兩種質(zhì)量規(guī)范在睪酮、皮質(zhì)醇檢測性能驗(yàn)證中的應(yīng)用比較

廖紅娟，張 援，宋愛晶，孫 娟，官凌菊

（廣東省體育科學(xué)研究所，廣東 廣州 510663）

血睪酮（T）是機(jī)體內(nèi)活性最高的一種雄激素，主要功能為促進(jìn)機(jī)體的合成代謝。 一般認(rèn)為，運(yùn)動員適應(yīng)訓(xùn)練負(fù)荷或身體機(jī)能良好時(shí)，睪酮水平變化不大，且有體能增強(qiáng)伴有睪酮增加的趨勢；而在疲勞、過度訓(xùn)練或機(jī)能狀態(tài)不佳時(shí)，睪酮水平則會明顯下降， 所以血清睪酮可作為運(yùn)動員選材和評定運(yùn)動員機(jī)能狀態(tài)的重要指標(biāo)。 皮質(zhì)醇（COR）是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一種甾體類糖皮質(zhì)激素， 是促進(jìn)機(jī)體進(jìn)行分解代謝的重要激素， 尤其是對運(yùn)動過程中涉及糖代謝的過程有重要的調(diào)節(jié)作用：在運(yùn)動過程中升高可促進(jìn)糖原分解供能，提高運(yùn)動能力；在運(yùn)動后持續(xù)保持高水平則會造成機(jī)體分解代謝過強(qiáng)， 不利于身體恢復(fù)， 因此皮質(zhì)醇常用于評定運(yùn)動員腎上腺皮質(zhì)的機(jī)能和機(jī)體恢復(fù)狀況［1］。

運(yùn)動后睪酮和皮質(zhì)醇的變化都較為復(fù)雜， 并且存在很大的個(gè)體差異（生物學(xué)變異），再加上測試過程中實(shí)驗(yàn)室所用的檢測方法、人員操作等因素也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大影響，從而影響睪酮和皮質(zhì)醇在監(jiān)控運(yùn)動員訓(xùn)練效果和身體機(jī)能狀態(tài)中的精準(zhǔn)應(yīng)用。 在上述諸多影響因素中，檢測方法的分析性能對檢測結(jié)果正確性起關(guān)鍵作用， 實(shí)驗(yàn)室須選擇分析性能優(yōu)良的檢測方法才能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。 那么怎樣對檢測方法的分析性能進(jìn)行客觀的評價(jià)呢？ 目前臨床實(shí)驗(yàn)室一般是選擇美國臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正法案’88 （CLIA’88）能力驗(yàn)證分析質(zhì)量要求作為檢測方法分析性能驗(yàn)證時(shí)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［2-5］。 而由生物學(xué)變異推導(dǎo)出的質(zhì)量規(guī)范是建立在大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床工作經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上［6］，該質(zhì)量規(guī)范雖被越來越多的實(shí)驗(yàn)室所接受， 并廣泛應(yīng)用于室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價(jià)中，但其在檢測方法分析性能驗(yàn)證中的應(yīng)用報(bào)道較少見。綜上所述，本研究的目的是分析上述兩種質(zhì)量規(guī)范在睪酮、皮質(zhì)醇主要分析性能驗(yàn)證中的應(yīng)用， 以期找到適合運(yùn)動生化實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量管理要求的質(zhì)量規(guī)范，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而做到精準(zhǔn)地服務(wù)于體育科研。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器為西門子公司ADVIA Centaur XP 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。 試劑為西門子公司提供的T 試劑盒（批號180037）及校準(zhǔn)品（批號 C7137）、COR 試劑盒（批號 019331）及校準(zhǔn)品（批號 CE59）。

1.2 試驗(yàn)樣本

精密度驗(yàn)證試驗(yàn)選用伯樂公司生產(chǎn)的免疫測定質(zhì)控品，2個(gè)不同濃度水平（低值40 381，高值40 383），為減少瓶間差異，取2 套質(zhì)控品按廠家說明書進(jìn)行復(fù)溶，充分混勻后分裝保存于-20℃。 正確度驗(yàn)證試驗(yàn)選用國家衛(wèi)生健康委臨檢中心2021 年 第 1 次 內(nèi) 分 泌 室 間 質(zhì) 評 的 5 個(gè) 樣 本 （202111 ～202115）。

1.3 方法

1.3.1 儀器準(zhǔn)備

檢測人員能熟練操作儀器， 根據(jù)廠家說明書規(guī)定的方法進(jìn)行項(xiàng)目校準(zhǔn)，校準(zhǔn)后進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，質(zhì)控結(jié)果在控才能進(jìn)行試驗(yàn)樣本的檢測。

1.3.2 精密度驗(yàn)證

依據(jù) WS/T 492-2016［7］、CLSI EP15-A3［8］文件要求，對兩個(gè)濃度水平的質(zhì)控品連續(xù)測定5 天，每天一個(gè)分析批，每個(gè)濃度水平分別取 3 支分裝樣本檢測， 如此， 每個(gè)濃度水平得到15 個(gè)數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)濃度水平的批內(nèi)變異系數(shù)（CV批內(nèi)）和總變異系數(shù)（CV總）。 進(jìn)行計(jì)算之前，先依據(jù) WS/T 420-2013《臨床實(shí)驗(yàn)室對商品定量試劑盒分析性能的驗(yàn)證》［9］建議進(jìn)行離群值判斷：計(jì)算所有測定值的總均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），單次測定值如超出，則判斷為離群值。離群值數(shù)量不超過總測試數(shù)據(jù)量的5%，故本實(shí)驗(yàn)至多允許剔除一個(gè)測試數(shù)值，如超過一個(gè)，該項(xiàng)目需重新檢測。

1.3.3 正確度驗(yàn)證

依據(jù) WS/T 492-2016［7］、CLSI EP15-A3［8］文件要求，對國家衛(wèi)健委臨檢中心2021 年第1 次內(nèi)分泌室間質(zhì)評的5 個(gè)不同濃度水平樣本連續(xù)測定5 天，每天每個(gè)樣本重復(fù)測定兩次，每個(gè)樣本可得10 個(gè)數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)樣本的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、95%置信區(qū)間、與同組靶值比較的百分偏差。

1.3.4 質(zhì)量規(guī)范

CLIA’88 質(zhì)量規(guī)范規(guī)定睪酮、皮質(zhì)醇的允許總誤差（TEa）均為 25%［6］。 生物學(xué)變異包括個(gè)體內(nèi)（CVI）和個(gè)體間（CVG）生物學(xué)變異，由生物學(xué)變異推導(dǎo)出的質(zhì)量規(guī)范有“最低”“適當(dāng)”“最佳”3 個(gè)層次， 最低的質(zhì)量規(guī)范：CVA（分析不精密度）＜0.75CVI，BA（分析偏倚）＜0.375（CVI2+ CVG2）1/2；適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量規(guī)范：CVA＜0.50CVI，BA＜0.250 （CVI2+ CVG2）1/2； 最佳的質(zhì)量規(guī)范：CVA＜0.25CVI，BA＜0.125（CVI2+ CVG2）1/2［6］。 睪酮、皮質(zhì)醇的 CVI和CVG來源于Ricos 等［10］建立的生物學(xué)變異數(shù)據(jù)庫，由這些數(shù)據(jù)計(jì)算出的質(zhì)量規(guī)范的具體數(shù)據(jù)見表1。本研究中精密度驗(yàn)證試驗(yàn)以 1/4CLIA’88TEa （批內(nèi)不精密度）、1/3CLIA’88TEa（實(shí)驗(yàn)室總不精密度）、 生物學(xué)變異導(dǎo)出的允許CV 作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，正確度驗(yàn)證試驗(yàn)以1/2CLIA’88TEa、生物學(xué)變異導(dǎo)出的允許Bias 作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 由生物學(xué)變異數(shù)據(jù)導(dǎo)出的質(zhì)量規(guī)范

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

按照 WS/T492-2016、EP15-A3 文 件 要 求 ， 使 用 Excel2010、SPSS23.0 進(jìn)行精密度、正確度驗(yàn)證的相關(guān)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 離群值檢驗(yàn)

通過將每個(gè)濃度水平15 個(gè)檢測結(jié)果的最小值、最大值與各自水平的上下限比較，未發(fā)現(xiàn)離群值，見表2。

表2 T、COR 精密度驗(yàn)證離群值結(jié)果

2.2 精密度驗(yàn)證結(jié)果

睪酮、皮質(zhì)醇的不精密度均滿足CLIA’88 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以基于生物學(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)， 睪酮的不精密度小于生物學(xué)變異導(dǎo)出的適當(dāng)允許不精密度； 皮質(zhì)醇的不精密度小于生物學(xué)變異導(dǎo)出的最佳允許不精密度，見表3。睪酮、皮質(zhì)醇的兩水平驗(yàn)證樣本通過精密度驗(yàn)證。

表3 T、COR 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3 正確度驗(yàn)證結(jié)果

從表4 可以看出，睪酮、皮質(zhì)醇的5 個(gè)不同濃度樣本的測定均值與靶值的百分偏差均小于1/2CLIA’88 TEa 要求。 睪酮低濃度樣本的百分偏差最大，為-9.43%，大于生物學(xué)變異導(dǎo)出的適當(dāng)允許偏倚，且其靶值也超出95%置信區(qū)間上限，未通過驗(yàn)證；其它濃度樣本的正確度良好，通過驗(yàn)證。 皮質(zhì)醇的不同濃度樣本的百分偏差均小于生物學(xué)變異導(dǎo)出的最佳允許偏倚，同時(shí)靶值均包含在95%置信區(qū)間內(nèi)，正確度良好，驗(yàn)證通過。

表4 T、COR 正確度驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

精密度和正確度是臨床檢驗(yàn)定量測定項(xiàng)目分析性能特征的主要指標(biāo)。 未做修改的經(jīng)確認(rèn)的檢測程序在常規(guī)使用之前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對其主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證； 或檢測程序在投入使用后，由于儀器設(shè)備的老化和磨損等原因都會影響檢測結(jié)果，所以實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)定期至少對檢測項(xiàng)目的精密度和正確度進(jìn)行驗(yàn)證， 以確保其性能參數(shù)持續(xù)符合實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量目標(biāo)和使用要求［11］。

一個(gè)實(shí)驗(yàn)室選擇什么樣的質(zhì)量規(guī)范作為檢測程序性能驗(yàn)證的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)， 在一定程度上可表明實(shí)驗(yàn)室檢測水平能達(dá)到何種程度。 CLIA’88 質(zhì)量規(guī)范是基于法規(guī)和室間質(zhì)評而制定的法規(guī)文件，在質(zhì)量規(guī)范層級模式中處于第四級。 臨床實(shí)驗(yàn)室通常把CLIA’88 可接受限作為允許總誤差（TEa），然后根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將允許總誤差轉(zhuǎn)換為允許偏倚（一般為≤1/2TEa）和允許不精密度 （一般為批內(nèi)不精密度≤1/4TEa， 總不精密度≤1/3TEa），作為實(shí)驗(yàn)室正確度和不精密度的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［12-13］。 該質(zhì)量規(guī)范不僅缺乏客觀合理的依據(jù)， 而且在當(dāng)前技術(shù)水平條件下其評價(jià)限過于寬松，不利于實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量的提高。 基于生物學(xué)變異的質(zhì)量規(guī)范是通過調(diào)控項(xiàng)目的分析變異與生物學(xué)變異的比值所得， 綜合考慮了健康人群生物學(xué)變異和臨床工作需求，是較為客觀合理的質(zhì)量規(guī)范，處于質(zhì)量規(guī)范層級模式的第二級，其性能優(yōu)于 CLIA’88 質(zhì)量規(guī)范［6，14］。 該質(zhì)量規(guī)范根據(jù)健康人群檢測項(xiàng)目的個(gè)體內(nèi)、個(gè)體間生物學(xué)變異數(shù)據(jù)，通過一定的研究模型導(dǎo)出不精密度（CV%）、偏倚（Bias%）和總誤差（TEa%）3 個(gè)分析質(zhì)量指標(biāo)的質(zhì)量規(guī)范。 如果一個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目的檢測質(zhì)量能達(dá)到基于生物學(xué)變異的質(zhì)量要求， 則可認(rèn)為分析變異在檢測過程中造成的結(jié)果改變是可以被接受的。

精密度是指在規(guī)定條件下， 對同一或類似被測量對象重復(fù)測量所得示值或測得值間的一致程度， 反映測量結(jié)果隨機(jī)誤差的大小［7］，常用不精密度表示。 較低的不精密度不僅可減少個(gè)體試驗(yàn)結(jié)果的固有變異性， 而且還有利于減少室內(nèi)質(zhì)量控制的成本。那么不精密度要低到什么程度才算是好的呢？相關(guān)學(xué)者通過計(jì)算得出分析不精密度小于1/2 個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異（CVA＜0.50CVI）是合理的且是應(yīng)用最為廣泛的精密度質(zhì)量規(guī)范（適當(dāng)?shù)木芏荣|(zhì)量規(guī)范），此時(shí)約有12%的分析變異增加到試驗(yàn)結(jié)果的變異性中。 不同檢驗(yàn)項(xiàng)目生物學(xué)變異是不同的，目前它們能達(dá)到的分析質(zhì)量水平也不盡相同的，當(dāng)檢驗(yàn)項(xiàng)目很容易達(dá)到適當(dāng)?shù)木芏荣|(zhì)量規(guī)范時(shí)， 則選擇更為嚴(yán)格的精密度質(zhì)量規(guī)范（最佳的精密度質(zhì)量規(guī)范）作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，分析不精密度小于 1/4 個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異（CVA＜0.25CVI），這時(shí)僅有3%的分析變異增加到試驗(yàn)結(jié)果的變異性中；反之，則選擇不太嚴(yán)格的精密度質(zhì)量規(guī)范（最低的精密度質(zhì)量規(guī)范）作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)， 分析不精密度小于3/4 個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異 （CVA＜0.75CVI），此時(shí)則至多有25%的分析變異增加到試驗(yàn)結(jié)果的變異性中［6］。本研究中精密度驗(yàn)證結(jié)果顯示，睪酮、皮質(zhì)醇兩水平驗(yàn)證樣本的不精密度雖然能輕松滿足CLIA’88 的CV 值要求，但無法對睪酮、皮質(zhì)醇檢測過程中的分析變異進(jìn)行定量。當(dāng)選擇生物學(xué)變異推導(dǎo)出的精密度質(zhì)量規(guī)范作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，皮質(zhì)醇的不精密度能滿足最佳的允許CV 要求，說明隨機(jī)誤差較小，在皮質(zhì)醇檢測過程中至多有3%的分析變異可能會被帶入到檢測結(jié)果的變異中； 睪酮的不精密度能滿足適當(dāng)?shù)脑试SCV 要求， 說明睪酮檢測過程中約有12%的分析變異可能會被帶入到檢測結(jié)果的變異中。

測量正確度是指無窮多次重復(fù)測量所得量值的平均值與一個(gè)參考值間的一致程度， 反映測量結(jié)果系統(tǒng)誤差的大小［7］，常用偏倚表示。 基于生物學(xué)變異的偏倚質(zhì)量規(guī)范也有適當(dāng)、最佳、最低3 個(gè)層次，反映了實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的正確性，以及與其他實(shí)驗(yàn)室之間的可比性。 本研究中正確度驗(yàn)證試驗(yàn)使用了5 個(gè)不同濃度樣本，基本覆蓋了整個(gè)測量區(qū)間，能有效減少隨機(jī)誤差對驗(yàn)證結(jié)果的影響。 正確度驗(yàn)證結(jié)果顯示，當(dāng)選擇1/2CLIA’88 TEa 作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，睪酮、皮質(zhì)醇的正確度驗(yàn)證可輕松通過。 當(dāng)選擇生物學(xué)變異推導(dǎo)出的偏倚質(zhì)量規(guī)范作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)， 皮質(zhì)醇的偏差均能滿足最佳的允許Bias 要求，通過驗(yàn)證，說明皮質(zhì)醇檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠；睪酮的偏差整體上能滿足適當(dāng)?shù)脑试SBias 要求，但低值樣本的偏差較大，且其靶值超出了95%置信區(qū)間上限，未通過驗(yàn)證，說明睪酮低濃度樣本檢測結(jié)果受系統(tǒng)誤差的影響比較大， 所以日常工作中對睪酮低濃度樣本的檢測結(jié)果應(yīng)給予足夠重視， 必要時(shí)制定相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行復(fù)檢。

由生物學(xué)變異導(dǎo)出的質(zhì)量規(guī)范與檢測項(xiàng)目個(gè)體內(nèi)及個(gè)體間的穩(wěn)態(tài)調(diào)定點(diǎn)密切相關(guān)，所得允許不精密度、允許偏倚、允許總誤差更加合理和嚴(yán)格， 將它作為檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能驗(yàn)證的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)更科學(xué)合理。 目前，國內(nèi)外尚缺乏關(guān)于專業(yè)運(yùn)動員人群生化指標(biāo)的生物學(xué)變異數(shù)據(jù)， 故本研究中睪酮和皮質(zhì)醇生物學(xué)變異數(shù)據(jù)來源于國外學(xué)者提供的全球健康人群的研究數(shù)據(jù)［10］。 在將來的工作中，實(shí)驗(yàn)室可以對運(yùn)動員人群血液生化指標(biāo)的生物學(xué)變異進(jìn)行研究， 再將其應(yīng)用于運(yùn)動生化實(shí)驗(yàn)室的檢測質(zhì)量控制中， 更好地保證運(yùn)動員血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

在當(dāng)前技術(shù)水平條件下，本實(shí)驗(yàn)室開展的睪酮、皮質(zhì)醇項(xiàng)目的精密度和正確度能輕松滿足CLIA’88 質(zhì)量規(guī)范， 但該質(zhì)量規(guī)范的評價(jià)限過于寬松，不利于實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量的提高。 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，推薦選擇基于生物學(xué)變異的“適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量規(guī)范”和“最佳的質(zhì)量規(guī)范”作為本實(shí)驗(yàn)室乃至其他運(yùn)動生化實(shí)驗(yàn)室中睪酮、皮質(zhì)醇分析性能驗(yàn)證的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，既能保證實(shí)驗(yàn)室高水平的檢測質(zhì)量， 又有利于科研人員科學(xué)地評價(jià)檢測結(jié)果的變異是否真實(shí)反映運(yùn)動員身體機(jī)能水平的改變， 從而為運(yùn)動隊(duì)提供更精準(zhǔn)的科技服務(wù)。