm是包含多個(gè)NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat)類抗病基因的基因簇，含有PigmR和PigmS，PigmR表達(dá)導(dǎo)致水稻千粒重降低、產(chǎn)量下降；與PigmR相反，PigmS受表觀遺傳的調(diào)控，僅在水稻花粉中特異高表達(dá)，從而提高水稻的結(jié)實(shí)率，抵消PigmR對(duì)產(chǎn)量的影響[3]。進(jìn)一步研究表明新型轉(zhuǎn)錄因子PIBP1與PigmR以及其他類似的抗病蛋白Pizt、Pi9特異性互作，促進(jìn)自身細(xì)胞核蛋白的累積，從而激活下游防御反應(yīng)[4]。本研究前期利用圖位克隆的方法，從雙抗77009中克隆了一廣譜抗稻瘟病基因Pigm-1，Pigm-1包含Pigm-1R和Pigm-1S，Pigm-1S與PigmS序列完全一樣，而Pigm-1R與PigmR存在3個(gè)堿基的差異，是Pigm新的等位基因；抗性鑒定表明Pigm-1對(duì)來自我國不同稻作區(qū)的多個(gè)稻瘟病生理小種均表現(xiàn)抗病性[5]。

目前防治稻瘟病最有效、最經(jīng)濟(jì)、最根本的方法是選育和推廣抗病品種[3]，而廣譜抗病R基因介導(dǎo)的抗性高效且可操作性強(qiáng)。利用廣譜、抗性持久的抗稻瘟病R基因，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，是培育抗稻瘟病水稻品種最有效的手段之一。目前已有利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)將水稻抗病基因轉(zhuǎn)入水稻材料的報(bào)道，倪大虎等[6]利用分子標(biāo)記技術(shù)將抗稻瘟病基因Pi9和抗白葉枯基因Xa21和Xa23同時(shí)聚合到了水稻中；Jiang等[7]應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，育成了同時(shí)攜帶Pi1和Pi2的不育系金23A；趙國超等[8]利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，育成了同時(shí)攜帶Pi9、Pita、Pib和Pigm基因的兩系不育系2179S。

水稻三系恢復(fù)系R20是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所種質(zhì)創(chuàng)制研究室通過常規(guī)雜交技術(shù)育成的優(yōu)質(zhì)秈型恢復(fù)系，但其稻瘟病抗性弱。在滿足高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和廣適應(yīng)性等育種目標(biāo)的基礎(chǔ)上，提高水稻品種的稻瘟病抗性水平，已成為廣大水稻育種追求的目標(biāo)。鑒于此，本研究以雙抗77009 為抗性基因Pigm-1的供體親本，以感病恢復(fù)系R20為受體親本，通過雜交與回交的方法，并利用Pigm-1基因的功能分子標(biāo)記，開展分子標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐，定向改良優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系R20的稻瘟病抗性，旨在為稻瘟病抗稻瘟病基因Pigm-1的分子育種研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供體Pigm-1親本：雙抗77009為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所種資資源研究室保存的一個(gè)抗性品種，在安徽省黃山、福建省上杭、江西省井岡山和湖北省宜昌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的稻瘟病抗性[5]。受體親本：R20是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所種質(zhì)創(chuàng)制研究室通過常規(guī)雜交技術(shù)育成的優(yōu)質(zhì)秈型恢復(fù)系。

1.2 抗性鑒定

室內(nèi)稻瘟病抗性鑒定：接菌參照Yang等[5]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。將帶有Guy11孢子的濾紙片放置到完全(complete medium, CM)培養(yǎng)基中，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)接到米糠培養(yǎng)基中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到菌絲長滿培養(yǎng)基，將菌絲輕輕刮去，放于28℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行產(chǎn)孢。5～7 d后將孢子刮下，并用0.2%的Tween-20將孢子濃度調(diào)整為1×105個(gè)·mL-1，均勻地噴霧到生長15 d左右的水稻葉片表面，將噴菌后的幼苗放置在26℃條件下黑暗培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)移至長日照接菌室6～7 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病表型。

田間稻瘟病抗性表型鑒定：受體親本R20和改良系R20-1、R20-2、R20-3和R20-4經(jīng)室內(nèi)催芽后于2020年5月18日播種于福建省上杭縣茶地鄉(xiāng)農(nóng)技站天然病圃，期間進(jìn)行常規(guī)管理，不打農(nóng)藥。同年6月5日對(duì)每個(gè)株系進(jìn)行苗期稻瘟病抗性調(diào)查和統(tǒng)計(jì)。

1.3 稻瘟病抗性基因Pigm-1的功能標(biāo)記

抗性基因Pigm-1的功能標(biāo)記參考Yang等[5]開發(fā)的標(biāo)記Pigm-1F: T T A T T T C G T T T G C T A T G C; Pigm-1R: G G A C T A T G T G A T C G G T T A。

1.4 性狀調(diào)查

2020年7月，將供試材料種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所實(shí)驗(yàn)農(nóng)場。雙抗77009、R20、R20-1、R20-2、 R20-3和R20-4分別種植1個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植3行，每行種20 株，每個(gè)小區(qū)設(shè)置 3個(gè)重復(fù)，常規(guī)管理。

水稻株高、穗長和分蘗數(shù)等相關(guān)性狀的調(diào)查和分析參考Yang等[9]的方法；稻谷粒長和粒寬等測(cè)定參照Tan等[10]的方法。

1.5 水稻DNA的提取及電泳檢測(cè)

水稻葉片DNA提取、樣品PCR擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)分析參照楊德衛(wèi)等[11]的方法。

1.6 改良恢復(fù)系R20稻瘟病抗性方法

以親本R20為母本，抗稻瘟病親本雙抗77009為父本，雜交后，再以R20為回輪親本進(jìn)行回交，回交過程中跟蹤分子標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙親水稻的稻瘟病抗性分析

本研究利用稻瘟病菌Guy11對(duì)雙抗77009和R20進(jìn)行室內(nèi)稻瘟病接種，結(jié)果表明雙抗77009表現(xiàn)抗病，R20表現(xiàn)感病(圖1)。

2.2 利用分子標(biāo)記改良恢復(fù)系R20的稻瘟病抗性

為了改良恢復(fù)系R20稻瘟病抗性，本研究以受體親本R20為母本，以供體親本雙抗77009為父本進(jìn)行雜交，接著用親本R20為父本進(jìn)行連續(xù)回交，回交過程中跟蹤分子標(biāo)記，選擇含有Pigm-1基因的單株為母本繼續(xù)回交，直到BC3F1，后再自交得到BC3F2，繼續(xù)跟蹤分子標(biāo)記，并綜合農(nóng)藝性狀，獲得8份含有Pigm-1基因的單株，將這些單株連續(xù)種植兩代并跟蹤分子標(biāo)記，在綜合株高、抽穗期和結(jié)實(shí)率等相關(guān)農(nóng)藝性狀情況下，最終獲得4份農(nóng)藝性狀優(yōu)良與R20性狀相似的穩(wěn)定材料，分別命名為R20-1、R20-2、R20-3和R20-4，分子標(biāo)記檢測(cè)均含有稻瘟病抗性基因Pigm-1。

圖1 雙抗77009和R20室內(nèi)接種稻瘟菌Guy11抗性表現(xiàn)Fig.1 Resistance performance of Shuangkang77009and R20 with rice blast fungus Guy11

2.3 改良恢復(fù)系的稻瘟病抗性鑒定分析

室內(nèi)抗性鑒定結(jié)果表明，4份改良系均表現(xiàn)出抗病(圖2-A)。進(jìn)一步在自然條件下進(jìn)行抗性鑒定。結(jié)果表明對(duì)照親本R20表現(xiàn)出感病，4份改良系均表現(xiàn)出抗病(圖2-B)。

圖2 受體親本R20與4個(gè)改良系室內(nèi)接菌(A)和田間抗性鑒定(B)比較Fig.2 Comparison of indoor inoculation (A) and field resistance identification (B) between R20 and four improved lines

2.4 改良恢復(fù)系的主要農(nóng)藝性狀分析

對(duì)4份改良系和受體親本R20在成熟期進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查。結(jié)果表明，受體親本R20與R20-1、R20-2、 R20-3相比，其株高、穗長、有效穗、每穗穎花數(shù)、結(jié)實(shí)率、粒長、粒寬和千粒重等性狀無顯著差異(表1)；R20與R20-4相比，株高、穗長、有效穗、每穗穎花數(shù)、結(jié)實(shí)率和粒寬等性狀無顯著差異，而粒長(圖3)和千粒重表現(xiàn)出極顯著差異(表1)。

表1 受體親本R20與4個(gè)改良系株高、穗長和千粒重等主要農(nóng)藝性狀比較Table 1 Comparison of main agronomic traits for plant height, panicle length and thousand seeds weight between R20 and four improved lines

2.5 改良恢復(fù)系遺傳背景分析

利用 326 對(duì)均勻分布于水稻12條染色體上的SSR標(biāo)記對(duì)雙抗77009和R20兩個(gè)親本進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明有89對(duì)SSR引物在雙親之間能檢測(cè)多態(tài)性。利用這89對(duì)SSR引物對(duì)R20-1、R20-2、R20-3 和R20-4這4個(gè)穩(wěn)定的純合材料進(jìn)行遺傳背景檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。株系R20-1在第1號(hào)染色體上的標(biāo)記RM5496為純合基因型，在第6號(hào)染色體上的標(biāo)記RM3498為雜合基因型；株系R20-2在第3號(hào)染色體上的標(biāo)記RM6832為純合基因型，在第8號(hào)染色體上的標(biāo)記RM3496為純合基因型；株系R20-3在第7號(hào)染色體上的標(biāo)記RM11為純合基因型；株系R20-4 在第1號(hào)染色體上的標(biāo)記RM5496為純合基因型，在第12號(hào)染色體上的標(biāo)記RM17為純合基因型。這4個(gè)株系都基本恢復(fù)了受體親本的背景，其中有3個(gè)株系含有供體的2個(gè)片段，有1個(gè)株系含有供體的1個(gè)片段。

圖3 受體親本R20與改良系R20-4的粒長差異比較Fig.3 Comparison of main agronomic traits for grain length between R20 and R20-4

圖4 4個(gè)改良系遺傳背景分析Fig.4 Genetic background analysis of four improved lines

3 討論

水稻稻瘟病是水稻的重要病害之一，給我國甚至全世界水稻的安全生產(chǎn)帶來了巨大隱患[12-14]。傳統(tǒng)水稻抗病育種是通過接種或在發(fā)病區(qū)進(jìn)行抗性鑒定等方式，然后通過人工表型選擇，再進(jìn)行抗性鑒定，工作量大、耗時(shí)；同時(shí)受外界環(huán)境影響大，鑒定不準(zhǔn)確，導(dǎo)致抗性選擇的效率低。而利用抗性基因的功能標(biāo)記，再借助于分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，可以減少或消除這些不利因素，是培育水稻抗病品種的最有效途徑之一[15]。

抗性基因常常與不良性狀緊密連鎖，盡管目前利用分子標(biāo)記輔助選擇抗稻瘟病基因來改良水稻稻瘟病抗性的研究已取得一定進(jìn)展，但存在無法同時(shí)保證產(chǎn)量的缺點(diǎn)[16-17]。例如劉文強(qiáng)等[18]研究表明Pi25(t)與水稻結(jié)實(shí)率和每穗實(shí)粒數(shù)等性狀之間存在連鎖累贅；向小嬌等[19]研究表明pi21可能與水稻產(chǎn)量性狀之間存在連鎖累贅；Zhou等[20]研究表明Pi2與水稻抽穗期Hd1緊密連鎖，導(dǎo)入Pi2后水稻抽穗期將推遲；Patroti等[21]研究表明Pi1、Pi2和Pi54與不良性狀的連鎖阻力在0.2～2 Mb之間。本研究利用前期克隆廣譜抗稻瘟病基因Pigm-1[5]， 通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，獲得4份穩(wěn)定的R20抗稻瘟病改良系，除了株系R20-4外，其余株系農(nóng)藝性狀與受體親本均無顯著差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，改良系R20-4除表現(xiàn)抗稻瘟病外，其粒長和千粒重均顯著高于受體親本R20。綜上所述，本研究不僅獲得了抗稻瘟病的改良系R20-1、R20-2和R20-3，還獲得了抗病和產(chǎn)量均得到提高的改良系R20-4。此外，大部分已鑒定和克隆的稻瘟病抗性基因抗譜較窄，難以應(yīng)用于水稻抗病育種實(shí)踐[3，22-23]，且長期使用單一類別的稻瘟病抗性基因，會(huì)促進(jìn)稻瘟病菌產(chǎn)生新的優(yōu)勢(shì)生理小種，導(dǎo)致原有抗病基因效果減弱或完全失效[24]。本研究利用的抗病基因Pigm-1具有良好的廣譜抗病性[5]，可用于豐富抗病基因資源。由此可知，稻瘟病抗性基因Pigm-1在水稻抗稻瘟病育種方面可能具有良好的應(yīng)用前景。

分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)是作物遺傳改良應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，對(duì)作物分子育種具有極其重要的作用[25]。在育種研究中，可以根據(jù)育種材料的實(shí)際情況，利用新技術(shù)、新方法及種業(yè)體制改革和品種審定的多元化條件，對(duì)分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，其中供體親本是分子標(biāo)記輔助育種的核心。但利用常規(guī)雜交法將有利基因從野生稻等原始材料中轉(zhuǎn)入改良品種耗時(shí)較長，同時(shí)存在雜種不育、與不利性狀基因連鎖及株葉形態(tài)不理想等問題[26-27]。例如，前期水稻優(yōu)異基因的挖掘和利用課題組通過構(gòu)建近等基因系，將漳浦野生稻中qHD19導(dǎo)入到栽培稻中，雖然獲得了相對(duì)理想的水稻新材料，但耗時(shí)近4～5年[9, 28]。因此，開發(fā)有利基因的功能標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助法篩選含有目標(biāo)基因且在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛的水稻材料作為供體親本，以待改良的材料作為受體親本，通過雜交定向改良水稻品種的目標(biāo)性狀，將解決野生稻等原始材料的優(yōu)良基因難以利用的困擾。Pigm是從谷梅4號(hào)中克隆的水稻廣譜抗稻瘟病基因[3]，但谷梅4號(hào)是地方秈稻品種，農(nóng)藝性狀一般，且與粳稻雜交親和力差、后代分離大，直接利用谷梅4號(hào)進(jìn)行改良育種較難[27]。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的三系不育系谷豐A中也含有Pigm基因。因此，谷豐A比谷梅4號(hào)更適用于水稻育種研究。利用谷豐A或其對(duì)應(yīng)的保持系谷豐B來改良相應(yīng)的不育系和保持系，將有效縮短育種進(jìn)程、提高育種效率。本研究選擇不良性狀少且生產(chǎn)利用率高的雙抗77009作為供體親本，以應(yīng)用廣泛的優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系R20為母本，在較短時(shí)間內(nèi)獲得了改良的抗病恢復(fù)系材料，大大縮短了育種時(shí)間，節(jié)約了育種成本。

4 結(jié)論

本研究以雙抗77009 為抗性基因Pigm-1的供體親本，感病恢復(fù)系R20為受體親本，通過雜交和回交，并借助于分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，定向改良優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系R20的稻瘟病抗性，得到了4個(gè)R20的抗病近改良系，這4個(gè)改良系均表現(xiàn)抗病。進(jìn)一步農(nóng)藝性狀分析表明，改良系R20-4的粒長和千粒重與R20存在極顯著差異。本研究利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)，改良了恢復(fù)系R20的稻瘟病抗性，并發(fā)現(xiàn)改良系R20-4在抗病的同時(shí)產(chǎn)量有所提高。