蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉的抗氧化性及其對經(jīng)絡(luò)體表電位差的影響

郭靜科， 俞曉衛(wèi)， 劉樹滔， 饒平凡， 巫升斌， 趙率君，喬家輝， 陳瑞琛， 駱梅香

(1.福州大學(xué) 至誠學(xué)院， 福建 福州 350002；2.杭州明德生物新技術(shù)開發(fā)有限公司，浙江 杭州 310018；3.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350002；4.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 浙江 杭州 310035；5.廈門元尊生物工程有限公司， 福建 廈門 361026)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.ex Fr.)Link]作為新資源食品，可用作保健食品的原料[1]。蛹蟲草又名北蟲草、北冬蟲夏草，天然蛹蟲草是蛹蟲草菌侵染昆蟲蛹或蟲形成的實體，與冬蟲夏草同屬異種，是屬于子囊菌類的麥角菌目(Claviciptales)、麥角菌科(Claviciptaceae)、蟲草屬(Cordyceps)真菌[2]。蛹蟲草包含多種生物活性物質(zhì)，如蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等，這些物質(zhì)都具有較好的抗氧化性[3]。研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草粉能極顯著提高紫外輻射果蠅的SOD活性并極顯著降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，能夠修復(fù)紫外輻射對果蠅造成的損傷，對機體起到抗氧化保護作用[4]。近年來，蛹蟲草產(chǎn)品種類不斷增加，銷量和普及程度也不斷增加[5]。因此，研究蛹蟲草的抗氧化性具有現(xiàn)實意義，但前人研究多集中在損傷保護作用上，結(jié)合傳統(tǒng)藥食同源歸經(jīng)屬性的研究較少，經(jīng)絡(luò)體表電位實時監(jiān)測方法可幫助研究蛹蟲草的歸經(jīng)屬性。

經(jīng)絡(luò)體表電位實時監(jiān)測方法可對抗氧化干預(yù)等刺激發(fā)生迅速響應(yīng)，反映氧化應(yīng)激的傳導(dǎo)以及與經(jīng)絡(luò)相連器官的工作狀態(tài)，體表電位值降低說明氧化應(yīng)激水平減少[6]。研究團隊前期采用監(jiān)測經(jīng)絡(luò)體表電位的方法，比較口服樺褐孔菌粉、金駿眉、武夷水仙茶、高山綠茶、正山小種、茶多酚、茶多糖、鐵皮石斛粉等物質(zhì)對人體不同經(jīng)絡(luò)的作用[7]，也觀察了蛹蟲草整株粉的抗氧化性、熱穩(wěn)定性和歸經(jīng)作用[8]。在此基礎(chǔ)上，除了蛹蟲草整株，增加了子實體和菌絲體作為新研究對象，觀察的經(jīng)絡(luò)從肺、脾、腎、肝經(jīng)[8]拓展到12條經(jīng)絡(luò)。同時，本研究也進行了蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉的DPPH自由基清除能力和氧自由基清除能力(ORAC)測定分析，多角度對比分析這3種蟲草粉的抗氧化性和對人體經(jīng)絡(luò)體表電位的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草菌FY1421(菌種保藏編號：M2016220)整株粉、子實體粉和菌絲體粉，廈門元尊生物工程有限公司，蛹蟲草整株粉(6 000)經(jīng)培養(yǎng)、烘干、超微粉碎、滅菌、壓片、包裝制成，有效成分蟲草素質(zhì)量比為6 000 μg/g；蛹蟲草子實體粉(2 200)經(jīng)浸提、分離、濃縮、干燥、粉碎、過濾、滅菌、包裝制成，有效成分蟲草素質(zhì)量比為2 200 μg/g；蛹蟲草菌絲體粉(3 300)經(jīng)培養(yǎng)、烘干、粉碎、滅菌、包裝制成，有效成分蟲草素質(zhì)量比為3 300 μg/g。DPPH、AAPH，美國Sigma- Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli- Q型超純水儀，美國Millipore公司；510型臺式pH計，美國Eutech公司；CF15RXⅡ型高速離心機，日本Hitachi公司；NH- 4型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，江蘇國華電器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV- 1700型紫外分光光度計，日本津島公司；DFT- 250型手提式高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；FlexStation3型鈣流檢測工作站，美國Molecular Devices公司；Ag/AgCl一次性心電電極，上海鈞康醫(yī)用設(shè)備有限公司；RM6240C型多通道生理信號采集處理系統(tǒng)，成都儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品制備

準(zhǔn)確稱取樣品粉末，分別用pH值 7.2的磷酸緩沖液以料液比(g/mL)1∶30進行溶解，37 ℃、800 r/min水浴恒溫攪拌器浸提1 h后，將混合液超聲20 min，于4 ℃冰箱靜置過夜24 h。離心機25 ℃、5 000 r/min，離心15 min，取上清液，作為待測樣品。

1.3.2志愿者選擇

納入標(biāo)準(zhǔn)：1)年齡18～40歲，性別不限；2)簽署知情同意書，自愿參加實驗；3)遵從研究方案，實驗期間能夠較好地配合實驗進行。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)有腎、肝、心血管疾病或者其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾??；2)有長期的藥物治療歷史；3)有酗酒、抽煙、濫用毒品等不良嗜好。

1.3.3抗氧化活性檢測

以水溶性的維生素E衍生物Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制作DPPH自由基清除能力和ORAC的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算Trolox當(dāng)量抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)，μmol/g。

準(zhǔn)確稱取一定量的DPPH粉末溶解于無水乙醇中，配制成濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，保存于4 ℃冰箱備用。用移液槍吸取2 mL的待測樣品加于潔凈試管內(nèi)，然后再吸取2 mL DPPH溶液加入待測樣品中，漩渦振蕩混勻，于常溫下避光靜置30 min，以無水乙醇調(diào)零，測定樣品在517 nm波長處的吸光度[9]，得出DPPH自由基清除能力值。

于96孔板微孔中加入熒光素鈉鹽(0.086 nmol/L，150 μL)和25 μL的待測樣品，在37 ℃條件下孵育10 min，迅速加入AAPH(153 mmol/L，25 μL)后，每2 min測量樣品在485 nm激發(fā)條件下，530 nm波長處熒光發(fā)射強度的變化。以Trolox(終濃度3.125～200.000 μmol/L)替代不同樣品溶液，同板同時操作，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定時間為120 min，各樣品不同時間的熒光強度分別記為F0、F1、F2…F120。F0為0 min時的熒光值，F(xiàn)n為nmin時的熒光值。按照式(1)計算樣品熒光變化零階矩曲線下面積(area under curve，AUC)。

AUC=2×(F0+F1+…+Fn-1+Fn)-F0-Fn。

(1)

然后根據(jù)待測樣品的濃度換算出1 g蛹蟲草樣品相當(dāng)于Trolox物質(zhì)的量，即ORAC值[10]。

1.3.4人體經(jīng)絡(luò)體表電位測定

1.3.4.1 志愿者分組

2019年9月—2020年3月在福州大學(xué)生物工程研究所征集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的志愿者40名。按隨機數(shù)字表法分為4組，空白組(飲用100 mL蒸餾水)10名，男性6名，女性4名，年齡23～42歲，平均(30±3)歲；蛹蟲草整株粉組10名，男性6名，女性4名，年齡23～41歲，平均(29±3)歲；子實體粉組10名，男性6名，女性4名，年齡20～36歲，平均(26±2)歲；菌絲體粉組10名，男性4名，女性6名，年齡24～36歲，平均(28±4)歲。3組實驗組志愿者均飲用加入了10 g相應(yīng)粉末的100 mL蒸餾水。此研究經(jīng)福州大學(xué)生物工程研究所倫理委員會批準(zhǔn)(No. 31500685- 4)。

1.3.4.2 經(jīng)絡(luò)體表電位測定

將志愿者安置于安靜、空氣流通的恒溫環(huán)境中，保持臥躺和呼吸平穩(wěn)。選擇人體左側(cè)各條經(jīng)絡(luò)的合穴和原穴(表1)作為經(jīng)絡(luò)體表電位的測量點，分別以合穴為正極，原穴為負(fù)極。穴位的選擇和確定參照GB/T 12346—2021《經(jīng)穴名稱與定位》[11]，將測量穴位點附近毛發(fā)修剪，用醫(yī)用酒精進行擦拭，等其揮發(fā)后，標(biāo)示好測量穴位點的位置。使用Ag/AgCl一次性心電電極粘貼于穴位處，連接電極和USB數(shù)據(jù)采集卡，開始采集人體穴位的電位信號。由于電極敷貼皮膚初期會進行電荷交換，引起電位波動，故預(yù)先平衡15～25 min，待受試者的穴位電位穩(wěn)定后，受試者開始飲用預(yù)先沖泡好的100 mL的產(chǎn)品，并在5 min內(nèi)飲用完畢，同時進行全程穴位間電位的跟蹤(跟蹤時長120 min)。為了更方便地比較不同組的穴位電位在服用后的變化幅度和趨勢，將第30 min的穴位電位矯正為0，從而進行比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

表1 經(jīng)絡(luò)體表電位測量穴位Tab.1 Acupoints of body surface electrical potential difference measurement along acupuncture meridians

2 結(jié)果與討論

2.1 蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉的抗氧化活性測定結(jié)果

蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉的DPPH和氧自由基清除能力見圖1。由圖1(a)可知，蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉的DPPH自由基清除能力(以Trolox質(zhì)量計)分別達(dá)到(25.97±1.39)、(14.34±1.68)、(19.56±0.80)μmol/g。由圖1(b)可知，蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉的ORAC值(以Trolox質(zhì)量計)分別達(dá)到(16.85±1.13)、(6.21±0.76)、(10.39±0.88)μmol/g。

蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉的DPPH自由基清除能力差異顯著，蛹蟲草整株粉最高，菌絲體粉次之，子實體粉最低[圖1(a)]，這可能是因為具有清除DPPH自由基能力的蟲草素含量不同[12]。蛹蟲草整株粉ORAC值最高，菌絲體粉次之，子實體粉最低[圖1(b)]。蟲草素具有良好的清除氧自由基的能力，這與前人的研究報道類似[13]。此外可以看出，不同蛹蟲草粉的DPPH自由基清除能力和氧自由基清除能力強弱趨勢較為相似。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)；n=3。圖1 蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉的DPPH和氧自由基清除能力比較Fig.1 Comparison on DPPH and oxygen radical scavenging capacities of powders of Cordyceps militaris fungus, sporophore and mycelium

2.2 對經(jīng)絡(luò)體表電位的影響

圖2顯示經(jīng)絡(luò)體表電位相對于空白(U=0)的變化的平均趨勢，組間無差異顯著(P>0.05)；n=10。圖2 12條經(jīng)絡(luò)的體表電位變化Fig.2 Changes of body surface electrical potential difference of 12 acupuncture meridians

蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉對經(jīng)絡(luò)體表電位的影響見圖2。本研究過程中，所有志愿者均順利完成臨床實驗，無脫落志愿者。蛹蟲草整株粉可以降低肺經(jīng)、胃經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)、心包經(jīng)、膽經(jīng)和肝經(jīng)的體表電位[圖2(a)～圖2(g)]，提高小腸經(jīng)的體表電位[圖2(h)]；蛹蟲草子實體粉可以降低脾經(jīng)[圖2(c)]和腎經(jīng)[圖2(d)]的體表電位，提高小腸經(jīng)[圖2(h)]的體表電位；蛹蟲草菌絲體粉可以降低腎經(jīng)[圖2(d)]和大腸經(jīng)[圖2(i)]的體表電位，提高胃經(jīng)[圖2(b)]、心包經(jīng)[圖2(e)]和膽經(jīng)[圖2(f)]的體表電位。其余的心經(jīng)、膀胱經(jīng)和三焦經(jīng)的體表電位無明顯變化[圖2(j)～圖2(l)]。

蛹蟲草子實體粉和整株粉都可以降低脾經(jīng)[圖2(c)]和腎經(jīng)[圖2(d)]的體表電位，提高小腸經(jīng)[圖2(h)]的體表電位。有研究表明：蛹蟲草子實體水提取物有顯著增強脾淋巴細(xì)胞增殖的效應(yīng)[14]和促進腎小球系膜細(xì)胞增殖作用[15]；復(fù)方蛹蟲草可以改善高脂誘導(dǎo)的小鼠小腸炎癥，也可以提高小腸上皮細(xì)胞的存活率[16]；蛹蟲草速溶粉飲料對于抗生素干擾引起的腸道菌群失調(diào)具有較好的修復(fù)作用，可調(diào)節(jié)并保持腸道微生態(tài)菌群的平衡[17]。但蛹蟲草子實體粉和整株粉在對經(jīng)絡(luò)體表電位的作用上，對小腸經(jīng)的作用效果和對腎經(jīng)的不同，小腸經(jīng)的體表電位逐漸升高，而腎經(jīng)逐漸降低。最近的文獻報道，蛹蟲草能夠極顯著地升高黏膜中抗炎細(xì)胞因子IL- 10的濃度[18]，IL- 10能夠通過促進線粒體自噬來清除受損的線粒體，而較低的膜電勢和高水平的活性氧是受損線粒體的特征[19]，這可能導(dǎo)致了小腸經(jīng)體表電位的提高，但仍需要更多的研究來挖掘其內(nèi)在機制。蛹蟲草菌絲體粉也能降低腎經(jīng)[圖2(d)]的體表電位。

蛹蟲草整株粉還可以降低肺經(jīng)[圖2(a)]、胃經(jīng)[圖2(b)]、心包經(jīng)[圖2(e)]、膽經(jīng)[圖2(f)]和肝經(jīng)[圖2(g)]的體表電位。蛹蟲草提取物能夠減輕PM2.5暴露對肺組織產(chǎn)生的炎性損傷和氧化損傷[20]。蛹蟲草小分子肽增強胃癌細(xì)胞株SGC- 7901對氟尿嘧啶化療的敏感性[21]。蟲草素能夠激活A(yù)MPKα通路，減少氧化應(yīng)激避免心臟肥大[22]，并且能夠誘導(dǎo)膽囊癌癥細(xì)胞的凋亡[23]。蛹蟲草凍干粉能有效降低脂肪肝模型組小鼠血液中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平，其保肝作用可能與降低肝臟中的氧化損傷有關(guān)[24]。此外，添加蛹蟲草多糖的益生型酸奶可顯著提高酒精性肝損傷小鼠肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH- Px)、SOD活力，同時使肝臟MDA水平顯著下降，對小鼠酒精性肝損傷的保護作用明顯強于未添加蛹蟲草多糖的酸奶[25]。

蛹蟲草菌絲體粉的作用與整株粉和子實體粉不同。蛹蟲草菌絲體粉降低大腸經(jīng)[圖2(i)]的體表電位，提高胃經(jīng)[圖2(b)]、心包經(jīng)[圖2(e)]和膽經(jīng)[圖2(f)]的體表電位。經(jīng)絡(luò)和活性氧有著密切的相關(guān)性，活性氧在活體動物的分布走向與經(jīng)絡(luò)吻合[26]。經(jīng)絡(luò)體表電位下降被認(rèn)為是相對應(yīng)的經(jīng)絡(luò)氧化應(yīng)激減少，經(jīng)絡(luò)體表電位和所受到的抗氧化干預(yù)有著一定的相關(guān)性[6]。本研究所得結(jié)果是服用不同樣品后90 min內(nèi)的經(jīng)絡(luò)體表電位比較，蛹蟲草菌絲體粉的效果與整株粉和子實體粉不同的機理需要進一步進行長期的實驗研究。

蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉對經(jīng)絡(luò)體表電位的作用見表2。通過表2數(shù)據(jù)推測，蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉都能作用于腎，這與蛹蟲草補腎陽，主治腎虛的用法吻合[8]。除此之外，蛹蟲草子實體粉和整株粉都可以作用于脾和小腸；而蛹蟲草菌絲體粉對胃、心包、膽和大腸的作用與整株粉和子實體粉不同。

表2 蛹蟲草整株粉、子實體粉和菌絲體粉對經(jīng)絡(luò) 體表電位的作用Tab.2 Effects of powders of Cordyceps militaris fungus,sporophore and mycelium on body surface electric potential difference along acupuncture meridians

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，抗氧化能力從高到低依次為蛹蟲草整株粉、菌絲體粉和子實體粉。通過測量經(jīng)絡(luò)體表電位能一定程度反映不同蛹蟲草粉對人體的作用，測量經(jīng)絡(luò)穴位體表電位是一種新的安全、無創(chuàng)傷手段，研究旨在為探索客觀評價不同物質(zhì)對人體功效的無創(chuàng)傷方法提供一定參考。