無種質(zhì)基因型限制結(jié)縷草組培快繁體系研究

許建民 仇學(xué)文 劉艷 梁慧敏

摘要：結(jié)縷草從愈傷組織發(fā)育成胚性愈傷再進(jìn)一步分化為完整植株一直是該領(lǐng)域的研究重點與難點。本研究通過試驗建立起一套完善的無種質(zhì)基因型限制的結(jié)縷草組培快繁體系。結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA+40 g/L蔗糖最為合適，體胚細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+40 g/L蔗糖最為合適，胚狀體增殖與生長培養(yǎng)基為MS+0.1～0.2 mg/L 2，4-D+1 mg/L NAA+01 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖最為合適，成苗快繁培養(yǎng)基為MS+0.02～0.05 mg/L NAA+1～2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖最為合適，生根培養(yǎng)基MS最為合適。

關(guān)鍵詞：種質(zhì);基因型;結(jié)縷草;組培;快繁體系

中圖分類號：S317 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）04-0036-07

收稿日期：2021-05-11

基金項目：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院重點科技創(chuàng)新類項目（編號：2017kj09）;江蘇高校“青藍(lán)工程”項目（編號：2019）。

作者簡介：許建民（1981—），男，甘肅張掖人，碩士，副教授，主要從事設(shè)施園藝環(huán)境控制研究。Tel：（0511）87290588;E-mail：jsnlxjm@vip.163.com。

通信作者：梁慧敏，博士，教授，主要從事林草生物技術(shù)育種研究。Tel：（0511）87290588;E-mail：278151187@qq.com。

結(jié)縷草屬（Zoysia）植物主要分布于亞洲東部廣大區(qū)域內(nèi)，在我國主要分布于從東北遼寧到南方廣西等地的沿海狹長地帶。由于結(jié)縷草生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣，具有典型嚴(yán)格的異花授粉特性，導(dǎo)致結(jié)縷草種間雜交及天然雜種大量存在，種內(nèi)變異很大，也使得天然野生種群個體間保持了豐富的自然變異、基因型差異及遺傳多樣性。

利用生物技術(shù)結(jié)合常規(guī)育種方法進(jìn)行結(jié)縷草新品種的選培育，是提高結(jié)縷草育種效率的有效途徑。采用生物技術(shù)進(jìn)行品種或種質(zhì)基因型改良及種質(zhì)快繁最有效的途徑就是建立高頻體細(xì)胞胚再生技術(shù)體系，因為體細(xì)胞胚是單細(xì)胞起源的，體細(xì)胞胚再生途徑不但重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的過程，實現(xiàn)了再生種子的來源，也是種質(zhì)保存、誘導(dǎo)體細(xì)胞變異或基因轉(zhuǎn)化的理想受體。體細(xì)胞胚快繁不僅能保證優(yōu)良種群個體基因遺傳一致性和穩(wěn)定性，還能保持新種質(zhì)的特異性。所以，體細(xì)胞胚再生技術(shù)是植物組培克隆中最具吸引力的研究力向。

結(jié)縷草是禾本科中較難培養(yǎng)的物種，大部分研究選擇的材料是以1～3個種或種質(zhì)基因型為主，牽涉的種質(zhì)基因型數(shù)量較少，且以多細(xì)胞的器官發(fā)生途徑為主[1-4]，從愈傷組織變成胚性愈傷組織及再生植株都較困難，組培再生率低，再生過程長。有研究提出，結(jié)縷草體細(xì)胞胚的產(chǎn)量和質(zhì)量依賴于對培養(yǎng)基組成和植物激素等條件的優(yōu)化[5]，但這方面的研究較少。因此，建立結(jié)縷草無種質(zhì)基因型限制的高頻體胚再生培養(yǎng)技術(shù)是實現(xiàn)結(jié)縷草種質(zhì)改良與高效利用的關(guān)鍵，具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018—2020年間在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心開展，以分別來源于遼寧、青島半島、江蘇及長三角周邊地區(qū)、廣東及周邊地區(qū)的野生或育成的結(jié)縷草5個種8個種群的種質(zhì)基因型為材料，包括結(jié)縷草[Zoysia japonica Steud.（Z1）]、中華結(jié)縷草[Zoysia sinica Hance（Zz）]、溝葉結(jié)縷草[Zoysia matrella （L.） Merr（Zg）]、大穗結(jié)縷草[Zoysia macrostachya Franch.et Saw.（Zd）]、細(xì)葉結(jié)縷草[Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin.（Zx）]、青島結(jié)縷草[Zoysia japonica cv. Qingdao（Zq）]、蘭引Ⅲ號結(jié)縷草[Zoysia japonica cv. Lanyin3（Z3）]、華南半細(xì)葉結(jié)縷草[Zoysia matrella cv. Huanan（Zh）]等，分別用符號Z1、Zz、Zg、Zd、Zx、Zq、Z3、Zh表示。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理及無菌苗獲取

切取生長期的8種結(jié)縷草半嫩莖帶2～4節(jié)匍匐莖段，先用洗潔精水沖洗10 min左右，再用3%次氯酸鈉溶液消毒 15 min，在無菌室用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗4次，0.1%氯化汞消毒7 min，無菌水沖洗7次，滅菌吸水紙吸干水分，剪取含2～3個節(jié)外植體接種到無菌芽苗培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌芽苗的萌動生長馴化培養(yǎng)與預(yù)篩選（培養(yǎng)基配方：1/4 MS+0.1 mg/L GA3+0.2 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖），每瓶接種5棵苗，共接種200瓶，在1 000～1 500 lx光照下 16 h/d，培養(yǎng)26～28 d。培養(yǎng)溫度為白天室溫（28±2） ℃，夜晚（20±2） ℃。

1.2.2 愈傷組織的獲取

每種結(jié)縷草選擇開始萌動生長但未污染的芽苗原基600個，接種到3種不同配方的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方如表1，每個處理每培養(yǎng)皿接種40個外植體，試驗重復(fù)5次，培養(yǎng)溫度同上，暗培養(yǎng)28～30 d后統(tǒng)計胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷的外植體數(shù)量接種外植體總數(shù)×100%。

1.2.3 體胚細(xì)胞的誘導(dǎo)

選擇愈傷分化最好的配方處理下的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用改良MS（用乙二胺四乙酸鐵鈉鹽替代硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉，微量營養(yǎng)元素配方采用SH配方的濃度，有機(jī)試劑采用B5配方的濃度）+2，4-D+NAA+6-BA+40 g/L蔗糖+0.7%瓊脂的完全組合（表2）。每個處理每瓶接種12個愈傷，重復(fù)4次，暗培養(yǎng)下發(fā)育14 d，培養(yǎng)溫度同上，觀察胚狀體發(fā)育情況。

胚狀體發(fā)生率=發(fā)育成胚狀體的愈傷數(shù)愈傷組織總數(shù)×100%。

1.2.4 胚狀體的增殖與生長

選取發(fā)育狀態(tài)良好、生長至魚雷期的胚狀體繼續(xù)進(jìn)行增殖與生長培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用MS+（0.1、0.2 mg/L）2，4-D+（0.5、1.0 mg/L）NAA+（0.05、0.10 mg/L）6-BA+30 g/L 蔗糖+0.7%瓊脂的完全組合（表3）。每瓶

接種9個胚狀體組織，重復(fù)4次，在1 000～1 500 lx光照下16 h/d，培養(yǎng)26～28 d。培養(yǎng)溫度同上。45 d 后觀察胚狀體的生長分化狀態(tài)，統(tǒng)計叢芽萌發(fā)率。

叢芽萌發(fā)率=萌發(fā)的叢芽數(shù)量接種的胚狀組織總數(shù)×100%。

1.2.5 結(jié)縷草的成苗快繁培養(yǎng)

將分化好、生長狀態(tài)優(yōu)的結(jié)縷草叢生芽接種到成苗快繁培養(yǎng)基上，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用MS+（0.02、0.05 mg/L）NAA+（1、2 mg/L）6-BA+0 g/L蔗糖+0.7%瓊脂的完全組合（表4）。每個處理下每瓶接種6個叢生芽，重復(fù)4次，在1 000～1 500 lx光照下16 h/d，培養(yǎng)26～28 d。培養(yǎng)溫度同上。30 d后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并統(tǒng)計不同處理下的叢生芽增殖系數(shù)。

叢生芽增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%。

1.2.6 叢生芽的壯苗生根培養(yǎng)

將快繁后獲得的結(jié)縷草成苗轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用1/2 MS+（0、0.05、0.10 mg/L）IBA+20 g/L蔗糖+0.7%瓊脂的完全組合（表5）。每個處理下每瓶接種10個結(jié)縷草叢生芽，重復(fù)4次，2 000～2 500 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)26～30 d，培養(yǎng)溫度同上，統(tǒng)計再生植株的生根率。

生根率=生根的叢生芽數(shù)接種數(shù)×100%。

1.2.7 再生植株的移栽

將壯苗生根培養(yǎng)后得到的生根的再生植株移栽到溫室小花盆中，盆土組分配比為蛭石 ∶泥炭土 ∶園土=2 ∶4 ∶4;移栽后遮陰處理，初期每天澆水1～2次，成活后逐漸減少澆水次數(shù)，15～20 d后統(tǒng)計成活率。

成活率=移栽后的成活數(shù)移栽總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

如圖1所示，在不同配方處理下的8種結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)率不盡相同。Z1、Zz、Zg、Zh這4種結(jié)縷草在不同配方處理后，愈傷誘導(dǎo)率均有顯著性差異，且都以配方1處理下產(chǎn)生的愈傷居多。而Zd、Zx、Zq、Z3這4種結(jié)縷草在不同的培養(yǎng)基配方處理后，愈傷誘導(dǎo)率未出現(xiàn)顯著性差異。從圖1也可以看出，除Zx與Zq是在配方2處理下的愈傷誘導(dǎo)率最高以外，其余的均是以配方1處理下的愈傷誘導(dǎo)率最高。

在對外植體進(jìn)行脫分化培養(yǎng)時，產(chǎn)生的愈傷組織顏色與質(zhì)地明顯存在差異且部分外植體出現(xiàn)了再分化的現(xiàn)象。本試驗中規(guī)定若超過2/5的外植體出現(xiàn)再分化的現(xiàn)象，則認(rèn)為該培養(yǎng)基可導(dǎo)致植物再分化。從表6中可以發(fā)現(xiàn)，配方1處理下的8種結(jié)縷草外植體形成的愈傷組織顏色均為黃色或黃白色，質(zhì)地緊實，Zz、Zg、Zh這3種結(jié)縷草則出現(xiàn)了球形胚、魚雷胚等典型的胚狀體組織，這表明，配方1在一定程度上可以直接誘導(dǎo)結(jié)縷草外植體分化成為胚性愈傷組織。在配方2、配方3處理下外植體產(chǎn)生的愈傷組織，均有部分存在松散、緊密性差的情況，而有些則再分化成了根，這表明配方2、配方3也可以誘導(dǎo)結(jié)縷草產(chǎn)生愈傷組織，但產(chǎn)生的愈傷組織多為普通的愈傷組織。

2.2 體胚細(xì)胞的誘導(dǎo)

將愈傷組織轉(zhuǎn)接到體胚細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，可獲取體細(xì)胞胚狀體。隨著時間推移，用肉眼即可觀察出胚狀體的發(fā)生情況與發(fā)育狀態(tài)。本試驗以出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體（即球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉形胚）為判定標(biāo)準(zhǔn)。從表7可以看出，總體以配方11處理下的8種結(jié)縷草愈傷組織出現(xiàn)的胚狀體數(shù)量最多，胚狀體發(fā)生率最高。Zd、Zx這2種結(jié)縷草愈傷組織在不同配方處理下，胚狀體發(fā)生率無顯著性差異;而其余品種結(jié)縷草在不同配方處理下，存在顯著性差異。配方7、配方8也能適合大多數(shù)的結(jié)縷草愈傷組織發(fā)育成為胚狀體。

2.3 胚狀體的增殖與生長

將通過體胚細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理過后產(chǎn)生的胚狀體接種到胚狀體增殖與生長培養(yǎng)基上，進(jìn)行胚狀體的增殖與芽的誘導(dǎo)。從表8可以看出，8種配方處理下的結(jié)縷草胚狀體，幾乎每種都能誘導(dǎo)產(chǎn)生叢芽。Zz、Zg、Zx、Zq、Zh這5種結(jié)縷草胚狀體對不同的培養(yǎng)基配方敏感性并不顯著，在8種配方處理下都產(chǎn)生了不定芽且無顯著性差異。Z1、Zd、Z3則表現(xiàn)出明顯的差異性，Z1以配方17處理下的胚狀體芽萌發(fā)率最高，Zd則以配方16和19處理下的萌發(fā)率最高，Z3則是配方12處理下的最高。綜合來看，配方18與配方19可以有效地誘導(dǎo)大多數(shù)結(jié)縷草胚狀體產(chǎn)生芽，配方15、配方16、配方17也可以誘導(dǎo)大多數(shù)的結(jié)縷草胚狀體產(chǎn)生芽，不過對部分種質(zhì)基因型結(jié)縷草胚狀體的效用會略低于配方18與配方19。

由胚狀體發(fā)育而來的芽可以細(xì)分為單個芽與叢生芽。從表9的數(shù)據(jù)可以看出，相對于單個芽而言，結(jié)縷草胚狀體更容易分化出叢生芽。配方14處理下的Zd與配方17處理下的Z3的芽萌發(fā)率很低，但萌發(fā)出來的芽均為叢生芽;而配方17處理下的Zx的芽萌發(fā)率為幾種配方里面最高的，但萌發(fā)出來的芽也均為叢生芽，這或許與結(jié)縷草之間不同的基因型有關(guān)。

2.4 結(jié)縷草的成苗快繁培養(yǎng)

從表10可以看出，8種結(jié)縷草在不同配方處理下的增殖數(shù)都有很大的差異，極差最大的為配方21與配方22處理下的Zq，極差達(dá)到了15.25，極差最小為配方20與配方22處理下的Zx，極差為0。Z1、Zz、Zd、Zx這4種結(jié)縷草的增殖數(shù)在4種配方處理下都超過了10，表明這4種結(jié)縷草更容易快速繁育。

對圖2進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)在不同配方處理下的每種結(jié)縷草增殖系數(shù)都存在顯著性差異。但很難找到可以最大化促進(jìn)8種結(jié)縷草快繁的配方。Z1、Zz、Zh在配方23處理下的增殖系數(shù)最高，與其他配方間存在顯著性差異;Zd、Zx、Zq、Z3在配方21處理下的增殖系數(shù)最高，與其他配方間存在顯著性差異;而Zg則在配方20處理下的增殖系數(shù)最高，與其他配方間存在顯著性差異。

2.5 壯苗生根培養(yǎng)與植株移栽

從表11可以看出，純MS培養(yǎng)基即可有效地促進(jìn)結(jié)縷草根的分化，加入IBA后部分植株根的生長受到了影響，且濃度越高，根的分化就越受到抑制。根的良好生長也很大程度上促進(jìn)移栽后成活率的提高，本試驗中根部生長良好的結(jié)縷草移栽成活率為100%。

3 討論與結(jié)論

結(jié)縷草愈傷組織的難獲取曾很長時間限制著結(jié)縷草組培快繁體系的建立。本試驗中通過添加高濃度的生長素2，4-D與低濃度的6-BA配合使用，成功獲得了8種結(jié)縷草的愈傷組織，這表明高濃度的2，4-D對結(jié)縷草愈傷的獲取起著至關(guān)重要的作用，這與前人的研究結(jié)果一致。柴明良等曾通過將萌發(fā)的結(jié)縷草種子接種到高濃度2，4-D的MS培養(yǎng)基上以獲得愈傷組織，但獲得的愈傷組織卻未能成功再分化[6]。Bhaskaren等的研究表明，2，4-D在大多數(shù)禾本科植物的愈傷誘導(dǎo)中都扮演著重要的角色[7]。張磊等將2，4-D、NAA、IAA、6-BA這4種激素單獨(dú)使用，發(fā)現(xiàn)以2，4-D處理的愈傷誘導(dǎo)率最高[8]，本試驗結(jié)果與之也基本一致。但張磊等試驗獲得的愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)64.6%[8]，本試驗中愈傷誘導(dǎo)率最高也僅有51%，或許與這2個試驗的愈傷誘導(dǎo)配方不一樣有關(guān)。

一般外植體脫分化后獲得的愈傷可分為胚性愈傷與普通愈傷，胚性愈傷可進(jìn)一步分化成完整植株，而體胚細(xì)胞的誘導(dǎo)主要經(jīng)歷愈傷組織誘導(dǎo)階段和分化培養(yǎng)階段[9]。普通愈傷組織經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后一部分分化出胚性細(xì)胞，單個胚性細(xì)胞再分裂和分化形成一個由多細(xì)胞組成的原胚，即胚性愈傷組織[10]。賈玉芳等研究表明，MS+2.0 mg/L 2，4-D的組合效果最好，胚性愈傷組織比率為8583%[11]，本試驗中，最適合胚性愈傷誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為改良MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D，胚性愈傷組織的比率最高可達(dá)到88%，這與前人研究結(jié)果基本一致。Linacero等[12]和錢永強(qiáng)等[13]都證明了過高或過低的2，4-D濃度都不利于胚性愈傷組織的形成和分化作用。本試驗中部分結(jié)縷草在含4 mg/L 2，4-D配方處理下的體胚細(xì)胞誘導(dǎo)率極低，這表明高濃度的2，4-D會抑制體胚細(xì)胞的形成，但也有部分結(jié)縷草在含2 mg/L 2，4-D配方處理下的體胚誘導(dǎo)率較低，這表明低濃度的2，4-D也會抑制體胚細(xì)胞的形成，這與前人研究成果基本一致。但本試驗中幾種結(jié)縷草在高濃度或低濃度的2，4-D處理下的結(jié)縷草均有較高的體胚細(xì)胞誘導(dǎo)率，這或許與結(jié)縷草間的基因型不同或有其他激素參與進(jìn)來共同作用有關(guān)，具體的機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

有學(xué)者研究表明，在分化階段，暗培養(yǎng)條件后，愈傷組織通過分化成胚性愈傷組織，經(jīng)體細(xì)胞發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株的數(shù)量大大高于光培養(yǎng)條件下愈傷組織的分化[14-18]。本試驗采取的即此途徑，胚狀體芽的分化率最高可達(dá)到94%，這與前人的研究成果基本一致。杜敏華等研究表明，0.5 mg/L NAA最適于結(jié)縷草芽的分化[19]，本試驗中，配方12、13、16、17的NAA含量均為0.5 mg/L，且大多數(shù)能促進(jìn)芽的分化，具有顯著性差異，這與前人的研究成果基本保持一致，至于部分結(jié)縷草的體胚細(xì)胞未能促進(jìn)芽萌發(fā)，可能與其基因型有關(guān)。叢生芽的生命力與繁殖力明顯高于單個芽[20]，本試驗的配方誘導(dǎo)出來的不定芽多數(shù)為叢生芽，為結(jié)縷草的成苗快繁建立了良好的基礎(chǔ)。

王棟的研究表明，培養(yǎng)基MS+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L 6-BA最有利于試管苗芽的增殖，芽數(shù)平均可增殖至9個以上[21]，本試驗未能找出最適合各種結(jié)縷草快繁最佳培養(yǎng)基配方，但本試驗中使用到的配方處理后新增平均芽數(shù)均能超過9，較前人試驗結(jié)果較高，這可能與本試驗中激素濃度較高有關(guān)。宋俊芳等的研究結(jié)果表明，添加1 mg/L的IBA就能明顯促進(jìn)根的分化[22]，本試驗的結(jié)果與之不符，可能與種苗狀態(tài)有關(guān)，也有可能與結(jié)縷草間基因型有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探討。

本試驗旨在尋找出一種無種質(zhì)基因型限制的結(jié)縷草組培快繁體系。通過試驗得出，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA+40 g/L 蔗糖最為合適，體胚細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+40 g/L蔗糖最為合適，胚狀體增殖與生長培養(yǎng)基為MS+0.1～0.2 mg/L 2，4-D+1 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖最為合適，成苗快繁培養(yǎng)基為MS+0.02～0.05 mg/L NAA+1～2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖最為合適。

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