兩種蔥屬植物柱頭可授性檢測

肖運強，劉俊霞，張 飛

（1.喀什職業(yè)技術(shù)學院，新疆 喀什 844000；2.克州人力資源與社會保障局）

蔥屬植物為多年生草本，常有蔥蒜味，具圓柱狀至球狀鱗莖[1]。多數(shù)為優(yōu)良牧草，有很高的飼用價值，對牲畜抓膘、育肥和防病、治病有重要作用[2]。我國蔥屬植物現(xiàn)今己知約有115種，主要分布在東北、華北、西北和西南地區(qū)[3]。新疆蔥屬植物資源豐富，是世界該屬植物的起源和分布中心之一[4]，其種類約占全國蔥屬植物的1/2，迄今為止已知達54種、2變種，其中29種僅在我國新疆分布[3]。

棱葉韭（Allium caeruleumPallas.）為百合科蔥屬的植物，俗稱蘭花蔥，其傘形花序球狀，具多而密集的花，花為天藍色[3]，生長于海拔1 140～ 2 950 m的地區(qū)，一般生于真草原、草甸草原、亞高山草甸、山地灌叢等地，國內(nèi)僅分布于新疆，察布察爾、特克斯、昭蘇、尼勒克、新源、木壘、阜康均有分布[5]；國外在原蘇聯(lián)伏爾加河下游到西伯利亞也有分布。在應用上，棱葉韭常被用作薤白的代用品，具有一定的藥用價值[6]。

知母薤（Allium cernuumSchrenk.）為百合科蔥屬植物，花序半球形至球形，花天藍色，具深色的脈，花絲長為花被片3/4的長度，花期為5～6月，生于荒漠、干旱海拔700～ 2 000 m草場。產(chǎn)于額爾齊斯河、伊犁河沿岸。哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、塔吉克斯坦、烏茲別克斯坦也有分布。

花粉的活力與壽命、柱頭的可授性為傳粉生態(tài)學所必須研究的內(nèi)容[7]。趙金花等[2]采用TTC法、孢粉染色法及聯(lián)苯胺-過氧化氫法，從花粉活力、花粉可育性及柱頭可授性方面研究了蒙古韭（Allium?mongolicum）、堿韭（A .polyrhizum）和細葉韭（A.tenuissimum）3種野生蔥屬植物的傳粉生物學特征。林辰壹等[8]用MTT法和聯(lián)苯胺-過氧化氫法可在田間快速檢測高葶韭柱頭育性。目前，國內(nèi)外有關(guān)棱葉韭和知母薤繁殖規(guī)律特點研究尚未見報道。本文以蔥屬植物棱葉韭和知母薤為供試材料，采用不同的方法在不同時期檢測棱葉韭和知母薤柱頭可授性，并找出2種蔥屬植物柱頭可授性的變化規(guī)律，為提高其繁殖數(shù)量及雜交育種和資源利用提供理論依據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣地概況及試驗材料

試驗地位于烏魯木齊市西郊，三坪農(nóng)場新疆農(nóng)業(yè)大學教學實習基地蔥屬植物資源圃，地理位置為43°48′N，87°34′E，海拔850 m，處于準格爾盆地南緣天山前山帶沖積扇平原，土壤為細礫質(zhì)荒漠土。

通過田間定株觀察，當棱葉韭和知母薤處于盛花期時，根據(jù)單花的開花動態(tài)，將棱葉韭分為10個時期，知母薤分為7個時期，分別取各時期的柱頭進行檢測可授性，具體取材標準，如表1和表2所示。

表1 棱葉韭取樣標準

表2 知母薤取樣標準

1.2 主要實驗儀器

分析天平、燒杯、容量瓶、量筒、刀片、鑷子、玻璃棒、棕色儲液瓶、標簽、記號筆、載玻片、蓋玻片、pH試紙、便攜式冰箱、白紙、熒光顯微鏡、帶螺口蓋的玻璃瓶、離心瓶、培養(yǎng)皿、黑布等。

1.3 藥品配制

1.3.1 5 mg/L MTT法藥品配制

稱取0.25 g MTT，溶于50 mL濃度為0.15 mol/L磷酸氫二鉀緩沖液（3.423 3 g磷酸氫二鉀溶于50 mL蒸餾水，pH=7.4）中[8]。

1.3.2 聯(lián)苯胺-過氧化氫法藥品配制

將1%聯(lián)苯胺（聯(lián)苯胺0.108 2 g溶于10.8 mL 70%酒精中）、3%過氧化氫、蒸餾水按體積比為4∶11∶22的比例混合[2]、[13]。

1.3.3 苯胺藍-熒光顯微鏡法藥品配制

FAA固定液配制：量取37%～ 40%甲醛5 mL；45%冰醋酸5 mL；70%酒精90 mL，混合均勻。

8 mol/L NaOH溶液：稱取32 g NaOH溶于100 mL蒸餾水中。

0.1%苯胺藍溶液：稱取0.1 g苯胺藍溶于100 mL0.15 mol/L K2HPO4緩沖液（K2HPO43.423 3 g溶于100 mL蒸餾水）中[9]。

注意事項：脫色水溶性苯胺藍溶液應提前24 h配置好，放在黑暗處保存。配好的藥液應避光，放在4 ℃的冰箱內(nèi)保存。

1.4 試驗方法

本試驗棱葉韭、知母薤柱頭可授性檢測主要采用MTT法、聯(lián)苯胺-過氧化氫法和苯胺藍-熒光染色法，其中，MTT法和聯(lián)苯胺-過氧化氫法在三坪農(nóng)場新疆農(nóng)業(yè)大學教學實習基地蔥屬資源圃進行，苯胺藍-熒光顯微鏡法在新疆農(nóng)業(yè)大學園藝樓五樓顯微觀察室進行。

1.4.1 MTT法

具體方法：取不同花藥呈現(xiàn)階段棱葉韭和知母薤的柱頭各20枚，將柱頭置于盛有5 mg/L MTT溶液的培養(yǎng)皿中，每個供試柱頭用藥液充分浸透，放在避光的處反應10 min，若柱頭具有可授性，則柱頭被染成深藍色或深紫色，顏色由淺變深，柱頭可授性由弱變強。若沒有可授性，則柱頭沒有顏色反應。

1.4.2 聯(lián)苯胺-過氧化氫法

具體方法：剪取不同花藥呈現(xiàn)階段棱葉韭和知母薤的柱頭各20枚，浸入裝有聯(lián)苯胺-過氧化氫反應液的培養(yǎng)皿中。1～2 min后觀察柱頭染色的部位，柱頭至少2/3部位呈現(xiàn)深藍色并伴有大量氣泡出現(xiàn)認為柱頭具有可授性，否則柱頭沒有可授性。然后計算具有可授性的柱頭數(shù)量占共測柱頭總數(shù)的百分率。

1.4.3 苯胺藍-熒光染色法

具體方法：采集棱葉韭和知母薤各個時期的柱頭各20枚，立即放入FAA固定液中，并置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。柱頭在熒光顯微鏡下觀察之前，應進行軟化、沖洗、染色及封片處理。軟化：將材料放入8 mol/L NaOH中，軟化3 h；沖洗：將軟化的材料撈出，蒸餾水沖洗至少1 h，中間多次換水；染色：將沖洗后的材料放在0.1%水溶性苯胺藍染液中4 ℃環(huán)境下染色4 h；封片：染色后的柱頭放在載玻片上，用吸水紙將染液吸干，將柱頭與子房分離，滴一滴甘油（丙三醇），蓋上蓋玻片，用鉛筆上的橡皮頭輕壓，使花柱展開；觀察：將片子放在Nikon ECLIPSE 80 i 熒光顯微鏡330～ 380 波段下，用10 倍鏡進行觀察。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件，圖片整理采用Adobe Photoshop CC軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 棱葉韭柱頭可授性

由表3和圖1可知，采用MTT法，第Ⅲ時期及之前每個時期棱葉韭柱頭可授性為0；第Ⅳ時期為50%，柱頭開始具有可授性；第Ⅵ時期和第Ⅶ時期達到100%，柱頭可授性達到最佳狀態(tài)；第Ⅷ時期為85.7%，柱頭可授性開始下降；第Ⅸ時期及以后時期為0，柱頭不具可授性。

表3 3種方法檢測知母薤柱頭可授性

圖1 3種方法檢測棱葉韭柱頭可授性

棱葉韭柱頭與聯(lián)苯胺-過氧化氫反應后，具有可授性的柱頭變成藍色變化并有氣泡產(chǎn)生。第Ⅲ時期及以前時期柱頭可授性為0；第Ⅳ時期為50%，柱頭開始具有可授性；第Ⅵ時期和第Ⅶ時期達到100%，柱頭可授性達到最佳狀態(tài)；第Ⅷ時期為22.2%，柱頭可授性開始下降。

熒光顯微鏡觀察柱頭可授性，發(fā)現(xiàn)棱葉韭在第Ⅱ時期及以前時期柱頭可授性為0；第Ⅲ時期為25%柱頭可是具有可授性，花粉管萌發(fā)的數(shù)量少，第Ⅴ時期花粉管萌發(fā)數(shù)量多，可授性達到100%。之后的每個時期可授性都保持平穩(wěn)的狀態(tài)。

2.2 知母薤柱頭可授性

由表4和圖2可知，知母薤柱頭與MTT反應后，具有可授性的柱頭變成藍色變化并有氣泡產(chǎn)生。第Ⅰ時期柱頭可授性為0；第Ⅱ時期為25%，柱頭開始具有可授性；第Ⅲ時期達到72.7%，柱頭可授性達到最高；第Ⅵ時期為0，柱頭失去可授性。

表4 3種方法檢測棱葉韭柱頭可授性

圖2 3種方法檢測知母薤柱頭可授性

知母薤柱頭與聯(lián)苯胺-過氧化氫反應后柱頭呈現(xiàn)藍紫色，顏色由淺變深，柱頭可授性由弱變強。第Ⅰ時期柱頭可授性為0；第Ⅱ時期為25%，柱頭開始具有可授性；第Ⅴ時期為80%，柱頭可授性達到最高；第Ⅶ時期為0，柱頭失去可授性。

熒光顯微鏡觀察柱頭可授性，第Ⅰ時期及以前每個時期柱頭可授性為0；第Ⅱ時期為50%，柱頭開始具有可授性；第Ⅳ時期達到100%，柱頭可授性達到最佳狀態(tài)，之后的每個時期都保持平穩(wěn)狀態(tài)。

3 討論

柱頭可授期是花朵成熟過程中的一個重要時期，它能在很大程度上影響自花傳粉率、開花不同階段的傳粉成功率[10]。不同植物柱頭可授期持續(xù)的時間從幾小時到十幾天不等[11]，花的年齡、一天內(nèi)的不同時間以及柱頭分泌物的有無等對其均有影響[12]。用MTT法和聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測柱頭可授性，在很多文章中有相關(guān)報道[2]、[13-14]。本試驗中，棱葉韭和知母薤在六枚花藥已散粉、花被片開始閉合到花被片完全閉合出現(xiàn)柱頭可授性的高峰，這與蔥屬植物高葶韭的柱頭可授性表現(xiàn)基本一致。棱葉韭和知母薤的柱頭可授期與柱頭的形態(tài)特征變化密切相關(guān)，在六枚花藥散粉、花被片開始閉合、柱頭開始伸長過程中，柱頭才具有可授性，時間較短，要充分把握柱頭的可授期特點在今后育種過程中為最佳授粉期的選擇提供了重要依據(jù)，保證人工馴化過程中繁殖成功[8]。

3種方法檢測棱葉韭柱頭可授性，用MTT法檢測柱頭可授性時，在第Ⅲ時期柱頭不具可授性，在第Ⅵ時期出現(xiàn)柱頭可授性高峰，一直持續(xù)到第Ⅶ時期，用聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測柱頭可授性時，柱頭可授性在第Ⅵ時期到第Ⅶ時期出現(xiàn)柱頭可授性高峰，用苯胺藍-熒光染色法檢測柱頭可授性時，第Ⅲ時期出現(xiàn)柱頭可授性，第Ⅴ時期柱頭可授性達到最大值，此后一直保持穩(wěn)定。苯胺藍-熒光染色法檢測柱頭可授性與MTT法和聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測柱頭可授性的規(guī)律不同，苯胺藍-熒光染色法檢測的是花粉在柱頭上萌發(fā)，花粉管從柱頭經(jīng)花柱到子房行走的路徑，間接反應柱頭的可授性，但不能說明此時柱頭具有可授性。因此，柱頭真正具有可授性的時間比苯胺藍-熒光染色法檢測顯示的時間早。

3種方法檢測知母薤柱頭可授性，在第Ⅱ時期之前都未出現(xiàn)柱頭可授性。用MTT法檢測知母薤柱頭可授性在第Ⅲ時期柱頭可授性達到最高值，隨后下降，用聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測柱頭可授性，在第Ⅴ時期柱頭可授性達到最高值，這與MTT法檢測的結(jié)果不同，可能是由于采集柱頭時出現(xiàn)的誤差導致。用苯胺藍-熒光染色法，在第Ⅱ時期柱頭出現(xiàn)可授性，第Ⅳ時期可授性達到最高值，隨后保持不變。這與前2 種方法檢測的結(jié)果有差異，原因是苯胺藍-熒光染色法檢測的是花粉在柱頭上萌發(fā)，花粉管從柱頭經(jīng)花柱到子房行走的路徑，間接反應柱頭的可授性，但不能說明此時柱頭具有可授性，這與苯胺藍-熒光染色法檢測棱葉韭柱頭可授性的結(jié)果一致。因此，柱頭真正具有可授性的時間比苯胺藍-熒光染色法檢測顯示的時間早。

4 結(jié)論

3種方法檢測棱葉韭柱頭可授性，在6枚花藥已散粉，柱頭微長于花被片，花被片半閉合（Ⅴ）到花被片完全閉合（Ⅶ）3個時期，可授性達到最高，在此期間授粉效果最佳。

3種方法檢測知母薤柱頭可授性，在6枚花藥已散粉，柱頭等于花絲，子房未膨大（Ⅲ）到6枚花藥已散粉，柱頭微長于花絲，花被片即將完全閉合，略干枯發(fā)黃（Ⅴ），可授性達到最高，在此期間授粉效果最佳。

3種方法中，MTT法和聯(lián)苯胺-過氧化氫法方便、快捷，檢測結(jié)果明顯，可直接用于田間檢測蔥屬植物柱頭可授性；苯胺藍-熒光染色法雖然檢測結(jié)果準確，但易受試驗成本和儀器的限制，因此檢測柱頭可授性時，此種方法不建議使用。