3種不同規(guī)模化培養(yǎng)模式對(duì)湛江等鞭金藻生產(chǎn)力及色素含量的影響

呂 布,楊守國,VASQUEZ Hebert Ely,王愛民,鄭 興,顧志峰

(1 海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 海口 570228; 2 海南大學(xué)南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ?？?570228;3 海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?571126)

湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)是一種重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)微藻，具有個(gè)體小、繁殖快、營養(yǎng)豐富、運(yùn)動(dòng)速度適中、不含纖維素細(xì)胞壁等特點(diǎn)，易被水生動(dòng)物幼蟲捕捉吞食和消化吸收，常作為海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)雙殼類等動(dòng)物幼蟲的基礎(chǔ)餌料[1-3]。

微藻一般分為室內(nèi)和室外兩種養(yǎng)殖方式。室內(nèi)環(huán)境下，主要通過5 L或更小的錐形瓶為培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)，主要特點(diǎn)為精細(xì)化培養(yǎng)，但培養(yǎng)規(guī)模較小，一般作為一級(jí)藻種培養(yǎng)的開展模式。室外環(huán)境下，主要以容積300 L以上的容器進(jìn)行培養(yǎng)，如玻璃鋼桶、水泥池，主要特點(diǎn)是培養(yǎng)規(guī)模大，但精細(xì)化程度較低、易污染[4-5]。水產(chǎn)生產(chǎn)活動(dòng)中所使用的微藻餌料基本是通過室外開放式規(guī)?；a(chǎn)所得，該生產(chǎn)方式一般為一次性生產(chǎn)，易發(fā)生污染、倒藻現(xiàn)象，繼而影響效益[6]。

室外光生物連續(xù)培養(yǎng)器近年來受到微藻生產(chǎn)企業(yè)的推崇，其主要特點(diǎn)是可進(jìn)行連續(xù)性高密度培養(yǎng)，不易污染，可規(guī)模化生產(chǎn)[7-8]。室外光生物連續(xù)培養(yǎng)器具有可高效生產(chǎn)、所獲微藻生物質(zhì)量較高、土地使用面積效率相對(duì)較高等特點(diǎn)，使其成為可代替水泥池等占地面積大的微藻傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式的有效手段之一[9-11]。室外光生物連續(xù)培養(yǎng)器作為新型培養(yǎng)模式，相對(duì)聚乙烯桶、水泥池等傳統(tǒng)模式的相關(guān)工作要求較高，如對(duì)操作者也具有一定管理技術(shù)要求，傳統(tǒng)養(yǎng)殖戶因?qū)ζ洳涣私舛桓逸p易接受并進(jìn)行生產(chǎn)嘗試[12]。關(guān)于室外光生物連續(xù)培養(yǎng)器與目前生產(chǎn)上常用的聚乙烯桶、水泥池等模式之間的生產(chǎn)效率和質(zhì)量的比較研究報(bào)道則更為少見，因此使得新技術(shù)在養(yǎng)殖戶中的推廣工作變得緩慢。

本研究以湛江等鞭金藻為研究對(duì)象，比較探究了管道式光生物反應(yīng)器養(yǎng)殖模式與傳統(tǒng)微藻室外規(guī)?；B(yǎng)殖模式(聚乙烯桶和水泥池)生產(chǎn)力及生產(chǎn)效果之間的詳細(xì)差異，以期為微藻生產(chǎn)新模式的推廣及技術(shù)優(yōu)化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)來源海南大學(xué)海洋學(xué)院微藻保種室。試驗(yàn)前將藻種進(jìn)行純化擴(kuò)培，取快速生長(zhǎng)期的藻液開展室外培養(yǎng)試驗(yàn)。所用培養(yǎng)液為本課題組基于“寧波3#微藻培養(yǎng)液” 而進(jìn)一步優(yōu)化所得，具體配方為：化肥尿素 50 mg、NaH2PO410 mg、 FeSO42.5 mg、MnSO40.25 mg、EDTA-2Na 10 mg、VB16× 10-3mg、VB120.5×10-6mg、過濾海水1 L。

試驗(yàn)所用水體為經(jīng)過沙井過濾、沉淀、漂白水消毒后的自然海水。室外培養(yǎng)過程中的溫度、光照強(qiáng)度、濕度、光周期等理化條件為自然條件。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在 3 種不同的養(yǎng)殖模式中進(jìn)行(圖1)。聚乙烯桶的工作體積約 1 000 L；傳統(tǒng)水泥池工作體積約 3 000 L；管道式光生物反應(yīng)器工作體積約 2 000 L，其中管道式光生物反應(yīng)器的供氣系統(tǒng)由泵、輸氣管、調(diào)節(jié)閥組成。試驗(yàn)充氣量基本統(tǒng)一控制為 20 L/min；接種細(xì)胞密度約為10.0×104cells/mL。光照為正常自然條件。

圖1 試驗(yàn)所用微藻室外規(guī)模化培養(yǎng)模式

試驗(yàn)組別接入藻種混勻后，每隔24 h進(jìn)行取樣，進(jìn)行藻類細(xì)胞數(shù)目、干重、色素含量、總蛋白含量及可溶性糖含量指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

(1)藻細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定。采用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行測(cè)定[13]。

(2)藻細(xì)胞干重的測(cè)定。預(yù)先稱重烘干Whatman GF/C過濾膜，將一定體積的藻液在該膜上過濾，經(jīng)過沖洗除營養(yǎng)鹽后，放到105 ℃烘箱中烘干72 h以上后稱重，直至前后兩次質(zhì)量差不超過2 mg，然后計(jì)算兩者的差值代表干重[14]。

(3)藻細(xì)胞內(nèi)生物質(zhì)的測(cè)定。

①葉綠素含量：利用丙酮萃取法提取微藻體內(nèi)葉綠素，取待測(cè)藻液樣品 20 mL，通過抽濾于Whatman GF/C膜上，隨后用鑷子將Whatman GF/C膜取下置于50 mL離心管底部，加入10 mL的90 %丙酮溶液，立即放入4 ℃冰箱中避光保存24 h以上(1～3 d均可)，黑暗低溫條件下進(jìn)行萃取。萃取后在4 ℃，4 000 r/min條件下離心10 min，將離心后的提取液上清液小心注入1 cm比色皿，以90 %丙酮溶液作參比，分光光度計(jì)(島津UV-1700)分別測(cè)定在波長(zhǎng)630、647、664 nm處溶液的吸光度值并記錄,減去波長(zhǎng)750 nm下測(cè)得的吸光度值，得到校正后的E664、E647、E630值。按照以下的方程式計(jì)算葉綠素a(Cchla)、葉綠素b(Cchlb)和總?cè)~綠素(Ctch1)的質(zhì)量濃度[15]。

Cchla=(11.85E664-1.54E647-0.08E630)

×10/V

(1)

Cchlb=(21.03E647-5.43E664-2.66E630)

×10/V

(2)

Ctch1=(20.21E647+8.02E664) ×10/V

(3)

式中：Cchla、Cchlb、Ctch1—葉綠素a、b、總?cè)~綠素的質(zhì)量濃度，mg/L；E630、E647、E664—吸光度值，nm，V—試驗(yàn)用藻液體積，mL。

②總蛋白質(zhì)含量：稱取 0.1～0.3 g被測(cè)樣品包于特制錫箔中,并置于自動(dòng)落樣器上。樣品在燃燒反應(yīng)爐 (960 ℃)、通氧量為 170 mL/min條件下充分燃燒 300 s，直至氧剩余量達(dá)到 12 %時(shí)停止燃燒。燃燒反應(yīng)爐中的試劑依次為 280 g氧化銅，13 g銀絲，15 g鉑。燃燒爐中的產(chǎn)物進(jìn)入 TC 檢測(cè)器(Rapid N III，Ele-mentar公司)檢測(cè)[16]。

③可溶性糖含量：取提取液 1 mL于刻度離心管內(nèi)，加 5 mL蒽酮試劑，擰上蓋子，沸水浴10 min之后將離心管冰水浴或用自來水沖洗至室溫， 20 min后用紫外分光光度計(jì)測(cè) 630 nm處的吸光度值，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算可溶性糖含量[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

(1)數(shù)據(jù)換算處理：生產(chǎn)力Px和比生長(zhǎng)速率(μ)通過下述公式進(jìn)行計(jì)算[18]：

Px= (Xm-Xi)/Tc

(4)

μ= (lnXm-lnXi)/Tc

(5)

式中：Px—生產(chǎn)力，g/(L·d)，Xi—初始生物量質(zhì)量濃度， g/ L，Xm—最大生物量質(zhì)量濃度，g/L，Tc—與最大生物量質(zhì)量濃度有關(guān)的培養(yǎng)時(shí)間，d。

(2)統(tǒng)計(jì)分析：試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)進(jìn)行表示。采用Microsoft Excel 2016和DPS 14.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析法進(jìn)行差異性顯著分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻生產(chǎn)力和比生長(zhǎng)速率的差異

管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)模式下的湛江等鞭金藻生產(chǎn)力和比生長(zhǎng)速率顯著優(yōu)于聚乙烯桶和傳統(tǒng)水泥池培養(yǎng)模式(P<0.05，表1)。管道式光生物反應(yīng)器的生產(chǎn)力和比生長(zhǎng)速率最高，分別為0.054 3±0.000 8 g /(L·d)、0.276 7±0.001 0 d-1，其次為傳統(tǒng)水泥池模式，分別為0.019 3±0.000 3 g/(L·d)、0.200 7±0.001 2 d-1。而聚乙烯桶模式相對(duì)最低，分別為0.016 3±0.000 6 g /(L·d)、0.190 3±0.002 4 d-1。

表1 不同養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻生產(chǎn)力和比生長(zhǎng)速率的差異

2.2 不同養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻生長(zhǎng)密度的差異

不同養(yǎng)殖模式下的湛江等鞭金藻生長(zhǎng)整體呈先緩慢增長(zhǎng)后快速增長(zhǎng)，隨后呈穩(wěn)定狀態(tài)，最后開始降低的趨勢(shì)，且管道式光生物反應(yīng)器模式趨勢(shì)變化最為明顯(圖2)。

圖2 3種養(yǎng)殖模式對(duì)湛江等鞭金藻生長(zhǎng)密度的影響

管道式光生物反應(yīng)器模式在第11 天開始進(jìn)入快速生長(zhǎng)期(1.46±0.04)×106cells/mL，并在第13 天細(xì)胞密度達(dá)峰值(3.70±0.11)×106cells/mL且開始進(jìn)入平穩(wěn)期；傳統(tǒng)水泥池和聚乙烯桶模式生長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)平緩，在第13天和第14 天分別達(dá)到峰值(1.42±0.01)×106cells/mL、(1.18±0.04)×106cells/mL，但顯著低于管道式光生物反應(yīng)器模式峰值(P< 0.05)。

2.3 不同養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量的差異

不同養(yǎng)殖模式下的湛江等鞭金藻葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度整體都呈先緩慢增長(zhǎng)后快速增長(zhǎng)，隨后呈穩(wěn)定狀態(tài)，最后開始降低的趨勢(shì)，且管道式光生物反應(yīng)器模式趨勢(shì)變化最為明顯(圖3、4、5)。

圖3 3種養(yǎng)殖模式對(duì)湛江等鞭金藻葉綠素a的影響

圖4 3種養(yǎng)殖模式對(duì)湛江等鞭金藻葉綠素b的影響

圖5 3種養(yǎng)殖模式對(duì)湛江等鞭金藻總?cè)~綠素的影響

管道式光生物反應(yīng)器模式中葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素在第9天開始進(jìn)入快速增長(zhǎng)期(0.28 mg/L、0.29 mg/L、0.58 mg/L)，并在第14天葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量達(dá)峰值(0.94 mg/L、0.95 mg/L、1.90 mg/L)且開始進(jìn)入平穩(wěn)期；傳統(tǒng)水泥池和聚乙烯桶模式葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素增長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)平緩，且葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度的峰值顯著低于管道式光生物反應(yīng)器模式(P< 0.05)。傳統(tǒng)水泥池在養(yǎng)殖第13天葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度分別達(dá)峰值0.36 mg/L、0.35 mg/L、0.73 mg/L；聚乙烯桶模式在養(yǎng)殖第14天葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度分別達(dá)峰值0.31 mg/L、0.31 mg/L、0.63 mg/L。

2.4 不同養(yǎng)殖模式下湛江等鞭金藻和胞內(nèi)有機(jī)物含量對(duì)比

管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)模式下的湛江等鞭金藻有機(jī)物質(zhì)量濃度最佳，其次為傳統(tǒng)水泥池模式，且有機(jī)物含量之間存在顯著性差異(表2，P< 0.05)。管道式光生物反應(yīng)器的有機(jī)物質(zhì)量濃度最高，最大生物量干重、最高總蛋白質(zhì)含量和最大可溶性糖含量分別可達(dá)0.727 0±0.009 8 g /L、159.125 5±2.169 7 mg/L，42.862 7±0.586 6 mg/L，顯著高于傳統(tǒng)水泥池模式(0.274 0±0.004 3 g/L、58.021 5±0.952 4 mg/L，15.528 3±0.257 5 mg/L)，和聚乙烯桶模式(0.238 5±0.007 4 g /L、50.453 4±1.633 1 mg/L，13.482 3±0.441 5 mg/L)。而管道式光生物反應(yīng)器，聚乙烯桶和傳統(tǒng)水泥池模式的單細(xì)胞胞內(nèi)有機(jī)物含量之間沒有顯著性差異(表3)。

表2 湛江等鞭金藻在聚乙烯桶、管道式光生物反應(yīng)器和傳統(tǒng)水泥池培養(yǎng)下的有機(jī)物之間的比較

表3 湛江等鞭金藻在聚乙烯桶、管道式光生物反應(yīng)器和傳統(tǒng)水泥池培養(yǎng)下的單細(xì)胞胞內(nèi)有機(jī)物之間的比較

3 討論

3.1 湛江等鞭金藻3種培養(yǎng)模式比較

微藻培養(yǎng)模式各有利弊，為了取長(zhǎng)補(bǔ)短、相互彌補(bǔ)，對(duì)各種培養(yǎng)模式不斷地優(yōu)化成為近幾年的研究熱點(diǎn)。跑道水泥池模式的使用在微藻培養(yǎng)發(fā)展過程中實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)大和培養(yǎng)的嘗試，其優(yōu)點(diǎn)在于可將投入和運(yùn)營成本降到最低[19-21]。此外聚乙烯桶模式因其具有體積小、易清理的優(yōu)點(diǎn)，常在水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)中被應(yīng)用，是微藻生物餌料擴(kuò)培的中間模式[22]。管道式光生物反應(yīng)器是近年來較受水產(chǎn)生產(chǎn)單位歡迎的微藻室外培養(yǎng)的新型模式，其可利用玻璃管道使微藻在生產(chǎn)過程中充分利用太陽光能，使藻細(xì)胞的受光面積達(dá)到最大，并可降低受其他因素污染藻液的可能性[10,23-24]。本研究表明，管道式光生物反應(yīng)器是適合戶外大規(guī)模微藻培養(yǎng)的養(yǎng)殖模式，這與李磊等[10]關(guān)于光生物反應(yīng)器培養(yǎng)微藻的研究結(jié)果以及趙新亞等[25]對(duì)小球藻和新月菱形藻柱式光生物反應(yīng)器連續(xù)式培養(yǎng)研究結(jié)果較為一致。由此可見光生物反應(yīng)器培養(yǎng)模式與常見的三角瓶一級(jí)培養(yǎng)、吊袋二級(jí)培養(yǎng)和水泥池三級(jí)培養(yǎng)系統(tǒng)相比具有明顯的優(yōu)越性，且具有較高的微藻繁殖效率。

3.2 湛江等鞭金藻3種培養(yǎng)模式對(duì)生產(chǎn)力和色素含量影響分析

生產(chǎn)力和比生長(zhǎng)速率是評(píng)估微藻生產(chǎn)可行性的重要參數(shù)之一，本研究表明，管道式光生物反應(yīng)器生產(chǎn)模式的生產(chǎn)力和比生長(zhǎng)速率顯著高于聚乙烯桶和傳統(tǒng)水泥池模式，即管道式光生物反應(yīng)器生產(chǎn)模式的生產(chǎn)效果最佳。3種不同培養(yǎng)模式的比較試驗(yàn)是同時(shí)在室外開展的，造成生產(chǎn)效果存在差異的主要原因可能在于光照利用的充分與否。隨培養(yǎng)時(shí)間的推移，藻液?jiǎn)渭?xì)胞濃度在不斷升高，傳統(tǒng)水泥池和聚乙烯桶培養(yǎng)模式由于養(yǎng)殖容器深度等問題使得單個(gè)藻體細(xì)胞所受到光照條件在逐漸減弱，繼而限制了其生長(zhǎng)，而管道式光生物反應(yīng)器相對(duì)而言即使在養(yǎng)殖后期依然可有效保障藻細(xì)胞充足且有效的光照條件[26-28]。與董學(xué)衛(wèi)等[5]關(guān)于柱式反應(yīng)器研究結(jié)果相比，管道式光生物反應(yīng)器的生產(chǎn)力較次于柱式反應(yīng)器，其原因可能在于培養(yǎng)規(guī)模的差異，其所用柱式反應(yīng)器培養(yǎng)體積較小，更適于室內(nèi)保種，而本研究所用管道式光生物反應(yīng)器規(guī)模相對(duì)較大，更適用于室外培養(yǎng)，同時(shí)在和其柱式反應(yīng)器初始藻密度相差很大的情況下，它們的比生長(zhǎng)速率仍然十分接近，可見本研究所用的管道式光生物反應(yīng)器是具有優(yōu)勢(shì)的。

細(xì)胞光合速率決定了藻類生長(zhǎng)速度，而光合速率又取決于光合色素的含量，因此光合色素含量變化能反映微藻生長(zhǎng)發(fā)育情況[29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，利用管道式光生物反應(yīng)器規(guī)模化培養(yǎng)金藻時(shí)更利于其葉綠素及胞內(nèi)有機(jī)物的積累。朱永梅等[30]研究中利用不同光合光子強(qiáng)度培養(yǎng)湛江等鞭金藻說明，光照強(qiáng)度在一定的范圍內(nèi)，逐漸升高是有利于微藻生長(zhǎng)，本研究所用管道式光生物反應(yīng)器受光面積更大，單個(gè)微藻更容易接受光照，相較于其他兩種模式更有利于微藻培養(yǎng)。如果假設(shè)培養(yǎng)系統(tǒng)之間的葉綠素?cái)?shù)量和質(zhì)量沒有差異，并且所有系統(tǒng)處于相同曲線水平，這原則上表達(dá)了管道式光生物反應(yīng)器系統(tǒng)中湛江等鞭金藻的發(fā)育狀況更好且應(yīng)優(yōu)選用于葉綠素的生產(chǎn)。且在相似的鹽度下，本研究中管道式光生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的葉綠素含量和藺紅蘋等[1]研究中的葉綠素含量一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)周期內(nèi)管道式光生物反應(yīng)器、聚乙烯桶和傳統(tǒng)水泥池的湛江等鞭金藻有機(jī)物的質(zhì)量濃度并不一致，管道式光生物反應(yīng)器中湛江等鞭金藻總蛋白質(zhì)含量和可溶性糖含量顯著高于聚乙烯桶和傳統(tǒng)水泥池培養(yǎng)模式，這可能是由于管道式光生物反應(yīng)器更利于藻體接受光照所致[5]。與黃振華等[31]使用小型錐形瓶培養(yǎng)的湛江等鞭金藻的蛋白質(zhì)含量相比，本研究使用的管道式光生物反應(yīng)器要低于其使用的用于保種的小型錐形瓶，但二者模式相差較大，所以用于規(guī)?；a(chǎn)的管道式光生物反應(yīng)器的蛋白質(zhì)含量是具有可比性的。傳統(tǒng)的微藻室外規(guī)模化培養(yǎng)方式操作煩瑣，生產(chǎn)效率低，藻的質(zhì)量不能得到保障，相關(guān)研究結(jié)果表明，管道式光生物反應(yīng)器可有效避免這些問題，更利于微藻規(guī)模化培養(yǎng)效率的提高，但需要較精細(xì)的技術(shù)運(yùn)營管理。

4 結(jié)論

管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)模式下的藻細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖速度快，可快速進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，具有藻液細(xì)胞濃度大，富含優(yōu)質(zhì)生物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，餌料質(zhì)量可得到強(qiáng)化。管道式光生物反應(yīng)器為在戶外低成本高效開發(fā)微藻提供了基礎(chǔ)條件。

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