手性環(huán)氧醇及其磷酸酯化物的合成及抗腫瘤活性篩選

張 迪，陳 平，王 舒，戚仲鈺，詹小燕，杜 曦

1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 藥物化學(xué)教研室（瀘州 646000）；2.遂寧市中心醫(yī)院 藥學(xué)部（遂寧 629000）；3.天府中藥城管理委員會（彭州611900）；4.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室（瀘州 646000）

環(huán)氧化物，尤其是手性環(huán)氧醇，是各種活性藥物的重要砌塊[1-6]。例如，抗腫瘤化合物FR901464[7]、depudecin[8]和抗病毒核苷[9]都屬于手性環(huán)氧化物。目前，各種手性環(huán)氧醇的制備還是以Sharpless 法[10-11]為主，該法以烯丙醇為底物，Ti配合物為催化劑，可獲得較高收率及對映異構(gòu)過量的手性環(huán)氧醇（收率85%，ee 值90%～99%）（圖1）。然而，Sharpless 法在含苯基或炔基的烯丙醇環(huán)氧化領(lǐng)域應(yīng)用較少，從現(xiàn)有研究來看，大基團芳香烯丙醇的環(huán)氧化效果較小基團取代的烯丙醇差[12]。

圖1 Sharpless不對稱環(huán)氧化Figure 1 Sharpless asymmetric epoxidation

本研究通過對催化劑種類、催化劑-配體的摩爾比、分子篩類型、溫度和時間等條件的篩選，擬建立含苯基或炔基的烯丙醇的環(huán)氧化優(yōu)化反應(yīng)體系，獲得該類烯丙醇的環(huán)氧化產(chǎn)物。同時，鑒于對環(huán)氧化物的穩(wěn)定性、選擇性和生物利用度提高的考慮，對環(huán)氧化物分子進行修飾具有一定的必要性。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，不少藥物的磷酸酯化物均表現(xiàn)出不錯的活性作用[13-16]，因此，磷酸酯化常作為藥物設(shè)計中的重要手段[17]。由此，本研究對獲得的環(huán)氧醇進行磷酸酯化修飾，并對環(huán)氧醇及其相應(yīng)的磷酸酯化物進行抗腫瘤活性的評估，以期獲得該類化合物的生物活性信息。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

如無特殊說明，所有溶劑經(jīng)預(yù)干燥處理后使用，試劑均為分析純。1H NMR、13C NMR 和31P NMR 用Bruker AM-400 型核磁共振儀測定（以TMS 為內(nèi)標，CDCl3為溶劑）；質(zhì)譜采用Finnigan LCQDECA 質(zhì)譜儀測定；HPLC采用島津LC-2030測定。

1.2 化合物3b～8b的合成與表征

將活化的4 ? 分子篩（60 mg）置于10 mL單頸圓底燒瓶，氮氣置換后加入3 mL超干二氯甲烷，于-25 ℃下攪拌冷卻15 min，再依次加入四異丙醇鈦（29.12 μL，0.0984 mmol）和（L）-（+）-酒石酸二異丙酯（31.05 μL，0.1476 mmol），攪拌30～40 min，添加叔丁基過氧化氫（2.98 mL，2.98 mmol）并攪拌60 min，最后，逐滴加入2-戊基-3-苯基烯丙醇（0.38 g，2 mmol），攪拌4 h。待反應(yīng)完成后，加入適量含30% 氫氧化鈉的飽和氯化鈉溶液，經(jīng)減壓蒸餾、柱層析分離得2-戊基-3-苯基-2，3-環(huán)氧丙醇（3b）。4b～8b的合成同上。產(chǎn)物的產(chǎn)率及對映異構(gòu)過量（ee）值利用HPLC測定，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)采用NMR、MS進行表征。

1.3 3c～5c和8c的合成與表征

氮氣保護下，于10 mL單頸圓底燒瓶中依次加入：2-戊基-3-苯基-2，3-環(huán)氧丙醇（3b）（1 mmol，0.206 g），新蒸二氯甲烷（20 mL），N，N-二甲基甲酰胺（0.1 mmol，12.2 mg），無水三乙胺（3 mmol，0.4 mL），25 ℃下攪拌30 min，再加入氯磷酸二苯酯并攪拌30 min。待反應(yīng)完成后，加入適量冰水，經(jīng)減壓蒸餾、柱層析分離得2-戊基-3-苯基-2，3-環(huán)氧丙烷基磷酸二苯酯（3c）。4c～5c，8c合成方法同上。產(chǎn)物的產(chǎn)率及ee值利用HPLC測定，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)采用NMR、MS進行表征。

1.4 抗腫瘤活性初篩

取出凍存細胞于37 ℃水浴中快速溶解，加入RPMI1640 或DMEM 培養(yǎng)基混勻離心，棄去上清液，用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀后，將重懸細胞液加入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞長至對數(shù)生長期，將其接種于96孔板上，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。先用二甲基亞砜溶解各試驗樣品，配成100 mmol/L的各試驗樣品儲備溶液，然后用相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋成濃度梯度的待測樣品，以預(yù)實驗確定的大致有效濃度范圍及作用時間進行藥物處理，每個濃度設(shè)復(fù)孔，100 μL/孔，于37 ℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。藥物處理結(jié)束后，加入含10% CCK8 的培養(yǎng)基100 μL，避光培養(yǎng)1 h，用酶標儀（檢測波長450 nm）測定吸光值，計算藥物的半數(shù)抑制濃度IC50值。

2 結(jié)果

2.1 手性環(huán)氧醇及其磷酸酯化物的合成與表征

2.1.1 手性環(huán)氧醇及其磷酸酯化物的合成 試劑和條件：（i）4? MS，Ti（OiPr）4，（L）-（+）-DIPT，TBHP，DCM，-25 ℃，4 h；（ii）三氟乙醇，氯磷酸二苯酯，DMAP，r.t.，30 min（圖2）。

圖2 環(huán)氧化物及其磷酸酯化物的合成Figure 2 Synthesis of epoxides and their phosphate esters

按1.2及1.3所述方法合成了多個環(huán)氧醇及其磷酸酯化物，如表1所示。

表1 環(huán)氧醇及其磷酸酯化物的合成Table 1 Synthesis of epoxide alcohols and their phosphate esters

2.1.2 手性環(huán)氧醇及其磷酸酯化物的表征 2-戊基-3-苯基-2，3-環(huán)氧丙醇（3b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.43-7.24（m，5H），4.25（s，1H），4.00-3.90（m，1H），3.82（dd，J=12.4，9.1 Hz，1H），1.98（dt，J=9.4，4.7 Hz，1H），1.60-1.43（m，1H），1.41-1.00（m，8H），0.76（t，J=6.8 Hz，3H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 135.61，128.06，127.54，126.39，66.16，62.89，60.23，31.74，27.32，24.24，22.17，13.82.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C14H20NaO2]+：243.1356，found：243.1326.

2-戊基-3-苯基-2，3-環(huán)氧丙烷基磷酸二苯酯（3c）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.58-7.06（m，15H），4.38（d，J=6.4 Hz，2H），4.08（s，J=22.8 Hz，1H），1.47-1.35（m，2H），1.33-1.16（m，2H），1.15-1.05（m，2H），1.04（s，2H），0.73（d，J=6.6 Hz，3H）;31P NMR（CDCl3，100 MHz）：δ-11.75;13C NMR（CDCl3，100 MHz）：δ 150.47，134.72，129.89，128.10，127.80，126.49，125.54，120.10，70.50，63.86，61.61，31.64，26.45，24.01，22.18，13.83.HRMS（ESI）：calculated m/z[M+Na]+for[C26H29NaO5P]+：475.1645，found：475.1629.

3-苯基-2，3-環(huán)氧丙醇（4b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.42-7.27（m，5H），4.08（ddd，J=12.8，4.9，2.3 Hz，1H），3.96（d，J=2.1 Hz，1H），3.87-3.78（m，1H），3.34-3.13（m，1H），2.06（d，J=7.1 Hz，1H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 136.64，128.53，128.35，125.73，62.42，61.23，55.59.

3-苯基-2，3-環(huán)氧丙烷基磷酸二苯酯（4c）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.69-7.02（m，15H），4.44（dt，J=156.7，48.0 Hz，2H），3.82（s，1 H），3.29（s，1 H）；31P NMR（CDCl3，100 MHz）：δ-12.37；13C NMR（CDCl3，100MHz）：δ150.32，135.81，129.87，128.57，125.71，125.55，120.15，120.10，68.22，59.56，56.35.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C21H19NaO5P]+：405.0862，found：405.0838.

2-甲基-3-苯基-2，3-環(huán)氧丙醇（5b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.42-7.25（m，5H），4.25（s，1H），3.89（d，J=12.5 Hz，1H），3.78（d，J=12.5 Hz，1H），1.32（dd，J=6.2，1.6 Hz，1H），1.11（s，3H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 135.59，128.14，127.61，126.43，64.96，63.83，60.21，13.48.HRMS（ESI）：calculated m/z[M+Na]+for[C10H12NaO2]+：187.0730，found：187.0724.

2-甲基-3-苯基-2，3-環(huán)氧丙烷基磷酸二苯酯（5c）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.19（dd，J=30.8，24.3 Hz，15H），4.44-4.11（m，2H），4.01（d，J=20.5 Hz，1H），1.07（d，J=19.9 Hz，3H）;31P NMR（CDCl3，100 MHz）：δ-11.86;13C NMR（CDCl3，100 MHz）：δ 149.35，133.59，128.74，127.09，126.79，125.45，124.42，118.95，71.49，60.47，60.17，12.15.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C22H21NaO5P]+：419.1019，found：419.1004.

2，3-二苯基-2，3-環(huán)氧丙醇（6b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 8.06-6.80（m，10H），5.03（s，1H），4.16（s，1H），3.31（s，1H），2.42（s，1H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 139.06，136.45，128.70，128.48，128.40，128.31，126.55，125.71，71.08，64.92，54.86.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C15H14NaO2]+：249.0886，found：249.0854.

1-辛炔基-3-苯基-2，3-環(huán)氧丙醇（7b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.49-7.29（m，4H），4.74（td，J=4.8，2.1 Hz，1H），4.07（d，J=2.0 Hz，1H），3.33（dd，J=2.8，2.2 Hz，1H），2.25（td，J=7.1，2.0 Hz，2H），2.14（d，J=4.9 Hz，1H），1.61-1.56（m，2H），1.46-1.07（m，6H），1.00-0.80（m，3H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 136.24，131.50，128.82，128.58，127.99，127.81，126.77，87.61，79.09，78.91，63.22，31.33，28.59，28.56，22.55，18.82，14.06.HRMS（ESI）：calculated m/z [M +Na]+for[C17H22NaO2]+：281.1512，found：281.1096.

4-炔基-2，3-環(huán)氧丁醇（8b）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 3.98（s，1H），3.75（s，1H），3.57-3.14（m，3H），2.43-2.33（m，1H），1.87（d，J=46.3 Hz，2H），1.33（d，J=3.8 Hz，1H）;13C NMR（CDCl3，101 MHz）：δ 79.62，72.64，59.94，59.74，42.16，21.77.GC-MS（EI）m/z（%）：31.93（40），27.94（100），18.95（55），17.94（60）.

4-炔基-2，3-環(huán)氧丁烷基磷酸二苯酯（8c）：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 7.21（dd，J=50.1，64.0 Hz，10H），4.34-4.15（m，2H），3.35（s，1 H），3.26（s，1 H），2.28（s，1 H）;31P NMR（CDCl3，100 MHz）：δ-11.75;13C NMR（CDCl3，100 MHz）：δ 148.91，128.66，124.67，119.02，77.84，71.89，65.87，55.63，41.70.HRMS（ESI）：calculated m/z [M+Na]+for [C17H15NaO5P]+：353.0549，found：353.0526.

2.2 抗腫瘤活性初篩

上述化合物通過CCK8 細胞增殖實驗進行了抗腫瘤活性初篩，結(jié)果見表2。

表2 環(huán)氧醇及其磷酸酯化物的抗腫瘤活性初篩Table 2 Preliminary screening of antitumor activity of epoxide alcohols and their phosphate esters

3 討論

3.1 手性環(huán)氧醇及其磷酸酯化物的合成

如圖2所示，以3a為模型底物進行環(huán)氧化反應(yīng)，考察 了Ti（OiPr）4-（L）-（+）-DIPT 和Ti（OiPr）4-（L）-（+）-DET 對反應(yīng)的催化作用，發(fā)現(xiàn)Ti（OiPr）4-（L）-（+）-DIPT 的催化效果較好，當n（Ti（OiPr）4）：n（（L）-（+）-DIPT）=0.65 時產(chǎn)物3b 的ee 值可達92%。結(jié)果表明，不同配體及不同的配比對Ti 配合物的催化效果具有較顯著的影響。綜合環(huán)境因素及經(jīng)濟因素，以n（Ti（OiPr）4）：n（（L）-（+）-DIPT）=0.65作為優(yōu)化條件。

從實驗結(jié)果上不難發(fā)現(xiàn)，4 ?和3 ?均能提高ee 值（ee ＞90%），但前者的產(chǎn)率遠優(yōu)于后者，我們猜測可能是由于4?分子篩的空隙相較于其他分子篩對反應(yīng)體系生成的微量水有更好的吸附能力，能使因水存在而失活的催化劑再次“活化”，使催化劑保持催化活性[18-20]。此外，在-15 ℃至-35 ℃范圍內(nèi)，ee 值無明顯差異，但產(chǎn)率先增加后遞減，在-25 ℃達到最大值。在優(yōu)化條件下，反應(yīng)時間由8 h縮短到4 h，以保證最佳產(chǎn)率和ee值。

基于不同基團的活性差異以及調(diào)整溶解性的考慮，對第一步得到的環(huán)氧化合物進行了磷酸酯化反應(yīng)。以2-戊基-3-苯基烯丙醇的環(huán)氧化產(chǎn)物3b為模型反應(yīng)物，進行磷酸酯化反應(yīng)，得到環(huán)氧磷酸酯化物3c。其他化合物的合成參照以上方法進行。結(jié)果表明，磷酸酯化反應(yīng)迅速且徹底，產(chǎn)物的產(chǎn)率高（均大于96%），而ee值依賴于磷酸酯化反應(yīng)底物環(huán)氧醇的ee值。

3.2 抗腫瘤活性初篩

在給定濃度范圍（100～800 μmol/L）內(nèi)，8c 對Hela細胞、231 細胞和HepG2 細胞增殖均有良好的抑制作用，且其對三種細胞的抑制強弱依次為Hela、HepG2、231。而3b、3c 則僅對Hela 細胞增殖有一定的抑制活性，4c僅對HepG2細胞增殖有一定的抑制作用。

4 結(jié)論

本文研究了以烯丙醇為起始原料的Sharpless不對稱環(huán)氧化反應(yīng)以及環(huán)氧醇磷酸酯化反應(yīng)。優(yōu)化的反應(yīng)條件適用于含苯基或炔基的烯丙醇類化合物，有較高產(chǎn)率和ee值。對合成的環(huán)氧醇及其相應(yīng)的磷酸酯化物進行抗腫瘤活性初篩，其中部分化合物對腫瘤細胞增殖有一定的抑制作用。

（利益沖突：無）