發(fā)酵文冠果葉替代苜蓿草對肉兔生長性能、免疫功能、肉品質(zhì)及抗氧化功能的影響

張旭暉 孫智遠(yuǎn) 李守科 王佳宏 汪貴斌 曹銀娣 趙祥樹 曹福亮*

(1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210037；2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，句容212400；3.山東沃奇鄉(xiāng)村振興產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，濰坊262100; 4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處，青島266109)

苜蓿是家兔的理想飼料，但其資源有限，價格較高，只能滿足50%的國內(nèi)需求，且依賴進(jìn)口苜蓿[1-2]。隨著我國養(yǎng)兔業(yè)逐步向規(guī)?；较虬l(fā)展，優(yōu)質(zhì)飼料資源短缺和價格過高已成為一個新的問題。我國木本植物飼料資源豐富，開發(fā)利用潛力很大。近年來，開發(fā)使用非傳統(tǒng)飼料原料(如葉粉)來代替相對昂貴的傳統(tǒng)飼料喂養(yǎng)動物，具有重要意義[2-3]。

文冠果樹屬無患子科，是我國珍貴的經(jīng)濟(jì)作物。文冠果既是健康的食材，又是傳統(tǒng)的民間中藥，能治療多種疾病，如動脈硬化、高脂血癥、多動癥、慢性肝炎、風(fēng)濕、小兒遺尿癥等。文冠果的葉、殼和果柄富含三萜類、黃酮、類黃酮、香豆素、甾醇、木脂素、單萜、酚酸、生物堿、肌醇和皂苷等生物活性成分。文冠果提取物具有抗炎、抗應(yīng)激、清除自由基、抗腫瘤活性和提高智力的功能[4-6]。最近的大鼠試驗研究表明，文冠果殼提取物能調(diào)節(jié)腸道微生物群，改善腸道微環(huán)境[7]。但目前，有關(guān)文冠果葉對動物生長和健康方面的研究還處于空白。

發(fā)酵是處理植物性飼料的一種簡單、廉價和有效的方法，用于延長儲存期，去除抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高生物活性和消化率，進(jìn)而改善營養(yǎng)質(zhì)量[8-9]。近年來，發(fā)酵產(chǎn)物在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越受到重視。發(fā)酵可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)破壞并釋放酚類化合物，從而增強(qiáng)抗氧化活性[10-11]。因此，本研究旨在探討以未發(fā)酵文冠果葉(UXSL)或發(fā)酵文冠果葉(FXSL)替代飼糧中苜蓿草粉對新西蘭大白兔的生長性能、血液常規(guī)參數(shù)、肉品質(zhì)、免疫器官指數(shù)、血清免疫功能及機(jī)體抗氧化功能的影響，以期為文冠果葉作為木本飼料資源應(yīng)用于肉兔生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 文冠果葉發(fā)酵物的制備

文冠果葉片由山東沃奇鄉(xiāng)村振興產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司(山東濰坊)提供。將葉片輕鋪在陰涼處風(fēng)干1周，然后將干燥的葉片在電動研磨機(jī)中研磨并通過40目篩，自封袋密封備用。

本試驗中使用的產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis，NFU-Y-186)和黑曲霉(AspergillusnigerNL-1)來源于南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院微生物與基因工程實驗室保存的菌株(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心菌種庫，ACCC2060、ACCC30005)。文冠果葉發(fā)酵物的制備工藝為：先接入產(chǎn)朊假絲酵母菌，24 h后再接入黑曲霉至文冠果葉、麩皮和豆粕(質(zhì)量比=80∶10∶10)基質(zhì)中，接種量均為10%，其中加入3.0%(NH4)2SO4、2.0%葡萄糖、2.0% KH2PO4、0.5% MgSO4·7H2O，在自然pH，60%含水量，30 ℃溫度下，發(fā)酵72 h獲得文冠果葉發(fā)酵物。自然晾干至含約914 g/kg干物質(zhì)粉碎待用。文冠果葉發(fā)酵前后主要營養(yǎng)成分的變化如表1所示。

表1 文冠果葉發(fā)酵前后主要營養(yǎng)成分的變化

1.2 試驗設(shè)計與試驗飼糧

試驗采用單因素隨機(jī)試驗設(shè)計，選取40日齡已斷奶、體重接近的健康新西蘭大白兔144只，平均體重為(939±12) g，差異不顯著(P>0.05)，隨機(jī)分為3組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)8只(公母各占1/2)。3個組分別為：對照組(基礎(chǔ)飼糧)、UXSL組和FXSL組，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加15%的UXSL和FXSL替代等量的苜蓿草。苜蓿草的主要營養(yǎng)成分為：粗蛋白質(zhì)19.1%、粗纖維22.7%、中性洗滌纖維36.7%、酸性洗滌纖維25.0%。試驗的預(yù)試期7 d，正試期42 d?；A(chǔ)飼糧參照NRC(1980)推薦的兔營養(yǎng)需要量配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.3 飼養(yǎng)管理

所有試驗肉兔均在冬季飼養(yǎng)于同一兔舍，每個重復(fù)中的4只同性別的兔為1個籠位，兔籠長寬高為69 cm×44 cm×52 cm。由專職人員飼喂，每日飼喂3次，時間分別為07:00、12:00和18:00，自由飲水，按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。

1.4 樣品的采集與制備

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每組抽取8只接近平均體重的試驗兔禁食12 h進(jìn)行屠宰采樣。稱重后用抗凝采血管心臟采血，其中一管血液樣品在采血后2 h內(nèi)，使用全自動血液細(xì)胞分析儀(Mindray，BC-5000 Vet，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測定血液常規(guī)參數(shù)，包括紅細(xì)胞參數(shù)、白細(xì)胞參數(shù)等；另一管于低溫3 500 r/min離心15 min制備血清，分裝后置-20 ℃用于測定血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)。隨后對每組的8只肉兔進(jìn)行屠宰，在每只肉兔的背腰最長肌的部位采集肌肉樣品，各取3塊，分別用于后續(xù)測定24和48 h的滴水損失(5 g)、肉色(30 g)、蒸煮損失和嫩度(剪切力)(30 g)。之后分離胸腺、脾臟和圓小囊，去除附著組織并擦凈血液稱重，按照公式計算免疫器官指數(shù)：

免疫器官指數(shù)(g/kg)=[免疫器官鮮重(g)/
宰前活重(kg)]×100。

留取肝臟制備10%組織勻漿上清液，分裝后置-20 ℃用于肝臟抗氧化指標(biāo)測定。

表2 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 生長性能測定

在試驗開始和結(jié)束時分別對兔子進(jìn)行空腹稱重。每周同一時間統(tǒng)計飼喂量，以重復(fù)為單位計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。試驗期間每天認(rèn)真觀察，記錄每個重復(fù)兔腹瀉情況，根據(jù)腹瀉兔耳標(biāo)號進(jìn)行持續(xù)天數(shù)統(tǒng)計，以便進(jìn)行腹瀉率的計算。同時以重復(fù)為單位記錄死亡兔的只數(shù)。腹瀉率和死亡率的計算公式如下：

腹瀉率(%)=100×兔腹瀉只數(shù)×兔腹瀉
持續(xù)天數(shù)/(總只數(shù)×試驗天數(shù))；
死亡率(%)=100×試驗期間
兔死亡只數(shù)/初始兔只數(shù)。

1.5.2 血清免疫指標(biāo)測定

使用Biotek Synergy 2多功能微孔板檢測儀(美國)測定血清樣品中的免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)說明書進(jìn)行操作。

1.5.3 血清和肝臟抗氧化指標(biāo)測定

血清和肝臟組織勻漿中總抗氧化能力(T-AOC)測定采用Fe3+還原法，總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用黃嘌呤氧化法測定，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用5,5’-二硫?qū)ο趸郊姿?DTNB)法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定。以上測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒。

1.5.4 肉品質(zhì)指標(biāo)測定

屠宰后剝離兩側(cè)全部背腰最長肌，迅速進(jìn)行肉品質(zhì)各項指標(biāo)的測定。

pH測定：分別于屠宰后45 min和24 h時，將便攜式數(shù)顯pH計的電極頭完全插入到左側(cè)第4腰椎處肌肉中，取上、中、下3個點測量pH，取平均值。

滴水損失：分別取肌肉樣品約10 g，記為W1，懸空掛于一次性塑料杯中(避免肉塊貼壁)，封口掛于4 ℃冰箱內(nèi)，24 h后，拭去表面水分，稱重記為W2，24 h滴水損失率(%)=100×(W1-W2)/W1。稱量后的肉樣重新懸空掛回4 ℃冰箱，24 h后再取出，揩干表層水分，肉樣稱重記為W3，48 h滴水損失率(%)=100×(W1-W3)/W1。

蒸煮損失：將約30 g新鮮肉樣稱重記為M1，置于自封袋中密封，袋口向上放入80 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)煮30 min，取出肉樣，冷卻30 min后用紙巾將表面水分擦干，肉樣稱重記為M2，蒸煮損失(%)=100×(M1-M2)/M1。

剪切力(嫩度)：將每塊測定完蒸煮損失的肉樣沿肌肉纖維方向修成長寬厚1.5 cm×1.0 cm×0.5 cm的長條3～5塊，用Salter剪切力儀(G2R Elec. Mf g. Co.)測定剪切力3～5次，取平均值。

肉色評定：在宰后的30 min內(nèi)，從肉樣的上、中、下3個部分各取1個點用色差儀(CHROMA METER CR-400, KONZCAminOLTA SENSING, INC,日本)測定亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值，記錄后取平均值。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗，差異顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 FXSL對肉兔生長性能的影響

由表3可知，與對照組和UXSL組相比，F(xiàn)XSL組肉兔的末重(FBW)和ADG顯著提高(P<0.05)，而F/G顯著降低(P<0.05)。FXSL組肉兔的腹瀉率和死亡率與UXSL組相比雖無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但有明顯下降趨勢。

2.2 FXSL對肉兔血常規(guī)參數(shù)的影響

由表4可知，與對照組相比，F(xiàn)XSL組肉兔的白細(xì)胞計數(shù)(WBC)顯著增加(P<0.05)，其他各項血液常規(guī)參數(shù)在各組間均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 FXSL對肉兔免疫器官指數(shù)的影響

由表5可知，與對照組和UXSL組相比，F(xiàn)XSL組肉兔的胸腺指數(shù)和圓小囊指數(shù)有增加趨勢，但無顯著差異(P>0.05)，F(xiàn)XSL組的脾臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)。

2.4 FXSL對肉兔血清免疫指標(biāo)的影響

由表6可知，肉兔血清IgG和IgA的含量在FXSL組最高，且顯著高于對照組和UXSL組(P<0.05)；血清IgM含量在各組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 FXSL對肉兔生長性能的影響

表4 FXSL對肉兔血常規(guī)參數(shù)的影響

表5 FXSL對肉兔免疫器官指數(shù)的影響

表6 FXSL對肉兔血清免疫指標(biāo)的影響

2.5 FXSL對肉兔血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表7可知，與對照組和UXSL組相比，飼糧中添加FXSL顯著增加了肉兔血清T-SOD和GSH-Px的活性及肝臟GSH-Px的活性(P<0.05)；同時，與對照組相比，F(xiàn)XSL組肉兔的血清和肝臟中的MDA含量顯著降低(P<0.05)，與UXSL組相比，F(xiàn)XSL組的肝臟MDA含量也顯著降低(P<0.05)。飼糧處理對血清T-AOC及血清和肝臟的T-AOC及T-SOD未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表7 FXSL對肉兔血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

Table 7 Effects of FXSL on serum and hepatic antioxidant indexes of rabbits

項目 Items組別 Groups對照 Control UXSLFXSLSEMP值P-value血清 Serum總抗氧化能力 T-AOC/(U/mL)16.5516.6216.761.410.055總超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mL)419.64b428.74b468.44a38.450.040谷胱甘肽過氧化物酶 GSH-Px/(U/mL)619.51b635.02b795.03a52.230.043丙二醛 MDA/(nmol/mL)7.84a6.60ab4.51b0.490.038肝臟 Liver總抗氧化能力 T-AOC/(U/mg prot)8.34 8.539.28 0.980.060總超氧化物歧化酶 T-SOD/(U/mg prot)11.8312.0712.801.660.062谷胱甘肽過氧化物酶 GSH-Px/(U/mg prot)37.31b40.53b47.38a2.540.042丙二醛 MDA/(nmol/mg prot)25.11a22.80a17.77b2.050.041

2.6 FXSL對肉兔肉品質(zhì)的影響

由表8可知，與對照組相比，飼糧中添加FXSL能夠顯著提高兔肉pH24 h(P<0.05)，顯著降低24和48h滴水損失及剪切力(P<0.05)，其中，48 h滴水損失在UXSL組和FXSL組間也有顯著差異(P<0.05)；FXSL組肉兔的蒸煮損失最低，但與各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表8 FXSL對肉兔胸肌肉品質(zhì)的影響

3 討 論

3.1 FXSL對肉兔生長性能的影響

植物葉資源經(jīng)過微生物發(fā)酵處理，產(chǎn)物中富含益生菌、各種酶、維生素、有機(jī)酸、氨基酸、肽、維生素和促生長因子[12-13]，同時，發(fā)酵處理有助于宿主消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)，從而改善動物生長性能[13-14]。本試驗中，與對照組和UXSL組相比，F(xiàn)XSL組肉兔的FBW、ADG和F/G有顯著改善，原因可能是：1)FXSL中的粗蛋白質(zhì)含量從19.25%提高到了34.06%；2)肉兔腸道的健康狀態(tài)和飼料利用率顯著提高；3)黃酮類物質(zhì)弱雌激素樣的作用，可能起到生長激素的作用[15]。前人研究表明，釀酒酵母、黑曲霉和芽孢桿菌等益生菌可在固態(tài)發(fā)酵植物副產(chǎn)物中產(chǎn)生包括酚酸、單寧酸在內(nèi)的多酚類化合物，從而顯著提高發(fā)酵物料的功能價值[16]。例如，用熱帶假絲酵母或米曲霉發(fā)酵中草藥，能產(chǎn)生多種水解酶(如α-淀粉酶、纖維素酶、麥芽糖酶、蛋白酶等)，改善幼齡動物的消化系統(tǒng)和健康狀況[17]。此外，銀杏葉-杜仲葉[18]、辣木葉[19]等發(fā)酵植物作為添加劑可以有效提高動物的生長性能和飼料效率。

3.2 FXSL對肉兔血常規(guī)參數(shù)的影響

血常規(guī)檢驗通常被用作衡量動物營養(yǎng)、生理和免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)。其中，白細(xì)胞具有吞噬異物、抗體的產(chǎn)生、抵御病原體入侵等能力，是機(jī)體免疫功能的生物標(biāo)志物[20]。本試驗中，所有血液學(xué)參數(shù)的值都在Flecknell[21]報道的兔子的正常范圍內(nèi)，且白細(xì)胞計數(shù)值在FXSL組最高，顯著高于對照組和XSL組，表明FXSL增強(qiáng)了吞噬細(xì)胞參與抵抗感染的功能[22]。這也支持了植物源性飼料添加劑能夠刺激動物免疫活性的研究結(jié)果[23]。

3.3 FXSL對肉兔免疫功能的影響

免疫器官的發(fā)育狀況決定了機(jī)體的免疫狀態(tài)，免疫器官指數(shù)能在一定程度上反映機(jī)體的免疫反應(yīng)水平。在健康范圍內(nèi)，免疫器官指數(shù)增大是免疫功能和抗病能力增強(qiáng)的表現(xiàn)[24-25]。脾臟、胸腺、圓小囊是兔的重要免疫器官。本試驗中，F(xiàn)XSL組的脾臟指數(shù)有顯著提高，同時，胸腺指數(shù)和圓小囊指數(shù)也有提高趨勢，說明FXSL能促進(jìn)肉兔脾臟、胸腺和圓小囊發(fā)育。其原因可能是，F(xiàn)XSL中多糖含量較高，植物多糖能夠直接激活巨噬細(xì)胞的免疫功能、T和B淋巴細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和補(bǔ)體活性[26]；此外，F(xiàn)XSL中的總多糖等活性成分可能與免疫細(xì)胞表面高親和力的受體結(jié)合而促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖分化，增加免疫器官內(nèi)淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞的數(shù)量，從而促進(jìn)兔免疫器官發(fā)育，提高機(jī)體免疫能力[27]。

眾所周知，黃酮類和萜烯類的活性化合物具有免疫增強(qiáng)活性，包括促進(jìn)淋巴細(xì)胞合成、細(xì)胞因子釋放、免疫球蛋白水平和吞噬活性[28]。血清抗體水平是體液免疫的標(biāo)志性指標(biāo)。實際上，IgG、IgA和IgM是所有哺乳動物體液免疫的關(guān)鍵組成部分，是保護(hù)機(jī)體免受病原微生物侵害的主要血清免疫球蛋白[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XSL組肉兔血清IgA和IgG的含量顯著高于對照組和UXSL組。前人相似研究表明，發(fā)酵銀杏葉可提高豬血清IgG、IgA和IgM含量，這種有益作用可能是源于其對胃腸道中病原微生物生長的影響[17]。

3.4 FXSL對肉兔機(jī)體抗氧化功能的影響

在正常生理條件下，動物細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧(ROS)會對生物分子(包括蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì))造成損傷，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)羰基化，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[30]。同時，機(jī)體的酶性抗氧化防御體系(主要包括SOD、GSH-Px和CAT)在抵御脂質(zhì)過氧化損傷過程中起著重要作用[11]，可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基的侵害，抗氧化酶的活性反映了機(jī)體清除活性氧的能力[17]。另外，MDA是脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物，具有高度的細(xì)胞毒性，會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，是反映組織過氧化損傷的重要指標(biāo)[31]。本試驗中，飼糧中添加FXSL顯著增加了肉兔血清T-SOD和GSH-Px活性，及肝臟GSH-Px活性，同時，血清和肝臟中的MDA含量也有顯著降低；與對照組相比，XSL組的T-SOD和GSH-Px的活性及MDA含量均有一定程度的改善。這些結(jié)果表明，兔飼糧中添加文冠果葉有利于保護(hù)組織免受脂質(zhì)過氧化。原因可能是文冠果葉中含有豐富的類黃酮、多酚類和多糖，這些活性物質(zhì)能夠通過減少酶和非酶抗氧化系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)來減少細(xì)胞抗氧化劑的消耗[32]。由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的微生物酶分解植物細(xì)胞壁并釋放具有抗氧化特性的酚類化合物和黃酮類化合物[33]；加之黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶將酚苷水解成苷元形式，因其親脂性有助于通過細(xì)胞膜的磷脂雙層，很容易被腸上皮細(xì)胞吸收[11,33]，導(dǎo)致FXSL的抗氧化活性的能力的增強(qiáng)。此外，發(fā)酵銀杏葉-杜仲葉[17,34]、松針葉[32]、構(gòu)樹葉[35]等作為添加劑飼喂畜禽可以有效提高其抗氧化功能。

3.5 FXSL對肉兔肉品質(zhì)的影響

宰后肌肉pH影響肉的嫩度、肉色、系水力等[36]，也是影響肉加工工藝和食用品質(zhì)的主要參數(shù)。屠宰后肉的pH快速下降可致蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致顏色蒼白和系水力差[12]。本試驗結(jié)果表明，肉兔飼糧添加FXSL能有效地維持肉的較高pH。原因可能是FXSL的抗氧化作用，能夠通過降低糖原的酵解，減少肌肉中乳酸的產(chǎn)生，從而使肌肉pH下降緩慢[27]。

肉中水分的流失會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的損失，肉變得干、硬，風(fēng)味和品質(zhì)變差[34]。系水力在一定程度上反映肌肉的保水性能，一般用滴水損失率和蒸煮損失率來衡量，剪切力和系水力則體現(xiàn)肉的嫩度[37]。pH與系水力和嫩度密切相關(guān)[38]。本試驗數(shù)據(jù)表明，系水力和嫩度的變化趨勢與pH是一致的，而肌肉系水力與其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)，完整性越好，系水力越高。這可能是由于FXSL的抗氧化作用，通過阻止肌細(xì)胞膜上磷脂的氧化，節(jié)約了內(nèi)源的抗氧化劑，并維持細(xì)胞膜的完整性，減少了肌漿液的外滲[39]，從而降低了肌肉的滴水損失[27,34]。

4 結(jié) 論

① 肉兔飼糧中添加文冠果葉，并未對肉兔產(chǎn)生有害影響。

② 添加15% FXSL能夠明顯提高肉兔的生長性能，并改善肌肉品質(zhì)，并能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能及抗氧化能力。

③ 在本試驗條件下，肉兔飼糧中添加15% UXSL或FXSL替代等量苜蓿草，是完全可行的。