白藜蘆醇對氧化應(yīng)激仔豬肝臟抗氧化酶、細胞因子mRNA表達及核因子E2相關(guān)因子2相關(guān)因子信號通路的影響

姬孟瑤 荀文娟 侯冠彧 施力光* 侯曉曉 楊 文

(1.海南大學動物科技學院，?？?70228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，儋州571737)

隨著現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展以及生豬養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，早期斷奶技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用，仔豬斷奶時由于飼糧、免疫、生理等因素的變化，都會導(dǎo)致仔豬受到不同程度的應(yīng)激[1]。肝臟是機體發(fā)揮脂質(zhì)代謝[2]、免疫防御[3]等功能的重要器官。當仔豬處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時，體內(nèi)活性氧大量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致機體損傷，抗氧化系統(tǒng)失衡[4]。腸道屏障破壞、免疫功能異常、腸道菌群失調(diào)、肝臟線粒體損傷等問題接踵而來，致使仔豬腹瀉率、死亡率上升[5-6]。因此，探索一種高效、安全的天然抗氧化劑對于提升養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益而言尤為重要。

白藜蘆醇(resveratrol，RES)屬于二苯乙烯家族，這種植物多酚主要存在于葡萄、花生、漿果、茶葉等植物中，是許多植物受到刺激時分泌的一種抗毒素[7]。大量的研究結(jié)果表明，RES具有抗氧化、抗炎、抗癌、心血管保護作用及脂肪沉積調(diào)控等廣泛的生物學功能[8-12]。本課題組前期研究表明，RES可通過提高氧化應(yīng)激仔豬回腸抗氧化酶活性，改善回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，抑制腸道炎癥的發(fā)生，從而達到對仔豬氧化應(yīng)激的緩解作用[13]，對其平均日增重(ADG)及平均日采食量(ADFI)也有顯著提升的效果[14]。一些研究表明，RES通過清除自由基及作用于多個細胞靶點，如核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、去乙?；?(SIRT1)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，控制氧化應(yīng)激相關(guān)的過程和信號通路，在各種應(yīng)激條件下對肝臟氧化損傷具有保護作用[15-16]，但RES發(fā)揮其抗氧化作用的具體分子機制尚不明確。另外，RES可通過調(diào)節(jié)Nrf2/血紅素加氧酶-1(HO-1)/NADPH醌氧化還原酶1(NQO1)信號通路及SIRT1/AMPK/過氧化物酶體增殖活化受體γ輔激活因子-1α(PGC-1α)信號通路來緩解小鼠腎臟衰老導(dǎo)致的炎癥[17]。Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Keap1)/Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路作為內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答機制信號通路之一，在氧化應(yīng)激中占有重要的地位。當細胞受到氧化應(yīng)激時，Keap1負性調(diào)控Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，Nrf2與其抑制蛋白Keap1發(fā)生解離，轉(zhuǎn)移到細胞核中，進而促進其靶基因表達，如NQO1、HO-1、超氧化物歧化酶1(SOD1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)等[18-20]。

目前，RES的研究主要集中在畜禽生長性能、繁殖性能、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化性能等方面。其中，抗氧化性能的研究主要集中在對于仔豬腸道炎癥的減輕、腸道菌群的調(diào)節(jié)以及維持腸黏膜完整性等方面，而對于仔豬肝臟炎癥的緩解作用則鮮有報道[21-22]。因此，本研究擬在正常飼養(yǎng)條件下，通過腹腔注射敵草快(diquat)建立仔豬氧化應(yīng)激模型，驗證并比較不同劑量的RES對斷奶仔豬肝臟抗氧化酶及細胞因子mRNA表達、Keap1/Nrf2/ARE信號通路的影響，探討RES對肝臟炎癥的緩解作用，以期為RES作為仔豬飼料添加劑的合理使用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

RES購于上海某生物科技有限公司，純度98%；diquat購于Sigma公司；qPCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與RNA提取試劑盒均購于南京諾唯贊生物有限公司。Keap1和Nrf2抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，NQO1和豬甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。蛋白酶抑制劑及勻漿緩沖液分別購自武漢博士德生物工程有限公司和上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

選取健康狀況良好、胎次相近的28日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬30頭，根據(jù)體重相近及公母各占1/2原則隨機分為5組，分別為對照組(CON組)、diquat組(DIQ組)和試驗組(RES-10組、RES-30組、RES-90組)，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭仔豬。CON組和DIQ組仔豬飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組仔豬飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加10、30、90 mg/kg RES的試驗飼糧。試驗期共21 d，于試驗第15天清晨給除CON組以外的仔豬腹腔注射10 mg/kg BW劑量的diquat溶液，建立氧化應(yīng)激模型，CON組腹腔注射等量滅菌生理鹽水為參照。成功建立氧化應(yīng)激模型后再繼續(xù)飼喂7 d，于第22天清晨屠宰，采集肝臟樣品。

1.3 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)仔豬營養(yǎng)需要進行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。按照試驗設(shè)計，在基礎(chǔ)飼糧中添加相應(yīng)劑量的RES配制試驗飼糧。

本試驗在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所畜牧基地開展，動物飼養(yǎng)試驗開展期間所有仔豬自由采食和飲水，每天飼喂3次。另外，保證仔豬于良好的環(huán)境中飼養(yǎng)，每天打掃圈舍、通風換氣并定期進行消毒，消毒免疫程序按照豬場常規(guī)方法進行。

1.4 樣品采集與處理

所有仔豬禁食12 h后，于試驗第22天清晨將所有仔豬頸靜脈放血處死。仔豬屠宰后，迅速分離出肝臟，在肝臟同一葉上固定位置取肝臟樣本裝入凍存管中，編號，放入液氮速凍，采樣結(jié)束后于-80 ℃冰箱保存。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.5 測定指標與方法

1.5.1 肝臟抗氧化酶、細胞因子mRNA表達測定

采用實時熒光定量PCR檢測肝臟SOD1、SOD2、谷胱甘肽過氧化物酶-1(GPX-1)、過氧化氫酶(CAT)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-10(IL-10)、Keap1、Nrf2、NQO1 mRNA相對表達量。引物設(shè)計是從NCBI下載已登錄的GAPDH、SOD1、SOD2、GPX-1、CAT、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、Keap1、Nrf2、NQO1的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列參見表2。由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成引物。

使用RNAiso Plus試劑盒提取肝臟組織總RNA，利用超微量分光光度計測定儀檢測RNA純度，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性，之后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。使用HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR試劑盒合成cDNA，并于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴增基因，進行實時熒光定量PCR檢測，每個樣品做3個重復(fù)。反應(yīng)體系(10 μL)：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，Primer 0.4 μL，Template DNA/cDNA 0.6 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(40個循環(huán))；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.5.2 肝臟Nrf2信號通路蛋白表達測定

首先使用勻漿機從40 mg左右的冷凍肝臟中提取蛋白質(zhì)，含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液作為勻漿介質(zhì)。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)將每組蛋白稀釋定量，確保每組的蛋白濃度在同一水平。將變性后的蛋白以30 μg總蛋白的上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用封閉緩沖液(5%脫脂奶粉)封閉膜1 h，然后將膜在含0.5‰ Tween 20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)中洗滌3次，并與一抗孵育1.5 h或過夜。接著再次將膜用TBST洗滌3次并與二抗孵育1 h(稀釋度1∶2 000)。用發(fā)光圖像分析儀ChampChemi系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)拍攝照片，并通過Image J軟件進行量化分析。

表2 引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016進行初步整理與統(tǒng)計，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Waller-Duncan多重比較，結(jié)果以平均值±標準差(SD)表示，以P<0.05作為顯著性判斷標準,0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 RES對氧化應(yīng)激仔豬肝臟抗氧化酶mRNA相對表達量的影響

由表3可知，與CON組相比，DIQ組肝臟SOD1、SOD2、GPX-1和CAT的mRNA相對表達量均顯著降低(P<0.05)。與DIQ組相比，RES-10組、RES-30組、RES-90組肝臟SOD1、SOD2、GPX-1和CAT的mRNA相對表達量均顯著上升(P<0.05)，且RES-10組、RES-30組、RES-90組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，3個試驗組間差異同樣不顯著(P>0.05)。

2.2 RES對氧化應(yīng)激仔豬肝臟細胞因子mRNA相對表達量的影響

由表4可知，與CON組相比，DIQ組肝臟IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)，IL-10的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。與DIQ組相比，RES-30和RES-90組肝臟IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對表達量均顯著降低(P<0.05)，其中RES-90組與CON組無顯著差異(P>0.05)。另外，與DIQ組相比，RES-30組和RES-90組肝臟IL-10的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，且RES-90組同樣與CON組無顯著差異(P>0.05)。

表3 RES對氧化應(yīng)激仔豬肝臟抗氧化酶mRNA相對表達量的影響

表4 RES對氧化應(yīng)激仔豬肝臟細胞因子mRNA相對表達量的影響

2.3 RES對氧化應(yīng)激仔豬肝臟Nrf2信號通路相關(guān)mRNA相對表達量的影響

由表5可知，與CON組相比，DIQ組中肝臟Nrf2、NQO1的mRNA相對表達量均顯著降低(P<0.05)，Keap1的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。與DIQ組相比，RES-10組、RES-30組和RES-90組肝臟Nrf2、NQO1的mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)，且RES-90組與CON組無顯著差異(P>0.05)。另外，RES-30組和RES-90組肝臟Keap1的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，且RES-90組與CON組無顯著差異(P>0.05)。

表5 RES對氧化應(yīng)激仔豬肝臟Keap1、Nrf2、NQO1 mRNA相對表達量的影響

2.4 RES對氧化應(yīng)激仔豬肝臟Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達量的影響

由圖1-A可知，與CON組相比，DIQ組中Keap1蛋白表達量有上升的趨勢(P=0.075)；圖1-B顯示，Nrf2蛋白表達量各組間差異不顯著(P>0.05)。圖1-C中NQO1蛋白表達量顯著下降(P<0.05)。與DIQ組相比，RES-90組Keap1蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；Nrf2、NQO1蛋白表達量在RES-10組、RES-30組、RES-90組間差異均不顯著(P>0.05)。

Keap1: Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1 Kelch-like ECH-associated protein 1; Nrf2: 核因子E2相關(guān)因子2 nuclear factor erythroid 2 related factor 2; NQO1: NADPH醌氧化還原酶1 NADPH 1 quinone oxidoreductase 1; GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫 glyceraldehyde-3-phosphate 。

3 討 論

diquat是一種聯(lián)吡啶除草劑，可以利用分子氧生成超氧陰離子自由基，暴露于diquat攻擊下的家畜體內(nèi)活性氧快速產(chǎn)生，導(dǎo)致組織發(fā)生氧化損傷，其中肝臟已被證明是diquat誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的主要靶器官[23]。本試驗通過對斷奶仔豬抗氧化酶基因、細胞因子基因以及Nrf2信號通路相關(guān)蛋白等指標的測定，明確了腹腔注射diquat對斷奶仔豬肝臟具有氧化損傷的作用，成功建立了氧化應(yīng)激模型。

肝臟可通過多種抗氧化機制應(yīng)對機體氧化應(yīng)激，其中CAT、SOD、GPX-1等抗氧化酶，可以及時清除自由基，保護機體免受氧化損傷。由于肝臟抗氧化系統(tǒng)通常在動物幼齡期不成熟，仔豬難以應(yīng)對較嚴重的氧化應(yīng)激[1]。因此，補充抗氧化劑成為一種可行的治療策略，以使肝臟氧化損傷和疾病的風險最小化[24]。Cheng等[8]研究表明，在宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)仔豬飼糧中添加80 mg/kg RES顯著降低了丙二醛(MDA)含量，提高了過氧化氫酶(CAT)以及谷胱甘肽(GSH)活性，同時顯著上調(diào)了肝臟GPX-1的mRNA表達水平。Zhuang等[16]研究表明，在暴露于500 μmol/L 過氧化氫(H2O2)應(yīng)激豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)中分別添加0、20、50 μmol/L的RES，其SOD1、CAT、GPX-1的mRNA相對表達量均顯著上調(diào)，其中以50 μmol/L RES效果最佳。魏思宇等[25]研究結(jié)果表明，在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加300 mg/kg RES上調(diào)了仔豬胰腺CAT、SOD1、GSH-Px的mRNA相對表達量。本試驗結(jié)果表明，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的仔豬飼糧中分別添加10、30、90 mg/kg RES，對其肝臟SOD1、SOD2、CAT、GPX-1的mRNA相對表達量均顯著上調(diào)。這與前人研究結(jié)果相似，即適量的RES增強了氧化應(yīng)激仔豬肝臟抗氧化物酶基因表達水平，從而增強抗氧化能力。

諸多研究表明，細胞因子在仔豬氧化應(yīng)激過程中起著重要作用，其中包括TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10等，核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)則是調(diào)控此類細胞因子基因表達的關(guān)鍵信號通路之一，其激活增強了促炎基因的表達[26]。且已有研究表明，RES可通過促進磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信號通路和抑制NF-κB信號通路抑制細胞因子的過度產(chǎn)生而減輕炎癥反應(yīng)[27]。Zhao等[28]研究表明，在腸缺血再灌注損傷誘導(dǎo)(IIR)處理下，經(jīng)15 mg/kg RES預(yù)處理5 d的大鼠，其腸黏膜TNF-α、IL-1β、IL-18含量顯著下降；進一步評估NOD樣受體蛋白3(NLRP3)、半胱天冬酶-1 p20(caspase-1 p20)、白細胞介素-1β p17(IL-1β p17)和白細胞介素-18(IL-18)的腸黏膜蛋白表達量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RES預(yù)處理的大鼠其細胞因子蛋白表達量均顯著下降。Yu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在腹腔注射四氯化碳溶液(CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的條件下，在CCl4溶液中添加400 mg/kg RES治療顯著上調(diào)內(nèi)源性IL-10基因的表達，并促進巨噬細胞重編程為抗炎白細胞介素-4表型。而Toll樣受體激活的巨噬細胞產(chǎn)生的IL-10是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與炎癥消退過程密不可分[30]。本研究結(jié)果表明，在氧化應(yīng)激仔豬飼糧中分別添加30及90 mg/kg RES顯著下調(diào)了IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相對表達量，且以90 mg/kg RES添加量組下調(diào)效果最為顯著；同時，RES-30組、RES-90組IL-10的mRNA相對表達量顯著上調(diào)。此結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，即RES可通過抑制細胞因子表達，緩解肝臟炎癥反應(yīng)。

為了進一步探究RES對diquat誘導(dǎo)仔豬肝臟氧化應(yīng)激的保護機制，本試驗對仔豬肝臟Nrf2信號通路相關(guān)mRNA相對表達量及蛋白表達量進行了測定。Keap1/Nrf2/ARE信號通路是細胞內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)答機制之一，RES作為Nrf2信號通路的激活劑，被報道具有促進Nrf2轉(zhuǎn)錄活性的功能[17]。大鼠體內(nèi)試驗表明，RES顯著增加了其腎臟Nrf2及其抗氧化反應(yīng)原件HO-1、NQO1、SOD1、SOD2的蛋白表達量，同時降低了Keap1的蛋白表達量[17]。Zhang等[31]研究結(jié)果顯示，RES增加了氧化應(yīng)激仔豬肝臟Nrf2蛋白表達量，同時上調(diào)了其HO-1的mRNA相對表達量。本試驗研究結(jié)果表明，在仔豬氧化應(yīng)激狀態(tài)下，RES-30組與RES-90組仔豬肝臟Keap1的mRNA相對表達量均顯著下調(diào)，其中以RES-90組效果最為顯著，RES-30組和RES-90組仔豬肝臟Keap1蛋白表達量顯著下降，同樣以RES-90組效果最優(yōu)；同時，隨著RES添加劑量的增加，Nrf2的mRNA相對表達量顯著上調(diào)，且RES-90組與CON組無顯著差異，Nrf2蛋白表達量相比DIQ組有上升的趨勢；另外，在仔豬氧化應(yīng)激狀態(tài)下，RES-10組、RES-30組、RES-90組NQO1的mRNA相對表達量及蛋白表達量均顯著增加。本試驗表現(xiàn)出與前人相似的結(jié)果，初步證實了RES通過提高Nrf2的mRNA相對表達量及蛋白表達量、減少Keap1的mRNA相對表達量及蛋白表達量，進而促進下游抗氧化相關(guān)基因如NQO1、SOD1、SOD2、CAT及GPX-1的表達，從而達到增強仔豬肝臟抗氧化能力、減輕炎癥的作用。但RES發(fā)揮抗氧化分子機制還需進一步研究探討。

4 結(jié) 論

diquat應(yīng)激可導(dǎo)致斷奶仔豬肝臟抗氧化、抗炎性能顯著降低。飼糧中添加RES可有效提高斷奶仔豬肝臟抗氧化和抗炎能力，且以添加量為90 mg/kg時效果較好。