超聲輔助提取紫蘇葉花色苷及其抗氧化活性研究

王月，趙彥巧，李建穎（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

紫蘇（Perilla frutescent（L.）Britt），是一種具有特殊香氣的藥食同源植物[1]，又名蘇子[2]，其紫蘇葉、紫蘇子、紫蘇梗均被《中國(guó)藥典》所收錄[3]。紫蘇葉含有許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如酚類、氨基酸、花色苷、維生素和礦物質(zhì)[4]，其莖、葉、根和種子等均可直接或加工后食用。研究表明，紫蘇具有良好的抗氧化性[5]、抗菌性[6]、抗過(guò)敏性[7]、止嘔[8]等多種生物學(xué)功能。花色苷作為一種天然色素，廣泛存在于葉片、花、果實(shí)等器官中并賦予其紅、橙、紫等不同顏色。目前已知的花色苷有二十多種，大量的研究結(jié)果表明，花色苷類化合物有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，具有良好的抗氧化[9]、抗癌[10]、抗腫瘤、抗炎殺菌、降血糖[11]等活性。目前，食品安全問(wèn)題備受關(guān)注，花色苷作為一種安全性高、色澤鮮艷的天然可食用色素，廣泛應(yīng)用于食品、藥品以及化妝品等行業(yè)。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紫蘇葉花色苷提取及抗氧化活性的研究已有報(bào)道。Meng等[12]測(cè)定了從廣州、遼寧等地采集到的不同品種花色苷的含量為6 mg/g干重～7 mg/g干重。崔麗霞[13]采用超聲波輔助提取法提取紫蘇葉中的花色苷和多酚類化合物，提取量分別為6.44mg CGE/g和63.11mgGAE/g。此外 Gül?in 等[14]對(duì)紫蘇葉花色苷的活性研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇葉花色苷對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等有很強(qiáng)的清除能力。超聲輔助作為提取天然物質(zhì)的輔助手段，比傳統(tǒng)方法更節(jié)約時(shí)間，對(duì)遇熱不穩(wěn)定的成分有保護(hù)作用，有利于節(jié)約能源[15-16]。本研究以紫蘇葉為原料，以酸化乙醇為溶劑采用超聲輔助提取紫蘇葉花色苷，分析多個(gè)因素對(duì)紫蘇葉花色苷提取量的影響，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳提取工藝，并對(duì)紫蘇葉花色苷的體外抗氧化活性進(jìn)行分析，為紫蘇葉花色苷的理論研究及其工業(yè)化運(yùn)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉：河北祁州中藥材種植園。

無(wú)水乙醇、濃鹽酸、無(wú)水乙酸鈉、氯化鉀（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度＞97.0%）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；Trolox（純度＞97.0%）：源葉生物科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS]（純度＞98.0%）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；過(guò)氧化氫（30%）：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平（AX224ZH）、pH 計(jì)（ST3100）：奧豪斯儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-1A-50）：科儀創(chuàng)智（北京）科技發(fā)展有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2600）：島津儀器有限公司；多功能粉碎機(jī)（YB-2500A）：永康市速鋒工貿(mào)有限公司；高速冷凍離心機(jī)（CL5R）：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10DIGITAL）：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇葉前處理

取新鮮干紫蘇葉放入烘箱40℃烘6 h。取出干燥后的紫蘇葉，用多功能粉碎機(jī)打碎后過(guò)60目篩，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 紫蘇花色苷提取工藝

紫蘇葉前處理→超聲輔助提取→離心取上清液→pH示差法測(cè)定上清液吸光度→計(jì)算提取量。

1.3.3 紫蘇葉花色苷提取量的測(cè)定

pH示差法[17]測(cè)定花色苷含量。

式中：ΔA=（A520nm(pH1.0)-A700nm(pH1.0)）-（A520nm(pH4.5)-A700nm(pH4.5)）；V為體積，mL；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside）的分子量，449.2g/mol；ε 為摩爾消光系數(shù)26 900 L/（mol·cm）；l為比色皿厚度，cm；W為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱量1 g的紫蘇葉粉，加入不同濃度不同體積的酸化乙醇（pH2）進(jìn)行超聲提取。以紫蘇葉花色苷的提取量為衡量指標(biāo)，分別考察4個(gè)因素對(duì)花色苷提取量的影響：提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（25%、30%、35%、40%、45%）和液料比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）]。每個(gè)處理做 3 個(gè)平行。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法（BBD模型）篩選出花色苷提取的最佳提取工藝條件，因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels for response surface design

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考石雪萍等[18]的方法并稍作改動(dòng)。取1 mL 0.1 mmol/L DPPH+1.5 mL無(wú)水乙醇+0.5mL不同濃度花色苷溶液于比色皿中混合均勻，置于25℃避光的環(huán)境中 30 min，測(cè) A（517nm），計(jì)算公式如下。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量無(wú)水乙醇代替DPPH溶液的樣品的吸光度；A0為用等量無(wú)水乙醇代替花色苷溶液即空白對(duì)照溶液的吸光度。樣品的對(duì)照組為與其濃度相同的Trolox，每份處理做3個(gè)平行。

1.3.7 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

參考宋思圓等[19]的方法并稍作改動(dòng)。配制ABTS母液：將245 μL（100 mmol/L）過(guò)硫酸鉀溶液置于10 mL容量瓶中，加入9.5 mL的7 mmol/L ABTS溶液，用超純水補(bǔ)齊至刻度，混合均勻，用錫紙包裹容量瓶在黑暗中靜置16 h。向pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中滴加 ABTS 母液，測(cè)得 A（734nm）=0.7±0.02，即得ABTS工作液。取3mLABTS工作液和0.03mL不同濃度花色苷溶液于比色皿中，混合均勻在黑暗環(huán)境中反應(yīng) 6 min，測(cè) A（734nm），計(jì)算公式如下。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量無(wú)水乙醇代替ABTS工作液的樣品的吸光度；A1為用等量無(wú)水乙醇代替花色苷溶液即空白對(duì)照溶液的吸光度。樣品的對(duì)照組為與其濃度相同的Trolox，每份處理做3個(gè)平行。

1.3.8 羥基自由基清除能力的測(cè)定

參考張玲等[20]的方法并稍作改動(dòng)。分別配制4.5 mmol/L水楊酸、4 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2備用。反應(yīng)體系為1 mL FeSO4+1 mL水楊酸+1 mL H2O2+1 mL不同濃度花色苷溶液，將溶液添加至比色皿中，混合均勻置于黑暗環(huán)境中 30 min，測(cè) A（510nm），計(jì)算公式如下。

羥基自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量蒸餾水代替H2O2溶液的樣品的吸光度；A0為用等量蒸餾水代替花色苷溶液即空白對(duì)照溶液的吸光度。樣品的對(duì)照組為與其相同濃度的Trolox，每份處理做3個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果表示成平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；用Origin 2019b作圖；用SPSS 25進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；響應(yīng)面試驗(yàn)用Design Expert 10.0分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)花色苷提取量的影響

提取溫度對(duì)花色苷提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取溫度對(duì)花色苷提取量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanin

由圖1可知，在30℃～50℃內(nèi)隨著提取溫度的升高，紫蘇葉花色苷的提取量從626.54 mg/100 g增加到725.62 mg/100 g；再繼續(xù)升溫至70℃，花色苷的提取量又下降至655.71 mg/100 g，表明溫度對(duì)花色苷的溶解有一定的影響。升溫能加快分子運(yùn)動(dòng)[21]，提高溶液擴(kuò)散速度，有助于提高乙醇對(duì)花色苷的溶解度；但花色苷耐熱性較差，提取溫度過(guò)高，花色苷結(jié)構(gòu)受到破壞,降低花色苷得率。因此提取溫度選擇45、50、55℃進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響

超聲時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on the yield of anthocyanin

由圖2可知，10 min～40 min隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，紫蘇葉花色苷的提取量從511.65 mg/100 g增加到714.04 mg/100 g，并在40 min時(shí)達(dá)到最大。表明一定范圍內(nèi)延長(zhǎng)超聲時(shí)間對(duì)紫蘇葉中花色苷成分的溶出有一定的促進(jìn)作用。但是時(shí)間延長(zhǎng)到40min～50min，提取量不升反降，這可能是由于超聲波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)花色苷結(jié)構(gòu)遭到破壞，花色苷被氧化降解使提取量呈下降趨勢(shì)。因此超聲時(shí)間選擇35、40、45 min進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量的影響Fig.3 Effects of ethanol volume fraction on the yield of anthocyanin

由圖3可知，在25%～40%范圍內(nèi)，紫蘇葉花色苷的提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大呈逐步上升的趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%時(shí)花色苷提取量達(dá)到最大，為712.93 mg/100 g。這種情況可能是因?yàn)樗趾窟^(guò)多，乙醇含量過(guò)少，水溶性雜質(zhì)在此體系中的溶解性較好，使花色苷溶出比例降低。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶劑對(duì)細(xì)胞的滲透作用也會(huì)增大，有利于將花色苷從細(xì)胞中溶解釋放出來(lái)，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大，提取液極性過(guò)低，花色苷溶出度和得率就會(huì)大幅下降[22]，導(dǎo)致花色苷含量不升反降。所以選擇35%、40%、45%的乙醇溶液進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.4 液料比對(duì)花色苷提取量的影響

液料比對(duì)花色苷提取量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 液料比對(duì)花色苷提取量的影響Fig.4 Effects of liquid to material ratio on the yield of anthocyanin

由圖4可知，溶劑用量從5 mL增加到15 mL，紫蘇葉花色苷提取量增加了一倍，表明一定范圍內(nèi)溶劑用量增加有利于原料中花色苷的傳質(zhì)與擴(kuò)散，提高花色苷溶出率，提升提取率。當(dāng)液料比為15∶1（mL/g）時(shí)，提取量為 696.68 mg/100 g，液料比繼續(xù)增加到 25∶1（mL/g）時(shí)，提取量增幅不大?？紤]到增加液料比會(huì)增加溶劑消耗，使提取液的體積太大，不利于后續(xù)濃縮步驟的進(jìn)行。因此在優(yōu)化試驗(yàn)中選擇 10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

依據(jù)2.1的試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面軟件Design Expert 10.0設(shè)計(jì)四因素三水平的試驗(yàn)，考察提取溫度（A）、超聲時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）和液料比（D）對(duì)結(jié)果的影響。試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface test

2.2.2 模型方程的建立與顯著性試驗(yàn)

采用Design-Expert 10.0軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合回歸分析，得出花色苷提取量為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程Y=716.04-1.63A+1.80B-2.48C+4.53D+2.75AB-0.05AC-0.65AD-1.2BC-10.65BD-9.5CD-9.65A2-7.87B2-14.27C2-15.44D2?；貧w模型方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

由表3可知，模型F=148.27，表明該模型具有很高的精準(zhǔn)度。模型P＜0.000 1，表明該模型達(dá)到高度顯著水平。在此情況下，一次項(xiàng)C、D是影響模型的重要參數(shù)，A、B是影響模型的參數(shù)；二次項(xiàng)BD、CD對(duì)模型影響很大，AB對(duì)模型有一定的影響，AC、AD、BC對(duì)模型的影響不顯著。各因素對(duì)花色苷提取量影響順序?yàn)镈＞C＞B＞A。失擬項(xiàng)P＞0.05不顯著，說(shuō)明該響應(yīng)面模型存在的誤差較小，因此二次模型較合理。綜上表明，該模型設(shè)計(jì)的參數(shù)可以進(jìn)行花色苷提取。

2.2.3 因素間交互作用的響應(yīng)面分析結(jié)果

各因素交互作用對(duì)花色苷提取量影響的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

等高線和3D響應(yīng)曲面圖能比較直觀地反映4個(gè)因素對(duì)花色苷提取量的影響。等高線的形狀可以反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反；從3D曲面圖來(lái)看，曲面越陡峭表明試驗(yàn)因素對(duì)花色苷提取量影響越大，交互作用越顯著。由圖 5（b）、（c）、（d）可知 3D 響應(yīng)曲面圖坡度平緩，等高線接近圓形，表明溫度和乙醇濃度、溫度和液料比、時(shí)間和乙醇濃度間的交互作用不顯著。圖5（a）、（e）、（f）等高線接近橢圓，3D 響應(yīng)曲面圖陡峭，表明溫度和時(shí)間、時(shí)間和液料比、乙醇濃度和液料比間交互作用顯著。

圖5 各因素交互作用對(duì)花色苷提取量的影響Fig.5 The influence of the interaction of various factors on the extraction amount of anthocyanins

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)Design-Expert 10.0軟件分析得到了紫蘇葉花色苷最佳提取工藝為提取溫度49.52℃，超聲時(shí)間37.42min，乙醇體積分?jǐn)?shù) 39.23%，液料比 16.03∶1（mL/g），紫蘇葉花色苷提取量的理論值為716.75 mg/100 g。考慮實(shí)際操作修訂為提取溫度50℃，超聲時(shí)間37 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，液料比16∶1（mL/g）。此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，得到提取量為715.56 mg/100 g，與理論值716.75 mg/100 g相近，表明該模型有較好的預(yù)測(cè)作用，合理可行。

2.3 紫蘇葉花色苷對(duì)DPPH自由基清除能力的分析

紫蘇葉花色苷對(duì)DPPH自由基的清除能力見(jiàn)圖6。

圖6 紫蘇葉花色苷對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of Perilla leaves anthocyanins

DPPH自由基具有單一電子，可以與抗氧化劑提供的電子或氫原子結(jié)合，發(fā)生反應(yīng)使醇溶液從原來(lái)的紫色逐漸變淺，且與清除劑濃度呈一定的量效關(guān)系[23]。由圖6可知，隨著質(zhì)量濃度從0.04 mg/mL增加到0.09 mg/mL，紫蘇葉花色苷清除DPPH自由基的能力從33.42%上升到84.42%，且上升趨勢(shì)大于Trolox。兩者在0.09 mg/mL時(shí)清除率均達(dá)到最大，分別為84.42%和97.22%，表明紫蘇葉花色苷能較好地清除DPPH自由基。

2.4 紫蘇葉花色苷對(duì)ABTS+自由基清除能力的分析

紫蘇葉花色苷對(duì)ABTS+自由基的清除能力見(jiàn)圖7。

圖7 紫蘇葉花色苷對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.7 ABTS+radical scavenging activity of Perilla leaves anthocyanins

從圖7可知，隨著質(zhì)量濃度增加，Trolox和紫蘇葉花色苷的清除率均上升，對(duì)照組的上升趨勢(shì)大于試驗(yàn)組，且同一濃度下Trolox的清除率大于紫蘇葉花色苷。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時(shí)紫蘇葉花色苷和Trolox對(duì)ABTS+自由基的清除效率均達(dá)到最大，分別為47.85%和99.74%，表明紫蘇葉花色苷有一定的ABTS+自由基清除能力，可作為抗氧化成分可與ABTS+反應(yīng)，使原本藍(lán)綠色的反應(yīng)體系褪色，終止自由基的連鎖反應(yīng)，從而清除或抑制ABTS+自由基生成。

2.5 紫蘇葉花色苷對(duì)羥基自由基清除能力的分析

紫蘇葉花色苷對(duì)羥基自由基的清除能力見(jiàn)圖8。

羥基自由基對(duì)人體危害較大，當(dāng)羥基自由基產(chǎn)生與清除不平衡時(shí)，會(huì)影響機(jī)體正常生理功能[24]。由圖8可知，紫蘇葉花色苷和Trolox對(duì)羥基自由基的清除率與質(zhì)量濃度成正比，但紫蘇葉花色苷的清除能力低于Trolox。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.1 mg/mL時(shí)紫蘇葉花色苷和Trolox對(duì)羥基自由基的清除效率均達(dá)到最大，分別為51.27%和96.68%。表明紫蘇葉花色苷有一定的羥基自由基清除能力，紫蘇葉花色苷作為供氫體與氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基結(jié)合，從而保護(hù)機(jī)體免受羥基自由基的損壞。

圖8 紫蘇葉花色苷對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of Perilla leaves anthocyanins

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取紫蘇葉花色苷，用酸化乙醇作為提取溶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)確定了最佳提取工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)花色苷提取量的影響順序?yàn)榱弦罕龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞提取溫度。最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù) 40%、液料比 16∶1（mL/g）、超聲時(shí)間 37 min、提取溫度50℃，此時(shí)紫蘇葉花色苷提取率最高，達(dá)到了715.56 mg/100 g。體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，紫蘇葉花色苷對(duì)3種自由基都具有良好的清除能力，且其抗氧化能力與紫蘇葉花色苷濃度總體呈正比，紫蘇葉花色苷對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基的清除率分別達(dá)到84.42%，47.85%和51.27%。

綜上所述，超聲輔助提取對(duì)紫蘇葉花色苷的優(yōu)化工藝可行，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，試驗(yàn)結(jié)果為紫蘇葉花色苷在食用藥用方面的開(kāi)發(fā)提供了一定技術(shù)支持和理論數(shù)據(jù)參考。