不同生物炭對(duì)豬糞堆肥過程中抗生素及抗生素抗性基因的削減規(guī)律研究*

包燦鑫 張 園 陳明龍 周 潔 何文程 史鑫成

(蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009)

抗生素被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，未被完全吸收的抗生素和在動(dòng)物腸道內(nèi)攜帶抗生素抗性基因(ARGs)的菌株隨著畜禽糞便排出體外[1]，動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成的畜禽糞便污染成為環(huán)境中抗生素和ARGs的主要污染源之一?，F(xiàn)有研究表明，好氧堆肥能有效降低豬糞中的抗生素濃度和ARGs豐度[2-3]，進(jìn)而減輕畜禽糞便還田對(duì)環(huán)境中抗生素和ARGs的影響。生物炭是生物質(zhì)在低溫、缺氧條件下熱解形成的一種多孔富碳產(chǎn)物，由于多孔、疏水性和低密度的特性常被用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域來(lái)解決能源、環(huán)境、食品和氣候等多方面的問題。

對(duì)于抗生素，SRINIVASAN等[4]研究發(fā)現(xiàn)，高溫制備的松木屑生物炭比低溫生物炭能更顯著增加牧場(chǎng)土壤對(duì)磺胺甲惡唑(SMX)的吸附；韓璇[5]研究發(fā)現(xiàn)，水稻秸稈生物炭對(duì)底泥中SMX的吸附機(jī)制主要為沉淀作用和表面絡(luò)合作用，吸附能力明顯強(qiáng)于再力花生物炭；陳淼等[6]研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗渣生物炭提高了土壤對(duì)氧氟沙星和諾氟沙星(NOR)的吸附量，非線性吸附過程主要受到表面吸附、分配作用和其他微弱作用力的共同影響。還有研究發(fā)現(xiàn)，生物炭的比表面積和芳香化結(jié)構(gòu)影響著抗生素的分配系數(shù)[7]；PENG等[8]通過實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了不同生物炭對(duì)抗生素的吸附源于抗生素上的π鍵與生物炭芳香環(huán)上的π鍵形成π-π電子供體-受體作用(π-π EDA)。對(duì)于ARGs，生物炭作為一種理想的填充劑，可調(diào)節(jié)水分含量，為堆肥混合物中的微生物提供最佳的氣體環(huán)境和適宜的棲息地，可有效地提高堆肥處理中ARGs的去除效果。以水稻秸稈為原料制備的生物炭對(duì)ARGs的豐度沒有明顯的影響[9]；而CUI等[10]研究表明，蘑菇渣制備的生物炭可有效降低豬糞堆肥過程和產(chǎn)物中的ARGs；LI等[11]在雞糞堆肥中添加不同比例竹炭，可使堆肥產(chǎn)物中ARGs減少21.6%～99.5%；錢勛[12]研究表明，添加生物炭可使堆肥產(chǎn)物中ARGs總豐度比對(duì)照低81%，生物炭降低了ARGs宿主菌的豐度從而導(dǎo)致ARGs降低。

然而，目前研究生物炭對(duì)土壤、底泥中抗生素的降解較多，將生物炭應(yīng)用于豬糞好氧堆肥，分析其對(duì)豬糞中抗生素和ARGs削減的研究較少，關(guān)于不同生物炭對(duì)豬糞堆肥過程中抗生素及ARGs的削減規(guī)律仍需進(jìn)一步探討。本研究通過制備玉米秸稈生物炭(草本類生物炭)、竹炭(木本類生物炭)和豬糞生物炭(動(dòng)物生物質(zhì)類生物炭)，重點(diǎn)探討添加3種不同類型生物炭對(duì)豬糞好氧堆肥過程中抗生素濃度及ARGs豐度的影響。該研究結(jié)果為不同情況下選擇合適的生物炭提供理論指導(dǎo)，可以幫助管理糞便來(lái)源中由抗生素抗性引起的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料和方法

1.1 堆肥原料

新鮮豬糞取自蘇州某養(yǎng)豬場(chǎng)，玉米秸稈粉末取自蘇州某農(nóng)田，竹子取自蘇州某竹林，表1列出了堆肥原料的理化性質(zhì)。堆肥添加的玉米秸稈生物炭、竹炭和豬糞生物炭的制備條件為600 ℃熱解30 min，3種生物炭的元素組成和孔隙特征見表2、表3和圖1。

圖1 玉米秸稈生物炭、竹炭和豬糞生物炭的掃描電鏡圖

表1 材料的理化性質(zhì)1)

表2 玉米秸稈生物炭、竹炭和豬糞生物炭的元素組成

表3 玉米秸稈生物炭、竹炭和豬糞生物炭的孔隙特征

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3種類型的生物炭添加量均為0.12 kg(堆體總質(zhì)量的10%)，填裝在堆肥罐內(nèi)(聚氯乙烯材質(zhì)，體積為5 L)。將反應(yīng)器置于恒溫水浴鍋內(nèi)，根據(jù)堆體內(nèi)部的溫度對(duì)恒溫水浴鍋進(jìn)行階段升溫，以期模擬實(shí)際堆肥的自升溫過程[13]。根據(jù)生物炭類型不同共設(shè)置3個(gè)處理組(CP為玉米秸稈生物炭-豬糞堆肥處理組，BP為竹炭-豬糞堆肥處理組，PP為豬糞生物炭-豬糞堆肥處理組)和1個(gè)空白對(duì)照組(CK為不添加生物炭堆肥處理組)，每個(gè)處理組均設(shè)置5個(gè)平行。堆肥反應(yīng)持續(xù)60 d，每3天翻堆1次，每天17：00測(cè)量堆體溫度和環(huán)境溫度。根據(jù)堆體溫度變化分別在堆肥1、7、15、45、60 d時(shí)采集樣品，置于-20 ℃保存待測(cè)。

1.3 樣品分析

1.3.1 理化性質(zhì)測(cè)定

樣品的C、H、O、N、S含量采用元素分析儀(Vario MAX)測(cè)定；pH用pH計(jì)(PHS-3E)測(cè)定，土水比為1 g∶5 mL；通過場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800)得到不同生物炭的形貌，利用比表面積及孔徑分析儀(V-Sorb 2800P)和BET計(jì)算方法得到不同生物炭的比表面積、總孔體積和平均孔徑。

1.3.2 抗生素的測(cè)定

樣品的前處理采用固相萃取法(SPE)，處理過程主要參考文獻(xiàn)[13]。本研究測(cè)定了堆肥中9種抗生素濃度，分別是3種四環(huán)素類抗生素(TCs)——四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)和強(qiáng)力霉素(DOX)，3種磺胺類抗生素(SAs)——磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)和SMX，3種喹諾酮類抗生素(QNs)——恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)和NOR，采用高效液相色譜儀(Ultimate 3000)—三重四極桿質(zhì)譜儀(TSQ Quantum Ultra EMR)測(cè)定抗生素濃度[14]。

1.3.3 DNA提取和ARGs的定量

采用DNA提取試劑盒(FastDNA?SPIN Kit)提取堆肥樣品微生物基因組DNA[15]。本研究定量分析了4種四環(huán)素類抗性基因(TRGs，包括tetA、tetC、tetG和tetX)、3種磺胺類抗性基因(SRGs，包括sul1、sul2和sul3)和1種喹諾酮類抗性基因(QRGs，qnrS)，這些ARGs的引物設(shè)計(jì)主要來(lái)源于文獻(xiàn)[16]至文獻(xiàn)[19]。

在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(ABI 7500)上進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，設(shè)置20 μL的反應(yīng)體系：包括SYBR Premix Ex Taq酶溶液10 μL、前后引物(10 μmol/L)0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ溶液0.4 μL、模板DNA(10 ng/μL)2 μL、雙蒸餾水 6 μL。

反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)CT值(從基線到指數(shù)增長(zhǎng)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù))來(lái)確定起始模板濃度，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后使用建立好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)未知樣品進(jìn)行定量PCR，檢測(cè)樣品中ARGs拷貝數(shù)從而計(jì)算豐度，每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同生物炭對(duì)堆肥過程中抗生素濃度的影響

各處理組的抗生素總濃度均隨著堆肥的進(jìn)行不斷降低，TCs、SAs和QNs的總濃度基本符合升溫階段(1 d)>高溫階段(7、15 d)>冷卻階段(45 d)>腐熟階段(60 d)的變化規(guī)律(見圖2)。其中，BP中抗生素的總質(zhì)量濃度從312.45 μg/kg降到了8.90 μg/kg，降低了97%，效果最好；PP中抗生素的總質(zhì)量濃度從311.84 μg/kg降到了28.60 μg/kg，降低了90%；CP中抗生素的總質(zhì)量濃度從305.80 μg/kg降到了48.29 μg/kg，降低了84%。BP中TCs從195.72 μg/kg降到了3.70 μg/kg，SAs從58.71 μg/kg降到了3.70 μg/kg，QNs從58.02 μg/kg降到了1.50 μg/kg，TCs、SAs和QNs的去除率相比其他處理組均最高，分別為98%、94%和97%。PP中TCs從195.08 μg/kg降到了11.08 μg/kg，去除率達(dá)到94%，SAs從57.94 μg/kg降到了11.32 μg/kg，去除率僅有80%；而CP中3類抗生素的去除率均是各處理組中最低的，特別是SAs，去除率僅有74%。

注：字母不同代表樣品之間有顯著性差異(P<0.05)，圖3同。

2.2 添加不同生物炭對(duì)堆肥過程中ARGs豐度的影響

各處理組的ARGs總豐度均隨著堆肥的進(jìn)行先上升后下降，TRGs、SRGs和QRGs的總豐度符合高溫階段(7、15 d)>冷卻階段(45 d)>升溫階段(1 d)>腐熟階段(60 d)的變化規(guī)律(見圖3)。其中，竹炭的添加使BP中ARGs的總豐度從1011.27拷貝數(shù)/g降到了1010.99拷貝數(shù)/g，降低了48%；qnrS的豐度降幅最大，從107.38拷貝數(shù)/g降到了105.90拷貝數(shù)/g，下降了97%；而sul3的豐度下降的最少，從109.53拷貝數(shù)/g降到了109.52拷貝數(shù)/g，僅下降了1%。豬糞生物炭的添加使PP中ARGs的總豐度從1011.26拷貝數(shù)/g降到了1011.07拷貝數(shù)/g，降低了36%；tetA的豐度降幅最大，從1010.65拷貝數(shù)/g降到了109.84拷貝數(shù)/g，下降了85%；而sul3的豐度降幅最小，從109.53拷貝數(shù)/g降到了109.52拷貝數(shù)/g，僅下降了2%。玉米秸稈生物炭的添加使CP中ARGs的總豐度從1011.26拷貝數(shù)/g降到了1011.15拷貝數(shù)/g，降低了23%；tetC的豐度降幅最大，從109.61拷貝數(shù)/g降到了108.84拷貝數(shù)/g，下降了83%；而tetG的豐度降幅最小，從1010.48拷貝數(shù)/g降到了1010.26拷貝數(shù)/g，僅下降了40%。

圖3 堆肥過程中8種ARGs的豐度變化

然而，sul2在各處理組中的豐度均有上升并成為豐度最高的ARGs，竹炭的添加使得BP中sul2的豐度從1010.62拷貝數(shù)/g上升到1010.75拷貝數(shù)/g，升高了26%；玉米秸稈生物炭的添加使得CP中sul2的豐度從1010.57拷貝數(shù)/g上升到1010.94拷貝數(shù)/g，升高了57%；豬糞生物炭的添加使得PP中sul2的豐度從1010.55拷貝數(shù)/g上升到1010.78拷貝數(shù)/g，升高了41%。

3 討 論

3.1 添加不同生物炭對(duì)豬糞堆肥過程中抗生素濃度的影響分析

還原性、穩(wěn)定性、極性和芳香性的差異可能是3種生物炭吸附效率不同的主要原因，同時(shí)，在生物炭吸附抗生素過程中，通常不是單一機(jī)制，而是多種吸附機(jī)制的結(jié)合。吸附過程可分為外表面吸附和內(nèi)表面吸附，主要由生物炭和抗生素芳香環(huán)組成的π-π EDA吸附抗生素[20]。

添加竹炭堆肥對(duì)抗生素的平均去除率最高。π-π EDA是竹炭吸附抗生素的一個(gè)重要機(jī)制，元素分析表明，竹炭的H/C最小，擁有更高的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)和更高的芳構(gòu)化程度[21]。竹炭表面的羧基、硝基和酮基可充當(dāng)電子受體，與抗生素形成π-π EDA從而增強(qiáng)了吸附效果，并且生物炭中不同類型的羥基和氨基也可作為π電子供體?？紫短畛湟部煽闯墒侵裉课娇股氐囊粋€(gè)重要機(jī)制?？股卦谥裉可系奈娇赏ㄟ^擴(kuò)散到生物炭表面孔隙或未碳化餾分的有機(jī)物基質(zhì)上而實(shí)現(xiàn)。竹炭具有較大的比表面積和較多的孔隙結(jié)構(gòu)，可以提供較理想的物理吸附位點(diǎn)，使其表面能接觸到較多的抗生素；同時(shí)增強(qiáng)了抗生素的內(nèi)擴(kuò)散，提高了吸附效率。另外，迅速上升的溫度可以影響微生物群落，改變堆料性質(zhì)，使抗生素降解。

添加玉米秸稈生物炭堆肥對(duì)抗生素的平均去除率最低，因?yàn)橛衩捉斩捝锾烤哂休^高的灰分和特殊的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，較大的孔徑結(jié)構(gòu)與TC、SD和ENR等抗生素不契合，這些抗生素被吸附后很快從炭孔中解吸[22]，造成玉米秸稈生物炭與抗生素之間的填充未充分發(fā)揮作用。其中π-π EDA、金屬橋介導(dǎo)、表面絡(luò)合作用是玉米秸稈生物炭吸附抗生素的主要機(jī)制，并可能存在陽(yáng)離子交換。

添加豬糞生物炭堆肥對(duì)抗生素的去除具有選擇性。疏水作用是生物炭吸附抗生素的另一個(gè)機(jī)制。通常，低表面氧化的生物炭具有疏水性，可通過疏水作用與疏水性有機(jī)化合物發(fā)生反應(yīng)，從而達(dá)到削減抗生素的目的。豬糞生物炭具有較高的氧含量，在含氧官能團(tuán)周圍形成大量水分子簇導(dǎo)致其疏水性強(qiáng)[23]，而水分子簇與抗生素的競(jìng)爭(zhēng)削弱了生物炭對(duì)部分抗生素的吸附能力。

3.2 添加不同生物炭對(duì)豬糞堆肥過程中ARGs豐度的影響分析

為了減少畜禽養(yǎng)殖中ARGs向環(huán)境中傳播，好氧堆肥是一種削減糞便中ARGs豐度的重要技術(shù)。本研究中竹炭的添加使得BP中ARGs的總豐度降低了48%，效果最好；其中，qnrS的豐度降幅最大(97%)。竹炭能較好地降低qnrS的豐度是因?yàn)樗軌虼蠓档蚎RGs的運(yùn)輸[24]。但竹炭對(duì)ARGs的削減也具有選擇性，例如竹炭不能很好地降低sul3的豐度，因?yàn)樗鼡碛卸嗫捉Y(jié)構(gòu)，增大了微生物之間的空隙，可能會(huì)降低不同微生物之間的聯(lián)系。因此，生物炭可能會(huì)通過降低基因水平轉(zhuǎn)移作用從而減少部分ARGs在不同微生物之間的傳播。豬糞生物炭的添加使ARGs的總豐度降低了36%，效果次之；其中，tetA的豐度降幅最大(85%)，而sul3的豐度僅下降了2%。玉米秸稈生物炭的添加使CP中ARGs的總豐度降低了23%，效果不佳；其中，tetC的豐度降幅最大(83%)。以上ARGs的削減可能源于生物炭的吸附解吸作用，該作用導(dǎo)致部分功能微生物出現(xiàn)衰亡，細(xì)胞裂解釋放的DNA與胞外DNA同時(shí)被水解或生物降解；堆肥期間特定的溫度、濕度和pH條件下，微生物體內(nèi)功能性核酸酶的催化降解作用觸發(fā)ARGs消解，DNA分子逐漸脫穩(wěn)，部分雙鏈分子結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湻肿咏Y(jié)構(gòu)，同時(shí)，磷酸二酯鍵斷裂，氫鍵穩(wěn)定性降低，末端堿基脫落，均促進(jìn)ARGs得到有效消解。

然而，sul2在各處理組中的豐度均有上升并成為豐度最高的ARGs，ZHANG等[25]和SELVAM等[26]認(rèn)為sul2豐度的增加與微生物群落結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)，這可能是由于生物炭攜帶了上述基因或?yàn)槠渌拗骶峁┝肆己玫姆敝抄h(huán)境，因此豐度升高。本研究中添加玉米秸稈生物炭堆肥中sul2的豐度增幅最大(57%)，這與WANG等[27]的研究一致，玉米秸稈生物炭能增加動(dòng)物糞便高溫堆肥中sul2的豐度。添加竹炭堆肥中sul2的豐度增幅最小(26%)，溫度可能是影響sul2變化的重要因素[28]，以此推斷本研究中添加竹炭的堆體溫度適宜，在一定程度上抑制了sul2豐度的升高。

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究對(duì)比添加不同生物質(zhì)來(lái)源的生物炭對(duì)堆肥過程中抗生素及ARGs的影響，發(fā)現(xiàn)添加竹炭堆肥對(duì)豬糞中抗生素及ARGs的降解效果最佳，實(shí)現(xiàn)了木本類生物炭的高附加值利用，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了畜禽糞便的資源化利用，降低了畜禽糞便中殘留的抗生素及ARGs帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

本研究為不同情況下選擇合適的生物炭提供理論指導(dǎo)，但生物炭對(duì)堆體中抗生素及其ARGs削減機(jī)制還需進(jìn)一步研究，堆體中微生物群落的變化與抗生素、ARGs削減規(guī)律的聯(lián)系，抗生素降解菌與ARGs潛在宿主微生物的貢獻(xiàn)需要重點(diǎn)關(guān)注。