黃酒中降生物胺糖多孢菌的篩選及評(píng)價(jià)

孫夢(mèng)菲， 劉雙平， 應(yīng)維茂， 韓 笑， 毛 健,*

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院/糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無(wú)錫 214122；2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司 國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心， 浙江 紹興 312000；3.江南大學(xué)(紹興)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院， 浙江 紹興 312000)

生物胺是一種低分子質(zhì)量的含氮有機(jī)堿，主要由微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶作用于氨基酸脫羧而生成[1]，生物胺普遍存在于發(fā)酵食品中，適量生物胺有助于人體的正常生理活動(dòng)，過(guò)量生物胺的攝入則會(huì)引起動(dòng)脈血管和微血管的擴(kuò)張，導(dǎo)致腹瀉、頭痛、腹部痙攣、嘔吐等不良生理反應(yīng)，甚至?xí)?dǎo)致死亡[2-3]，德國(guó)、比利時(shí)、法國(guó)、瑞士設(shè)定葡萄酒中組胺的最高限值分別為2、5、8、10 mg/L[4]，斯洛伐克設(shè)定啤酒中組胺的最高限值為20 mg/kg[5]。

黃酒作為我國(guó)具有民族特色的傳統(tǒng)酒精飲料，富含多種氨基酸和功效成分，深受消費(fèi)者的青睞。黃酒開(kāi)放式的釀造環(huán)境使得黃酒中的生物胺含量要比其他釀造酒(啤酒和葡萄酒等)高很多，黃酒中的生物胺平均含量高達(dá)115 mg/L[6-7]，研究表明：組胺、酪胺、苯乙胺等生物胺能顯著抑制乙醇的代謝速率，加速黃酒飲后醉酒速度，進(jìn)而影響黃酒的飲用舒適度[8]。目前控制食品發(fā)酵過(guò)程中生物胺含量的方法有很多，主要包括優(yōu)化生產(chǎn)工藝和儲(chǔ)藏條件[9]、減少發(fā)酵體系中產(chǎn)生物胺的微生物或控制產(chǎn)胺微生物產(chǎn)胺[10]等，這些方法存在一定的局限性，均不能降解已經(jīng)產(chǎn)生的生物胺。研究發(fā)現(xiàn)，存在一些微生物可通過(guò)分泌生物胺氧化酶降解已存在的生物胺，因此，利用生物強(qiáng)化技術(shù)將具有生物胺降解功能的菌株控制食品中的生物胺含量的方法越來(lái)越受到關(guān)注，但大多數(shù)研究中的生物胺降解菌種屬于乳酸菌、葡萄球菌等[11-13]，關(guān)于其他種類微生物降解生物胺的能力及應(yīng)用的研究較少。黃酒釀造過(guò)程中微生物種類豐富，是良好的微生物菌種資源庫(kù)，有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

大量研究表明放線菌門中的微生物作用是許多生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源，放線菌的代謝產(chǎn)物如氨基酸、各種酶制劑、有機(jī)酸等在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、科學(xué)、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的作用[14]。同時(shí)，全基因組功能注釋結(jié)果表明放線菌門的披發(fā)糖多孢菌中存在生物胺氧化酶，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)從放線菌門的紅球菌中分離純化得到的生物胺氧化酶對(duì)腐胺具有較強(qiáng)的降解能力[15]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)放線菌是黃酒釀造過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物之一，其中放線菌門的糖多孢菌屬參與了黃酒發(fā)酵過(guò)程中的葡萄糖利用、氮利用、氨基酸合成、脂肪酸合成和甘油三酯水解等大量物質(zhì)代謝過(guò)程，對(duì)黃酒發(fā)酵具有重要影響[16]。因此，從黃酒釀造過(guò)程中篩選具有降解生物胺功能的糖多孢菌，在控制黃酒的生物胺含量方面具有一定的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒麥曲、發(fā)酵醪樣品來(lái)自浙江某黃酒廠。

菌株F1902～F1910為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，菌株F2001～F2037為本研究篩選獲得的菌株。

細(xì)菌生化微量鑒定管，青島海博生物有限公司；色胺、β-苯乙胺、尸胺、腐胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸鹽、L-色氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、5′-磷酸吡哆醛、丹磺酰氯、乙腈、乙醇、丙酮(分析純)，均來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

放線菌液體培養(yǎng)基：硝酸鉀1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，氯化鈉0.5 g/L，可溶性淀粉20.0 g/L，pH值7.2～7.4(25 ℃)，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加瓊脂15.0 g/L。

放線菌氨基酸培養(yǎng)基：放線菌液體培養(yǎng)基中添加L-酪氨酸0.4 g/L，L-組氨酸1 g/L，L-賴氨酸1 g/L，L-鳥(niǎo)氨酸1 g/L，色氨酸1 g/L，精氨酸1 g/L，L-苯丙氨酸1 g/L，5′-磷酸吡哆醛0.05 g/L。

放線菌生物胺培養(yǎng)基：放線菌液體培養(yǎng)基中添加生物胺(包括組胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、色胺、β-苯乙胺各50 mg/L)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，美國(guó)Agilent公司；Legend Micro 17R型冷凍高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；小型離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；PCR儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；Universal HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1黃酒中糖多孢菌的分離與純化

1.3.1.1 樣品預(yù)處理

麥曲樣品：稱取5 g麥曲于50 mL離心管中，添加30 mL蒸餾水后放入搖床培養(yǎng)箱中于30 ℃培養(yǎng)30 min。

發(fā)酵醪樣品：稱取30 mL發(fā)酵醪于50 mL離心管中，放入搖床培養(yǎng)箱中于30 ℃培養(yǎng)30 min。

1.3.1.2 分離純化

取懸浮液梯度稀釋至10-1至10-6的稀釋勻液。分別吸取麥曲、發(fā)酵醪各稀釋度菌液100 μL涂布于放線菌固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 ～ 7 d。在菌落密度適中的平板上挑取薄的、有凸面隆起的單菌落，分別劃線接種到放線菌固體平板上。

1.3.2糖多孢菌產(chǎn)生物胺能力評(píng)價(jià)

將糖多孢菌在放線菌液體培養(yǎng)基中于37 ℃ 150 r/min條件下培養(yǎng)48 h后接種至放線菌氨基酸培養(yǎng)基中(菌液添加量為培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)的5%)，于37 ℃ 150 r/min條件下培養(yǎng)5 d后測(cè)定其生物胺產(chǎn)量，未添加菌株的培養(yǎng)基為對(duì)照組。

1.3.3糖多孢菌降生物胺能力評(píng)價(jià)

將糖多孢菌在放線菌液體培養(yǎng)基中于37 ℃ 150 r/min條件下培養(yǎng)48 h后接種至放線菌生物胺培養(yǎng)基中(菌液添加量為培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)的5%)，于37 ℃ 150 r/min條件下培養(yǎng)5 d后測(cè)定其生物胺含量，并與未添加菌株的培養(yǎng)基(對(duì)照組)相比計(jì)算篩選菌株的生物胺降解率。

1.3.4生物胺測(cè)定方法

生物胺含量使用高效液相色譜，丹磺酰氯柱前衍生法進(jìn)行測(cè)定[17]。生物胺降解率按式(1)計(jì)算。

(1)

式(1)中，X為生物胺降解率，%；ρ1為未接種菌株樣品的生物胺質(zhì)量濃度，mg·L-1；ρ2為接種菌株樣品的生物胺質(zhì)量濃度，mg·L-1。

1.3.5菌株鑒定

1.3.5.1 分子生物學(xué)鑒定

提取菌株DNA，利用細(xì)菌通用引物：上引物為27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，下引物為1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，對(duì)菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下引物各1 μL，模板1 μL，加無(wú)菌水22 μL補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將所得序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用BLAST進(jìn)行序列同源性分析，比較供試菌株與已知糖多孢菌相應(yīng)序列的相似性。

1.3.5.2 生理生化鑒定

用接種針從平板上挑取已純化分離的糖多孢菌單菌落接種于細(xì)菌微量生化鑒定管中，在檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的條件下培養(yǎng)，結(jié)果對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[18]進(jìn)行綜合評(píng)定。

1.3.6糖多孢菌降生物胺能力的影響因素研究

考察溫度、pH值和乙醇濃度對(duì)糖多孢菌降解生物胺能力的影響。將糖多孢菌在放線菌培養(yǎng)基中37 ℃活化48 h，將其接種在不同條件下的降生物胺菌株篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后測(cè)定菌株生物胺降解率。其中溫度梯度設(shè)為25、30、35、40、45 ℃；pH值梯度設(shè)為4、5、6、7、8、9；乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度設(shè)為0%、1%、3%、5%、7%、10%。

1.3.7糖多孢菌生物量的測(cè)定

稱取15 mL空離心管質(zhì)量(記為m1)，準(zhǔn)確量取10 mL震蕩均勻的菌液于15 mL離心管中，8 000 r/min離心15 min，棄上清，用去離子水洗滌沉淀2～3次，于80 ℃烘干至恒重，稱重(記為m2)[19]，生物量按公式(2)計(jì)算：

(2)

式(2)中，ρ為生物量，g·L-1；m1為空管質(zhì)量，g；m2為菌液干質(zhì)量與空管質(zhì)量之和，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒中糖多孢菌的分離鑒定結(jié)果

糖多孢菌屬是黃酒麥曲、黃酒發(fā)酵醪中的優(yōu)勢(shì)菌屬之一，且對(duì)黃酒發(fā)酵有重要影響。本研究通過(guò)分離、純化，共篩選獲得63株顏色、大小、突起、邊緣等表觀特征不同的純培養(yǎng)物，通過(guò)制片、顯微鏡觀察，這些菌株均符合放線菌的培養(yǎng)特征。對(duì)63株菌株進(jìn)行16s RNA測(cè)序，結(jié)果表明：37株屬于糖多孢菌，其中霍氏糖多孢菌(Saccharopolysporahordei)17株，玫瑰糖多孢菌(Saccharopolysporarosea)13株，江西糖多孢菌(Saccharopolysporajiangxiensis)2株，披發(fā)糖多孢菌(Saccharopolysporahirsuta)1株，紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)4株，命名為F2001～F2037。其他的26株菌株分別為絮狀鏈霉菌9株、可可鏈霉菌亞種8株、弗拉迪鏈霉菌2株、白色鏈霉菌7株。

2.2 糖多孢菌產(chǎn)生物胺能力評(píng)價(jià)結(jié)果

某些微生物可在特定條件下產(chǎn)生氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸而產(chǎn)成生物胺，因此，本研究分別將分離獲得的37株糖多孢菌和實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)中的9株糖多孢菌接種至含有氨基酸的放線菌培養(yǎng)基中，研究其產(chǎn)生物胺能力，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株F1904產(chǎn)生物胺能力最強(qiáng)，生物胺總產(chǎn)生量為20.13 mg/L。除菌株F2001、F2011、F2012、F2026、F1904外，其余菌株產(chǎn)生物胺能力極弱，生物胺產(chǎn)生量均低于5 mg/L，且?guī)缀醪划a(chǎn)生腐胺、酪胺。為篩選低產(chǎn)生物胺且可降解生物胺的糖多孢菌，選擇41株低產(chǎn)生物胺的糖多孢菌菌株進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.2 可降解生物胺糖多孢菌的篩選結(jié)果

分別將篩選獲得的41株低產(chǎn)生物胺的糖多孢菌接種到添加生物胺的放線菌培養(yǎng)基中測(cè)定其生物胺降解率，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，菌株F1902、F1909、F2002、F2004、F2014、F2017具有較強(qiáng)的生物胺降解能力，總生物胺降解率均大于50%，最高為76.41%±0.82%。佟婷婷[20]從泡菜中篩選出一株植物乳桿菌M6，此菌株總生物胺的降解率為67.33%；趙佳迪等[21]從醬油發(fā)酵醪中篩選出的菌株M-2，對(duì)組胺的降解率為52.88%，而本研究篩選出的菌株F1902、F2014總生物胺降解率均大于74%，對(duì)8種生物胺都具有較強(qiáng)的生物胺降解能力。菌株F1902和F2014的生物胺產(chǎn)生能力較弱，且它們的生物胺降解能力最強(qiáng)，因此選擇此2株菌進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

圖1 不同菌株產(chǎn)生物胺能力的比較Fig.1 Biogenic amines producing ability of different strains

表1 放線菌生物胺培養(yǎng)基中不同糖多孢菌菌株的生物胺降解能力的比較Tab.1 Comparison of biogenic amines degrading ability of different Saccharopolyspora strains in actinomycetes bioamines medium %

續(xù)表1 %

2.3 糖多孢菌F1902和F2014的菌株鑒定結(jié)果

圖2 2株生物胺降解能力較強(qiáng)的糖多孢菌的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of two Saccharopolyspora strains with strong biogenic amine degrading ability

對(duì)選定的2株糖多孢菌進(jìn)行觀察，菌株F1902和F2014的單菌落特征見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株F1902菌落形態(tài)為圓形，基內(nèi)菌絲為無(wú)色，為凝膠狀，在放線菌培養(yǎng)基上不產(chǎn)色素，菌落凸起、難挑起；菌株F2014菌落形態(tài)為圓形，基內(nèi)菌絲為棕黃色，氣生菌絲為黃色，在放線菌培養(yǎng)基上可產(chǎn)生粉紅色的可擴(kuò)散色素，菌落凸起、難挑起。

將所得的2株糖多孢菌序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用BLAST進(jìn)行序列同源性分析，菌株F1902和F2014的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株F1902與披發(fā)糖多孢菌親緣關(guān)系最近，菌株F2014與玫瑰糖多孢菌親緣關(guān)系最近。2株菌的生理生化特征結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，菌株F1902可降解腺嘌呤、酪蛋白、七葉苷、彈性蛋白、淀粉、酪氨酸、尿素等物質(zhì)，在25～50 ℃下可生長(zhǎng)，與Saccharopolysporahirsuta特征一致；菌株F2014可降解腺嘌呤、酪蛋白、七葉苷、淀粉、酪氨酸、尿素等物質(zhì)，在25～40 ℃下可生長(zhǎng)，與Saccharopolysporarosea特征一致。

2.4 影響糖多孢菌降解生物胺能力的因素

環(huán)境對(duì)菌株的降解能力具有重要影響[22]，為探究溫度、pH值和乙醇濃度對(duì)糖多孢菌生物胺降解能力的影響，本研究將S.hirsutaF1902和S.roseaF2014添加至不同條件下的放線菌生物胺培養(yǎng)基中，探究菌株在不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)情況及其生物胺降解能力，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 菌株F1902和F2014基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of F1902 and F2014

發(fā)酵溫度會(huì)影響菌株生長(zhǎng)和生物胺氧化酶活力，由圖4(a)可知，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，S.hirsutaF1902和S.roseaF2014的生長(zhǎng)最好，總生物胺降解率也達(dá)到最高，分別為73.19%±1.83%和72.27%±1.81%。當(dāng)溫度超過(guò)35 ℃時(shí)，生物胺降解率隨溫度升高而降低，可能時(shí)由于當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，酶分子的空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，胺氧化酶的活力有所下降導(dǎo)致的[23]。由圖4(b)可知，不同pH值對(duì)2株菌的生長(zhǎng)具有一定的影響，隨著pH值的增加，菌株生長(zhǎng)量以及總生物胺降解率均呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH=7時(shí)，2株菌的生長(zhǎng)最好，總生物胺降解率也達(dá)到最高，分別為73.78%±2.01%和72.89%±1.98%。由圖4(c)可知，隨著乙醇濃度的增加，糖多孢菌的生長(zhǎng)量與總生物胺降解率隨之降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，S.hirsutaF1902和S.roseaF2014的總生物胺降解率均低于30%，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為7%時(shí)，S.hirsutaF1902和S.roseaF2014的總生物胺降解率均低于20%，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于7%時(shí)，2株糖多孢菌均不再生長(zhǎng)。高濃度的乙醇會(huì)抑制糖多孢菌的生長(zhǎng)，同時(shí)，乙醇會(huì)可抑制生物胺氧化酶活力[24]。

表2 菌株F1902和F2014的部分生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Partial physiological and biochemical identification results of F1902 and F2014

圖4 環(huán)境條件對(duì)S.hirsuta F1902和S.rosea F2014降解生物胺的影響Fig.4 Effects of environmental conditions on degradation of biogenic amines by S.hirsuta F1902 and S.rosea F2014

3 結(jié) 論

利用具有降生物胺能力的微生物控制發(fā)酵食品的生物胺含量的研究越來(lái)越受到關(guān)注，盡管關(guān)于具有降解生物胺能力微生物的研究已有大量報(bào)道，但相關(guān)研究的降生物胺菌株主要屬于乳酸菌、葡萄球菌等物種，關(guān)于其他微生物的降解生物胺能力的研究較少。為獲得可降低黃酒中生物胺含量的菌株，本研究對(duì)黃酒發(fā)酵過(guò)程中的糖多孢菌進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)其生物胺降解能力進(jìn)行了探究。本研究從黃酒麥曲和發(fā)酵醪中共分離鑒定得37株糖多孢菌，以菌株產(chǎn)生物胺和降生物胺能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選獲得2株低產(chǎn)生物胺且具有較強(qiáng)降生物胺能力的糖多孢菌(F1902和F2014)。經(jīng)對(duì)菌株的分子生物學(xué)、生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，2株菌分別為披發(fā)糖多孢菌(Saccharopolysporahirsuta)和玫瑰糖多孢菌(Saccharopolysporarosea)。將分離得到的2株糖多孢菌在含有生物胺的培養(yǎng)基中于37 ℃發(fā)酵5 d，發(fā)現(xiàn)，兩株糖多孢菌對(duì)總生物胺降解率分別高達(dá)76.41%±0.82%和74.62%±0.84%。進(jìn)一步對(duì)2株菌在不同環(huán)境條件下的降生物胺能力進(jìn)行研究，結(jié)果表明，溫度、pH值和乙醇濃度均會(huì)影響糖多孢菌的生長(zhǎng)及降生物胺能力。其中，S.hirsutaF1902和S.roseaF2014降解生物胺的較適溫度為30 ℃，較適pH值為7，在添加體積分?jǐn)?shù)7%乙醇的環(huán)境下仍能發(fā)揮一定的生物胺降解能力。

黃酒發(fā)酵過(guò)程包括前酵和后酵兩個(gè)階段，而生物胺的產(chǎn)生主要集中于前酵階段，且黃酒發(fā)酵過(guò)程中的生物胺很大一部分來(lái)自浸米過(guò)程[25]。因此，利用生物強(qiáng)化技術(shù)將具有降解生物胺能力的糖多孢菌添加于黃酒發(fā)酵過(guò)程，降解發(fā)酵體系中已有的生物胺，或許是有效控制發(fā)酵過(guò)程中生物胺的含量的一種方式。本研究首次報(bào)道了黃酒釀造過(guò)程中糖多孢菌對(duì)生物胺的降解作用。

后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步將其應(yīng)用于黃酒發(fā)酵過(guò)程中。盡管本研究?jī)H初步探究了黃酒發(fā)酵過(guò)程中糖多孢菌的降生物胺能力，但由于其對(duì)生物胺良好的降解能力，其在控制黃酒發(fā)酵過(guò)程中生物胺含量的應(yīng)用的潛力不容忽視。