納米氧化鋅對育肥牛生產(chǎn)性能、血清指標和背最長肌肌內(nèi)脂肪沉積相關基因表達的影響

鐘奇祺 黎力之 幸清鳳 郭冬生 張海波* 關瑋琨*

(1.宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，江西省高等學校硒農(nóng)業(yè)工程技術研究中心，宜春市功能農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，宜春336000；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院動物醫(yī)學院，武漢430000)

納米氧化鋅是通過化學或者物理的方法使氧化鋅顆粒直徑達到1～100 nm，由于其量子效應、物質(zhì)的局域性、巨大表面積及界面效應，其與上皮細胞接觸位點及與腸絨毛接觸面積也隨之增加，有效增強小腸對納米氧化鋅吸收利用能力[1]。飼糧添加凹凸棒土負載納米氧化鋅可提高斷奶仔豬空腸和回腸微生物α多樣性，顯著增加回腸擬桿菌屬(Bacteroides)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等益生菌的豐度，改善腸道環(huán)境[2]。李洪民等[3]研究證實，斷乳仔豬飼糧中添加凹土納米氧化鋅后，其抗氧化酶活性、抗炎因子含量升高，即仔豬抗氧化能力和免疫功能得到強化。Ramiah等[4]研究表明，在熱應激肉雞飼糧添加40和60 mg/kg納米氧化鋅，肉雞血清中皮質(zhì)醇含量下降，緩解其應激反應的同時肌肉丙二醛含量下降，抗氧化能力增強，肉品質(zhì)也得到改善。上述研究表明，納米氧化鋅不但具有改善機體腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高腸道黏膜免疫功能的作用，而且具有改善肉品質(zhì)的功能。

肌內(nèi)脂肪(IMF)是衡量牛肉品質(zhì)的關鍵指標之一，其對肉的風味、多汁性及大理石花紋形成存在至關重要的作用[5]。動物IMF沉積是脂肪合成與脂肪分解動態(tài)博弈的結(jié)果，受到過氧化物酶增殖激活受體γ(PPARγ)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBP-1)、脂肪酸合成酶(FAS)等脂肪合成基因，以及脂蛋白脂肪酶(LPL)、激素敏感脂肪酶(HSL)和肉堿轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)等脂肪分解基因的共同影響[6]。目前關于納米氧化鋅的研究多集中于改善單胃動物腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高腸道黏膜免疫功能等方面[2-3]，而鮮見關于納米氧化鋅影響育肥牛背最長肌IMF沉積相關基因表達的報道。因此，本試驗旨在探究納米氧化鋅對育肥牛生長性能、屠宰性能、血清指標及背最長肌IMF沉積相關基因表達的影響，以期為在育肥牛飼糧中合理添加納米氧化鋅提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、試驗設計和飼養(yǎng)管理

選擇健康無病、年齡(12～15月齡)相近和體重相近的西雜閹公牛(西門塔爾?！帘镜攸S牛)16頭，隨機分2組，每組8個重復，每個重復為1頭牛。對照組飼喂基礎飼糧(不添加鋅)，納米氧化鋅組在基礎飼糧的基礎上添加80 mg/kg鋅(納米氧化鋅形式)，該添加量在反芻動物鋅需要量的最高限量(120 mg/kg)以內(nèi)，符合中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2625號規(guī)定《飼料添加劑安全使用規(guī)范》。試驗期為60 d。參考我國《肉牛飼養(yǎng)標準》(NY/T 815—2004)[7]中400 kg體重、日增重1 kg肉牛營養(yǎng)推薦值設計基礎飼糧配方，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。每天清潔欄舍，保持欄內(nèi)衛(wèi)生，日常管理、消毒與防疫按照常規(guī)程序進行。每頭試驗牛單欄拴養(yǎng)飼喂，喂料時間為08:00和16:00，自由采食和飲水。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

1.2 樣品采集與指標測定

1.2.1 生長性能和屠宰性能測定

記錄試驗開始和試驗終末測定全部試驗牛體重，根據(jù)測定的體重計算出每組試驗牛的平均日增重(ADG)，ADG=(末重-初重)/試驗天數(shù)。試驗期間記錄每頭試驗牛每天的精料、粗料實際飼喂量和剩余量，并收集剩余飼糧于-20 ℃低溫保存，每15 d測定1次投入飼糧和剩余飼糧中干物質(zhì)含量，用于試驗期內(nèi)平均日采食量(ADFI)的測定。根據(jù)ADFI和ADG計算出料重比(F/G)，F(xiàn)/G=ADFI/ADG。試驗結(jié)束時測定試驗牛體重，選擇每組中與平均體重接近的5頭牛進行屠宰，參照周光宏等[8]的方法測定胴體重、凈肉重、屠宰率、胴體產(chǎn)肉率和背膘厚度。

1.2.2 血清生化指標和激素測定

于試驗結(jié)束時分別采集5頭肉牛的頸靜脈血10 mL，37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心15 min，取血清-20 ℃凍存待測。采用南京建成生物工程研究所試劑盒用Hitachi 7020全自動生化分析儀(Hitachi公司，日本)測定血清總膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、游離脂肪酸含量。血清瘦素、胰島素和胰島樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，參照試劑盒說明書進行測定。

1.2.3 背最長肌IMF含量和脂肪代謝關鍵酶活性測定

每組選擇接近組內(nèi)平均體重的5頭牛屠宰，采集牛第12～13肋骨背最長肌樣品，于-20 ℃保存，用以IMF含量和脂肪代謝關鍵酶活性測定。采用索氏脂肪抽提法測定背最長肌IMF含量。脂肪代謝關鍵酶(FAS、ACC、HSL、CPT-1和LPL)活性測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，參照試劑盒說明書進行測定。

1.2.4 背最長肌IMF沉積相關基因表達分析

采集試驗屠宰牛背最長肌肌肉樣品，立即放入液氮罐凍存，隨即保存于-80 ℃超低溫冰箱中。采用Trizol法提取背最長肌樣品總RNA，通過Nano Drop 2000分光光度計檢測RNA濃度與純度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考Zhang等[9]和Livak等[10]的方法合成β-肌動蛋白、FAS、ACC、HSL、CPT-1、SREBP-1和PPARγ基因的特定引物序列，以β-肌動蛋白為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法定量計算目的基因表達量。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，0.05≤P<0.10表示有差異趨勢，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 生長性能和屠宰性能

納米氧化鋅對育肥牛生長性能和屠宰性能的影響見表2。與對照組相比，添加納米氧化鋅對初重、末重、ADG、ADFI、宰前活重、胴體重、凈肉重、屠宰率、胴體產(chǎn)肉率和背膘厚度未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，但顯著提高了ADG(P<0.05)，顯著降低了F/G(P<0.05)。

表2 納米氧化鋅對育肥牛生長性能和屠宰性能的影響

2.2 血清生化指標和激素含量

納米氧化鋅對育肥牛血清生化指標和激素含量的影響見表3。與對照組相比，添加納米氧化鋅極顯著提高了血清游離脂肪酸、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖和IGF-Ⅰ含量(P<0.01)，顯著提高了胰島素含量(P<0.05)，極顯著降低了葡萄糖/胰島素比值(P<0.01)，對瘦素含量無顯著影響(P>0.05)。

表3 納米氧化鋅對育肥牛血清生化指標和激素含量的影響

2.3 背最長肌IMF含量和脂肪代謝關鍵酶活性

納米氧化鋅對育肥牛背最長肌IMF含量和脂肪代謝關鍵酶活性的影響見表4。與對照組相比，添加納米氧化鋅顯著提高了背最長肌IMF含量和ACC活性(P<0.05)，極顯著降低了HSL活性(P<0.01)，顯著降低了CPT-1和LPL活性(P<0.05)。

表4 納米氧化鋅對育肥牛背最長肌IMF含量及脂肪代謝關鍵酶活性的影響

2.4 背最長肌IMF沉積相關基因表達

納米氧化鋅對育肥牛背最長肌IMF沉積相關基因表達的影響見圖1。與對照組相比，添加納米氧化鋅顯著提高了育肥牛背最長肌SREBP-1、PPARγ、ACC和FAS基因表達量(P<0.05)，顯著降低了HSL和CPT-1基因表達量(P<0.05)。

3 討 論

3.1 納米氧化鋅對育肥牛生長性能和屠宰性能的影響

在本試驗中，飼糧添加納米氧化鋅后，育肥牛ADG升高，與Xia等[11]的研究結(jié)果不同。Xia等[11]研究表明，斷奶仔豬飼糧分別添加600 mg/kg納米氧化鋅和3 000 mg/kg氧化鋅后，ADG均未產(chǎn)生顯著變化。不同研究結(jié)果的差異可能原因有二：一是試驗動物的體況差異，仔豬早期斷奶仍處于營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收率低，腹瀉等疾病頻發(fā)的狀態(tài)，體況更佳的育肥牛ADG呈現(xiàn)上升水平；二是試驗動物的主要消化吸收方式不同，納米氧化鋅對反芻動物瘤胃微生物具有改善作用，直接提高了瘤胃對營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力，同時強化機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運儲備功能，而單胃動物在攝入納米氧化鋅后在胃酸作用下分解為納米顆粒和Zn2+，經(jīng)腸絨毛進入上皮細胞后間接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。另外，本試驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)飼糧中添加納米氧化鋅后育肥牛的F/G降低，而對末重、ADFI和屠宰性能(胴體重、凈肉重、屠宰率、胴體產(chǎn)肉率和背膘厚度)均無顯著影響，這與Sun等[12]和Hussan等[13]的研究結(jié)果類似。Sun等[12]研究表明，斷奶仔豬飼糧添加納米氧化鋅28 d后，仔豬F/G降低，且末重和ADFI均無顯著變化。Hussan等[13]試驗表明，在肉雞飼糧分別添加2.5、5.0、10.0和20.0 mg/kg納米氧化鋅后，其飼糧轉(zhuǎn)化率顯著提高，而胴體參數(shù)(屠宰率、產(chǎn)肉率及腹脂率等)均未產(chǎn)生顯著變化。這可能是因為飼糧添加納米氧化鋅在不影響動物采食量的基礎上，增強胃腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力。綜上所述，達到同等屠宰水平時，飼糧添加納米氧化鋅提高育肥牛的ADG，同時降低其F/G，說明納米氧化鋅能夠提高飼糧轉(zhuǎn)化效率，改善動物生長性能。

SREBP-1：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1 sterol regulator element binding protein-1；PPARγ:過氧化物酶增殖激活受體γ proliferator-activated receptor gamma；FAS：脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase；ACC：乙酰輔酶A羧化酶 acetyl coenzyme A carboxylase；HSL:激素敏感脂肪酶 hormone sensitive lipase；CPT-1：肉堿轉(zhuǎn)移酶-1 carnitine transferase-1。

3.2 納米氧化鋅對育肥牛血清指標的影響

血液(清)游離脂肪酸、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的含量可直接反映機體脂肪代謝的活躍程度，在一定范圍內(nèi)上述數(shù)值越大即脂肪合成活動愈發(fā)頻繁[14]。本試驗中，添加納米氧化鋅后提高育肥牛血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖含量。Fathi等[15]試驗表明，肉雞飼糧添加20和40 mg/kg納米氧化鋅后，血清總膽固醇和高密度脂蛋白含量顯著上升，甘油三酯含量呈上升趨勢；毛俊舟等[16]研究顯示，斷乳仔豬飼糧添加1 000 mg/kg凹土納米氧化鋅后，血清總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量均未產(chǎn)生顯著影響。上述研究與本試驗產(chǎn)生差異的原因可能是由于凹土本身對血液總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白含量無影響，納米氧化鋅分解產(chǎn)生Zn2+形成脂代謝酶類活性中心，促使高密度脂蛋白和低密度脂蛋白轉(zhuǎn)運活躍，增強膽固醇合成酶與甘油三酯合成酶的活性。

胰島素是調(diào)節(jié)糖脂代謝的重要激素之一，具有促進肝細胞脂肪合成、抑制脂肪組織脂肪酶活性及降低血糖水平的作用[17]。IGF-Ⅰ為生長介素，糖脂代謝過程中可調(diào)控瘦素蛋白表達，抑制糖原、脂肪分解，促使脂肪沉積[18]。在本試驗中，育肥牛飼糧添加納米氧化鋅后，其血清葡萄糖、胰島素和IGF-Ⅰ含量升高，這與Sethy等[19]的研究結(jié)果相一致。這可能是納米氧化鋅改善反芻動物瘤胃微生物群后，提高了飼糧轉(zhuǎn)化效率，使血液中游離脂肪酸含量上升，增強了動物體內(nèi)糖異生活動，升高了血糖水平，刺激胰島素分泌同時降低脂肪動員，促進脂肪沉積。綜上可知，飼糧添加納米氧化鋅對于育肥牛脂質(zhì)代謝具有積極影響。

3.3 納米氧化鋅對育肥牛背最長肌IMF沉積相關基因表達的影響

脂肪酸合成與分解相互平衡制約對IMF沉積具有決定作用，當合成效果強于分解效果時脂肪酸表現(xiàn)累積，此過程受脂肪合成及分解相關酶和基因共同調(diào)節(jié)。在本試驗中，飼糧中添加納米氧化鋅提高了育肥牛背最長肌IMF含量。IMF沉積程度直接表現(xiàn)為肉牛大理石紋形成，肉牛飼糧中添加80 mg/kg鋅(蛋氨酸鋅)提高了大理石紋評分[20]；日本黑牛(閹牛)添加蛋氨酸鋅(400 mg/d，以鋅計)或碳酸鋅(800 mg/d，以鋅計)提高了大理石紋評分[21]；育肥小公牛飼喂60 mg/kg硫酸鋅或60 mg/kg硫酸鋅+240 mg/kg氧化鋅，有提高大理石紋的趨勢[22]。這可能是因為鋅進入瘤胃后改善菌群結(jié)構(gòu)，促進飼糧中脂肪酸的釋放，后經(jīng)消化作用分解為游離脂肪酸，隨血液循環(huán)進入肝臟形成甘油三酯沉積，提高IMF合成速率。

首先，脂肪酸合成酶調(diào)控IMF沉積，合成酶活性越強脂肪酸合成代謝越旺盛，即IMF含量提高。FAS是脂肪酸從頭合成的關鍵酶，結(jié)構(gòu)域分別執(zhí)行縮合、脫水和轉(zhuǎn)移功能，催化脂酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A反應合成棕櫚酸酯[23]。ACC為脂肪酸合成的限速酶，催化乙酰輔酶A縮合為丙二酸單酰輔酶A，轉(zhuǎn)變?yōu)殚L鏈脂肪酸合成的必要原料[24]。本研究結(jié)果顯示，育肥牛飼糧添加納米氧化鋅后背最長肌中ACC活性升高，F(xiàn)AS活性表現(xiàn)出升高跡象，說明脂肪合成能力正在被強化。這可能是因為納米氧化鋅有效成分經(jīng)瘤胃微生物作用后，進入機體激活硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)活性，協(xié)同提高FAS和ACC的活性[25]。因此，我們進一步對脂肪酸合成相關基因的表達情況進行了分析。PPARγ基因正向調(diào)控脂肪酸合成相關基因，發(fā)揮其對脂肪酸合成與釋放的調(diào)控功能[26]。SREBP-1基因密切參與機體脂代謝，是脂肪酸合成基因ACC和FAS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[27]。本研究中，飼糧添加納米氧化鋅上調(diào)了育肥牛脂肪酸合成相關基因(SREBP-1、PPARγ、ACC和FAS)的表達。飼糧中添加2 000 mg/kg包被氧化鋅，可以顯著提高仔豬背最長肌中IMF含量以及ACC、FAS基因表達量[28]。產(chǎn)生本試驗結(jié)果的原因可能是納米氧化鋅中Zn2+由血液循環(huán)進入組織器官后，上調(diào)了SCD基因的表達，導致SREBP-1基因表達的幾率增加，隨后協(xié)同促進PPARγ、ACC和FAS基因的表達[26]。

其次，IMF沉積與脂肪酸分解酶活性密切相關。HSL在脂肪動員中起決定性作用，是脂肪分解的限速酶，可將甘油三酯分解為游離脂肪酸、甘油二酯和甘油[29]。CPT-1為脂酰輔酶A轉(zhuǎn)運進入線粒體的限速酶，轉(zhuǎn)運速率決定了脂肪酸β氧化進程[30]。LPL是IMF形成與沉積的標志性蛋白，主要催化甘油三酯分解為游離脂肪酸和甘油，從而決定脂肪代謝方向[31]。本研究結(jié)果顯示，添加納米氧化鋅于育肥牛飼糧后，背最長肌HSL、CPT-1和LPL活性下降，說明脂肪酸的分解能力下降，且對比納米氧化鋅進入機體后脂肪酸合成與分解酶活性，發(fā)現(xiàn)脂肪酸分解酶被抑制的效果強于合成酶被激動的效果，這可能是育肥牛背最長肌IMF沉積的主要原因。因此，我們進一步對脂肪酸分解相關基因的表達情況進行了分析。本試驗中，飼糧添加納米氧化鋅下調(diào)了脂肪酸分解相關基因(CPT-1和HSL)的表達量。飼糧中添加鋅能夠顯著降低斷奶仔豬背最長肌中HSL和CPT-1等脂肪分解相關基因的表達[32]。其原因可能是納米氧化鋅在胃腸微生物及消化液作用后對動物體產(chǎn)生作用，上調(diào)SCD基因的表達，抑制CPT-1和HSL基因的表達，促進IMF沉積[33]。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加納米氧化鋅(80 mg/kg鋅)可增加育肥牛的ADG，降低F/G，提高生長性能。

② 飼糧中添加納米氧化鋅(80 mg/kg鋅)可提高育肥牛血清中游離脂肪酸、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖和IGF-Ⅰ含量，增加胰島素含量，降低葡萄糖/胰島素比值，加快膽固醇等類脂物質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進脂肪沉積。

③ 飼糧中添加納米氧化鋅(80 mg/kg鋅)可提高育肥牛背最長肌IMF含量，上調(diào)SREBP-1、PPARγ、FAS和ACC基因的表達，下調(diào)HSL和CPT-1基因的表達，提高ACC活性，降低HSL、CPT-1和LPL活性，促進IMF沉積。