柑橘類植物精油的抗菌活性及其作用機制

張 卓 聶德超 趙 琛 李艷玲

(北京農學院動物科學技術學院，北京102206)

在畜牧業(yè)生產體系中，抗生素的濫用不僅會引發(fā)超級細菌的產生，其殘留亦會造成畜產品安全和環(huán)境污染問題[1]。此外，一些抗生素對腸道微生物具有廣譜抗菌活性，不僅能殺死有害菌，同時也能殺死有益菌，因此，長期使用抗生素會降低動物微生物群體的多樣性，增加病原體在腸道內定植的機會[2]。我國農業(yè)農村部規(guī)定，自2020年7月1日起，飼料生產企業(yè)停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料[3]。在這樣的背景下，尋找能夠替代抗生素的綠色飼料添加劑顯得尤為迫切。植物精油由于其具有顯著的抗菌活性，被認為是有潛力的抗生素替代品[4]。柑橘類植物精油(citrus essential oils，CEOs)是生產量最大、商業(yè)化程度最高的植物精油之一，因其成本相對較低，更益于廣泛應用于生產[4]。據報道，CEOs具有選擇性抗菌活性，對有益菌[如乳酸桿菌(Lactobacillus)]的生長動力學影響較小，而對有害菌[如大腸桿菌(Escherichiacoli)]的生長動力學影響較大[5]，利用這一特性應用于動物生產中將具有非常重要的價值。本文著重介紹了CEOs的抗菌活性及其作用機制，為其在畜牧生產中的應用提供理論依據。

1 CEOs簡介

CEOs是一種從柑橘類植物中提取的芳香類混合物，具有天然綠色、無毒無害、無殘留和無刺激等特點[6]，主要包括甜橙精油、葡萄柚精油、檸檬油、佛手柑精油、橘子精油和苦橙葉精油等[7]。CEOs來源于植物的不同部分，如葉、花、果實和果皮等[8]。提取、加工CEOs的常用方法有蒸餾法、溶劑法、壓榨法、超臨界二氧化氮萃取法和分子蒸餾法等，其中蒸餾法是最常用、最潔凈的方法，95%的植物精油均可以用蒸餾法萃取獲得[9]。CEOs具有廣泛的生物活性，包括抗菌、抗氧化和抗炎等[7]；且由于其可以阻礙畜禽舍中霉菌的生長，抑制或殺滅大腸桿菌、沙門氏菌(Salmonella)等有害菌群，提高環(huán)境清潔度和畜禽舒適度[6]，在畜禽上具有良好的應用前景。隨著替抗研究的深入和人們對綠色、無公害、無殘留的天然抗菌劑的要求，對CEOs抗菌生物活性的研究越來越多，尤其是其選擇性抗菌活性的研究引起了本課題組的關注，擬開展更多深入的研究。

2 CEOs的化學組成

CEOs是復雜的碳氫化合物，也是萜類和非萜類的含氧衍生物的混合物，由功能基團組成，包括醛、醇、酮和其他復雜分子，如酯和有機酸[10]。CEOs的組成因品種、季節(jié)和地理位置以及果實成熟期而異[11]，包含多種化合物，如檸檬烯(limonene)、α-蒎烯(α-pinene)、β-蒎烯(β-pinene)、γ-松油烯(γ-terpinene)、檜烯(sabinene)、β-月桂烯(β-myrcene)和芳樟醇(linalool)等(圖1)[7]。通常，每種CEOs都含有20～60種化合物[12]，其中，揮發(fā)性化合物占85%～99%，主要包括單萜類(monoterpene)、倍半萜烯類(sesquiterpenes)和倍半萜類(sesquiterpenoids)[13]。而單萜烯是最主要的揮發(fā)性化合物，主要由2個異戊二烯(C5H8)組成[11]。D-檸檬烯屬于單萜烯，是CEOs的主要活性成分，具體含量因CEOs的種類而異。例如，佛手柑精油中D-檸檬烯含量為32%～45%，檸檬油中D-檸檬烯含量為45%～76%，甜橙油中D-檸檬烯含量為68%～98%[14-15]。通過了解CEOs的化學組成，有利于進一步研究CEOs發(fā)揮生物活性的有效活性成分。

圖1 CEOs的一些重要化合物

3 CEOs的抗菌活性

植物精油以其顯著的廣譜抑菌活性以及殘留毒性小的優(yōu)勢，近年來在抑菌性能上得到了廣泛關注[16]。CEOs及其大部分化合物均具有抗菌活性，例如，D-檸檬烯具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗癌的作用[17-18]，α-蒎烯和β-蒎烯具有抗菌、抗炎和抗氧化的作用[19]，且近年來關于CEOs抗菌活性的研究也越來越多。因此，本文重點介紹了幾種主要的CEOs的抗菌活性。

3.1 幾種主要CEOs的抗菌活性

3.1.1 甜橙精油

甜橙精油是少數有鎮(zhèn)靜作用的精油之一，有著甜橙香味。甜橙精油可抑制多種細菌的生長，包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、鼠傷寒沙門氏菌等(Salmonellatyphimurium)[20-22]；以及幾種真菌，如黃曲霉(Aspergillusflavus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、土曲霉(Aspergillusterreus)等[23-25]。

3.1.2 檸檬油

檸檬油為淡黃色液體，具有柑橘類的香氣，清爽而新鮮。檸檬油對蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)等具有有效的抗菌活性[26]，對黑曲霉(Aspergillusniger)、疣狀青霉(Penicilliumverrucosum)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)等具有抗真菌作用[25]。

3.1.3 葡萄柚精油

葡萄柚性涼，具有清熱、止渴之效。葡萄柚精油氣味清新、香甜，有柑橘的果香味。葡萄柚精油是以新鮮果皮為原料的，采用冷榨方法，出油率在0.5%～1.0%。葡萄柚精油對蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等均有較強的抗菌活性；對黑曲霉、白色念珠菌(Candidaalbicans)等具有較強的抗真菌活性[27-28]。

3.1.4 佛手柑精油

佛手柑精油萃取自佛手柑的果皮，精油呈翠綠色，味道較清新，類似甜橙和檸檬。佛手柑精油抑制多種細菌的生長，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和沙門氏菌等[29]，對漢遜酵母(Hanseniasporaguilliermondii)、脆壁克魯維酵母和白色念珠菌等具有抗真菌活性[29-30]。

3.1.5 橘子精油

橘子精油除了具有獨特的柑橘皮味之外，還帶有少許幽幽花香。橘子精油以其廣譜抗菌和抗真菌作用而聞名。它能抑制幾種細菌的生長，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黃色葡萄球菌[31-32]；抑制幾種真菌的生長，包括意大利青霉(Penicilliumitalicum)、黃曲霉和鏈格孢菌(Alternariaalternata)等[32-33]。

3.2 不同CEOs的抗菌能力比較

不同的CEOs由于其化學成分及結構的差異性，使得它們具有不同的抗菌效果，其抗菌能力與其不同的活性成分及活性成分間的互作有關[1]。金如月[33]研究表明，CEOs中不同的化學成分具有不同的抗菌能力。眾多活性成分中，酚類的抗菌性最強，其次是醛類、醇類、酮類、酯類和烴類[34]。此外，大量研究表明，羥基(—OH)、甲氧基(—OCH3)、烯烴鍵以及親脂性化學結構對精油抗菌能力有著重要作用，可提高其抗菌能力[35-36]。在抗菌評價體系中，最低抑菌濃度(MIC)是衡量抗菌效果的常用指標之一，MIC值越小，說明其抗菌效果越好[1]。表1列出了幾種常見CEOs的MIC值，比較其抗菌能力[25,33,37-38]。從表中可以發(fā)現，不同的CEOs對同一種細菌具有不同的抗菌力，同一種CEOs對不同的細菌也具有不同的抗菌力?？傮w而言，表1中所列5種常見的CEOs，佛手柑精油和檸檬油的抗菌效果較佳。

表1 不同CEOs的MIC值

3.3 CEOs的選擇性抗菌活性

CEOs具有選擇性抗菌活性。研究報道，CEOs可以抑制病原菌活性，如李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌[20,30]，同時刺激有益微生物發(fā)揮作用，如豬的乳酸桿菌[39]。CEOs對大腸桿菌具有較高的抑菌活性，而對乳酸桿菌的抑菌活性很小甚至沒有影響，且CEOs的抑制作用存在劑量依賴性[2]。此外，還有研究發(fā)現，當CEOs作用于細菌時，乳酸桿菌的MIC值是大腸桿菌的2倍多，最低殺菌濃度(MBC)值是大腸桿菌的4倍多[2]。以上研究均表明，CEOs對有害菌和有益菌具有選擇性抗菌活性。

CEOs的選擇性抗菌活性可能與細菌細胞膜的結構有關。目前CEOs對大腸桿菌和乳酸桿菌的選擇性抗菌活性已有一定的研究報道。通常認為，植物精油對革蘭氏陽性病原菌的抑制效果高于革蘭氏陰性病原菌[40]，這2種細菌對植物精油敏感性的差異被認為是細胞壁結構存在差異造成的，因為革蘭氏陽性菌缺乏革蘭氏陰性菌所具有的外膜，這種外膜含有極性末端和跨膜通道的脂多糖(LPS)，它允許親水性溶質通過，使疏水性化合物如植物精油組分難以擴散到細胞中。因此，這將使革蘭氏陰性菌對植物精油更具有耐藥性[41]。然而，在Ambrosio等[2]的研究中卻得到了相反的結果，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，乳酸桿菌為革蘭氏陽性菌，但是，大腸桿菌比乳酸桿菌對CEOs更敏感，因為，植物精油抗菌譜取決于職務精油化合物官能團對單個或多個靶點的特異性。一些精油的化合物能夠分解大腸桿菌的外膜，釋放與這層膜相關的物質并穿透細胞，從而引發(fā)破壞效應，達到抑菌效果[42]。CEOs中的化合物可能也具有這種能力，從而使得CEOs對大腸桿菌更敏感。此外，Viuda-Martos等[43]研究揭示了CEOs只有在高濃度下才能抑制乳酸桿菌，這也在一定程度上證明了CEOs對大腸桿菌和乳酸桿菌的選擇性抑菌活性。然而，對于CEOs選擇性抗菌活性機制有待更深入的研究。

4 CEOs的抗菌作用機制

CEOs具有高度疏水性，能夠促進其與細菌脂質雙分子層互作，從而影響細胞膜的結構完整性和功能，并且精油能夠在脂質雙分子層中大量積累，最終導致細胞破裂，使細胞凋亡，其作用機制包括以下幾個方面。

4.1 對細菌細胞形態(tài)的影響

CEOs可以通過對細菌細胞形態(tài)的影響，使其結構發(fā)生改變，使細胞內物質從細胞中流出，導致細菌細胞凋亡，最終達到抑菌效果。Tang等[44]通過掃描電鏡觀察不同濃度精油處理對細菌細胞形態(tài)的影響，研究發(fā)現，空白對照組細菌細胞呈規(guī)則形狀，內部結構完整，表面光滑，無損傷；經CEOs處理后，與CEOs接觸的細菌細胞表面呈現不規(guī)則狀、皺縮和粗糙，表明CEOs可導致細菌細胞的損傷，從而影響細菌細胞膜的通透性和完整性。

4.2 對細菌細胞膜的影響

植物精油可以抑制并破壞細菌細胞膜，其與細菌細胞膜作用，使膜結構發(fā)生巨大變化，引起膜的膨脹和不穩(wěn)定，增加膜的流動性和滲透性，從而達到抗菌效果[34]。膜的破壞會導致細胞內物質的流失，致使細菌死亡。CEOs一般主要通過3種方式對細菌細胞膜造成破壞，從而對致病菌活性產生抑制作用。

1)影響細胞膜滲透性。細菌細胞膜的滲透性用相對電導率(relative electric conductivity)表示，膜滲透性的破壞，會導致胞內電解質泄漏，相對電導率增加。Ambrosio等[4]研究表明，用CEOs處理大腸桿菌U21后其相對電導率升高，表明細菌細胞膜滲透性被破壞。此外，用佛手柑精油處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，其相對電導率均有所增加，且金黃色葡萄球菌相對電導率高于大腸桿菌，這說明佛手柑精油會使細菌細胞膜滲透性破壞，且對金黃色葡萄球菌作用效果更明顯[37]。

2)影響細胞膜完整性。蛋白質和核酸是細胞內極其重要的大分子，涉及細胞結構和遺傳信息[45]，核酸和蛋白質在260 nm處的吸光度是膜完整性的一個指標[37]。Bajpai等[46]研究發(fā)現，用佛手柑精油處理過的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的吸光度值顯著增加，表明佛手柑精油影響了膜的完整性，從而導致細菌細胞死亡。

3)影響細胞膜電位。細菌細胞膜電位用熒光強度表示。膜電位的變化會影響細菌的代謝活性，因此，可以通過細菌細胞膜電位的變化判斷細菌是否凋亡。Song等[47]研究表明，CEOs處理金黃色葡萄球菌，會使金黃色葡萄球菌的熒光強度顯著下降，導致細胞代謝活動異常，掃描電子顯微鏡圖像也顯示出柑橘精油處理金黃色葡萄球菌細胞結構受到破壞。由此可見，CEOs可通過直接接觸細菌細胞，使細胞膜發(fā)生變化，破壞細胞膜的結構，從而實現抑菌作用。

4.3 對細菌細胞內物質泄漏的影響

當細菌細胞接觸到植物精油時，會使細胞膜的滲透性發(fā)生變化，使得細胞內的大分子物質，比如蛋白質、核酸和ATP等泄漏，從而加劇細菌死亡。因此，直接測定細菌細胞內外大分子物質的含量，也是檢測植物精油是否具有抗菌活性的方法之一。

1)對細菌內蛋白質、核酸的影響。用CEOs處理金黃色葡萄球菌后，金黃色葡萄球菌細胞的胞外蛋白質和核酸含量顯著增加，而細胞內蛋白質和核酸含量明顯下降，這表明CEOs作用于細菌，會使其胞內蛋白質和核酸泄漏，致使細菌失活[47]。

2)對細菌ATP的影響。ATP對細菌細胞功能至關重要，包括能量轉換要求、營養(yǎng)物質加工和運輸、結構大分子的合成和各種酶的分泌[46]，通過ATP濃度的測定可以判斷是否具有抑菌效果。用CEOs處理金黃色葡萄球菌后，金黃色葡萄球菌細胞的胞內ATP濃度顯著下降[47]，這說明胞內的ATP泄漏，表明CEOs具有抑菌作用。

5 小 結

CEOs產量豐富、無毒無害且安全有效，具有選擇性抗菌活性，可抑制有害細菌和真菌的生長，對有益菌不敏感，且不同的CEOs具有不同的抗菌能力，在畜牧生產中具有廣闊的應用前景，今后還有待進一步研究其選擇性抗菌活性的作用機制。