β-煙酰胺單核苷酸合成研究進(jìn)展

景占煜， 袁若珂， 李益民， 袁文杰, 3*

(1.大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014；3.大連理工大學(xué) 寧波研究院，浙江 寧波 315016)

β-煙酰胺單核苷酸(NMN), 其分子式為 C11H15N2O8P，分子量 334.2。NMN在人體內(nèi)天然存在，也富含在一些水果、蔬菜和肉類中。作為輔酶I (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+)的前體物質(zhì)，NMN是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的代謝中間產(chǎn)物(圖1)。NAD+是生物機(jī)體組織必需的一種輔酶，在生物氧化過程中起著傳遞氫、活化多酶系統(tǒng)、促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)、多糖的合成及代謝，提高物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)控制，改善代謝功能的作用。許多基本的生物學(xué)過程，包括壽命調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、端粒維持都與NAD+相關(guān)[1]。隨著年齡的增長，NAD+的水平逐漸降低，細(xì)胞反應(yīng)和代謝減弱，由此帶來一些問題，比如長皺紋、脫發(fā)、精力變差、易疲勞等。近年來, 人們對NAD+作為中樞信號分子和酶底物的作用越來越感興趣。通過提高體內(nèi)NAD+的水平，可補(bǔ)充體力、抗氧化、提高細(xì)胞ATP能量等。外源攝取NMN是補(bǔ)充NAD+最直接、最有效的手段，因此近年來NMN的生物學(xué)作用備受關(guān)注。NMN在人體內(nèi)通過轉(zhuǎn)化為NAD+發(fā)揮其生理功能，對心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病及老化退行性疾病等有較好的治療和修復(fù)作用，并且能調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和死亡、維持氧化還原狀態(tài)等[2-3](圖2)。鑒于上述的生物活性，NMN被稱之為不老神藥，成為藥品、保健品和化妝品等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。世界范圍內(nèi)(尤其是美國)正在進(jìn)行的臨床實(shí)驗(yàn)達(dá)到15項(xiàng)，其中5項(xiàng)已完成[4]。本文對國內(nèi)外有關(guān)NMN在疾病治療中的應(yīng)用及NMN的合成工藝進(jìn)行較為詳細(xì)的綜述，為后續(xù)NMN的高效、低成本合成提供參考。

圖1 NMN與NAD+的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of NMN and NAD+

圖2 NMN的生物學(xué)作用Fig.2 Biological function of NMN

1 NMN在疾病治療中的應(yīng)用

1.1 NMN具有提高認(rèn)知和記憶功能的作用

NMN具有改善認(rèn)知和記憶功能的作用，對阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)和帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變性疾病有一定的治療作用[5]。AD患者會發(fā)生認(rèn)知功能障礙和記憶損害。線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常是AD的發(fā)病原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提高機(jī)體內(nèi)NMN水平后，NAD+可用性隨即增高，促進(jìn)了線粒體的融合，改善了線粒體的呼吸功能[6]。NMN 通過改變物質(zhì)代謝過程中伴隨的能量轉(zhuǎn)移、存儲等，防止機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化的失衡，改善了由于淀粉樣蛋白質(zhì)(Aβ1-42低聚體)大量積累而導(dǎo)致的AD大鼠的認(rèn)知和記憶功能，減少了AD小鼠海馬切片中活性氧自由基(ROS)的積累[7]。此外研究還發(fā)現(xiàn)，NMN通過激活絲氨酸蘇氨酸激酶(JNK)，改善AD小鼠的行為認(rèn)知障礙，抑制β-淀粉樣蛋白生成，減輕神經(jīng)系統(tǒng)淀粉樣斑塊負(fù)荷、突觸損傷和炎癥反應(yīng)[8]。調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NMN水平，可以改善心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病以及老化退行性疾病，并具有一定的治療和修復(fù)作用[9-13]。

1.2 NMN具有改善肥胖、糖尿病代謝異常的作用

NAD+水平隨著年齡和生理狀況的變化而下降，這與肥胖、糖尿病代謝異常等有關(guān)。最近有人對使用NAD+促進(jìn)劑包括NMN和煙酰胺核糖(NR)治療代謝障礙的藥理學(xué)進(jìn)行了研究[14-15]。肥胖、糖尿病和衰老會引起細(xì)胞內(nèi)NAD+水平下降，導(dǎo)致代謝功能障礙。在哺乳動物NAD+生物合成中，NMN的有效性是一個(gè)限速因子。NMN通過催化哺乳動物NAD+的生物合成，參與和調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)分泌，從而起到保護(hù)和修復(fù)胰島功能、增加胰島素分泌，防治糖尿病和肥胖等代謝性疾病的作用。NMN可作為一種治療過度營養(yǎng)導(dǎo)致孕婦及產(chǎn)后代謝性疾病的藥物[16]。通過注射NMN，僅18 d就可改善糖耐量，降低脂質(zhì)積累，上調(diào)負(fù)責(zé)肥胖雌性后代的脂肪酸代謝基因表達(dá)。一項(xiàng)為期10周的實(shí)驗(yàn)評估了補(bǔ)充NMN對超重或肥胖絕經(jīng)后前驅(qū)糖尿病女性代謝功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨骼肌胰島素信號在補(bǔ)充NMN后增加，并上調(diào)了血小板源性生長因子受體b等與肌肉重塑相關(guān)基因的表達(dá)，證明NMN增加了超重或肥胖的前驅(qū)糖尿病女性患者肌肉胰島素敏感性，影響了胰島素信號傳導(dǎo)和重塑[17-18]。

1.3 NMN具有改善與年齡相關(guān)的生理衰退的作用

NMN能夠顯著改善小鼠與年齡相關(guān)的生理衰退，如抑制與年齡相關(guān)的體重增加，增強(qiáng)能量代謝，改善胰島素敏感性和血漿中脂質(zhì)分布，改善眼部功能[19]。NMN能通過組織特異性方式預(yù)防與年齡相關(guān)的基因表達(dá)變化，并且增強(qiáng)骨骼肌中的線粒體的氧化代謝，部分地介導(dǎo)抗衰老作用[20]。長期來看，在飲用水中加入NMN成功地逆轉(zhuǎn)了與年齡相關(guān)的體重增加，改善了能量代謝和胰島素敏感性[21]。另外健康超重或肥胖的男性和女性，添加NMN持續(xù)6周，可增加骨骼和肌肉中NAD+代謝，影響骨骼肌肉中乙酰肉堿代謝，達(dá)到去脂減肥的目的[22]。

1.4 NMN其他方面的作用

提高NMN水平還可以降低梗死組織中血紅蛋白含量，減輕出血和水腫，降低由氧化應(yīng)激造成的腦組織氧化毒性損傷，增加心臟中NAD+和NADH的含量[23]，恢復(fù)心臟缺血時(shí)心肌細(xì)胞中的NAD+水平，提高了組蛋白脫乙酰酶(又稱沉默調(diào)節(jié)蛋白，Sirt1)的脫乙酰酶活性和與絲裂霉素功能相關(guān)的基因表達(dá)水平，具有很好的臨床應(yīng)用前景[24]。

NMN在美容方面的應(yīng)用也是近年來的研究熱點(diǎn)。NMN能提高細(xì)胞內(nèi)線粒體功能，阻止自由基引起的細(xì)胞損傷，從而延緩細(xì)胞衰老，提高表皮細(xì)胞以及人體內(nèi)其他細(xì)胞的功能，維持皮膚健康，延緩皮膚衰老[25-27]。

2 NMN的合成方法

雖然NMN廣泛存在于毛豆、西蘭花、真菌、蝦等天然食物中，但是通過食用天然食物攝入NMN 的量，遠(yuǎn)不能達(dá)到對人體健康造成關(guān)鍵性影響的水平[28]。因此將其人為添加，應(yīng)用于加工食品，可以在改善人體健康、預(yù)防疾病等方面起到重要的作用?；瘜W(xué)法、微生物發(fā)酵法及生物酶法均可以合成NMN，但目前報(bào)道最有前途的應(yīng)為生物酶法。

2.1 NMN的化學(xué)法合成

化學(xué)法合成NMN有多種工藝[29-32]，其中最普遍的是以煙酰胺(NAM)為起始物料經(jīng)過三甲基硅烷保護(hù)后和四乙酰基核糖催化縮合得到三乙?；鶡燉０泛塑杖谆撬猁}，經(jīng)離子交換得到三乙?；鶡燉０泛塑章然?，再堿水解結(jié)晶得到煙酰胺核苷氯化物，經(jīng)磷酸化處理，得到β-煙酰胺單核苷酸。雖然技術(shù)容易控制，但產(chǎn)品雜質(zhì)過多，分離純化困難且總體收率很低，而且有機(jī)溶劑用量較大，對環(huán)境污染的影響不可忽視。此外，四乙酰核糖與煙酸乙酯(或煙酰胺)的縮合均使用價(jià)格昂貴的促進(jìn)劑 TMSOTf，導(dǎo)致化學(xué)法合成NMN成本仍較高。

2.2 NMN的微生物法合成

微生物發(fā)酵法是通過微生物的生長積累合成磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，外加NAM在細(xì)胞內(nèi)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)的作用下，生成NMN。微生物發(fā)酵法中以高產(chǎn)菌株的選擇最為重要。Kazane[33]以煙酰胺核糖(NR)營養(yǎng)缺陷型酵母為輔助篩選工具，從174株乳酸桿菌中獲得3株產(chǎn)NR或NMN的兼性厭氧乳酸菌。經(jīng)16S rRNA 鑒定這三種候選微生物均屬于果糖芽胞桿菌屬(Fructobacillus)，并能在培養(yǎng)基中產(chǎn)生NR (2.4～4.5 μmol/L)。因?yàn)閰捬跞樗岚l(fā)酵使用D-果糖作為電子受體，培養(yǎng)基中添加果糖后，生物量可以增加5倍。通過基因組測序，研究者獲得了能夠產(chǎn)生NMN和NR的關(guān)鍵酶——Nampt。

趙麗青等[34]從生產(chǎn)NMN相關(guān)產(chǎn)品的工廠下水管道附近的土壤中，經(jīng)初篩和復(fù)篩，篩選出轉(zhuǎn)化煙酰胺生成NMN能力較強(qiáng)的菌株，命名為革蘭陰性菌成都腸桿菌(Enterobacterchengduensis)2021T4.7。該菌株以NAM為誘導(dǎo)物，經(jīng)過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，NMN產(chǎn)量最高為67.66 μmol/L。

為進(jìn)一步提高微生物發(fā)酵法生產(chǎn)NMN的濃度和效率，研究者嘗試了通過構(gòu)建基因工程菌來達(dá)到目標(biāo)。Marinescu等[35]在大腸埃希菌(Escherichiacoli)中單獨(dú)表達(dá)分別來源于家鼠(Musmusculus)、 希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)和軟性下疳桿菌(Haemophilusducreyi)的 Nampt，補(bǔ)加底物 NAM，邊發(fā)酵邊合成 NMN。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于其他兩個(gè)細(xì)菌來源的 Nampt，相同時(shí)間內(nèi)哺乳動物(家鼠)來源的 Nampt在大腸埃希菌表達(dá)后合成 NMN 的產(chǎn)量較低，其中單獨(dú)表達(dá)來源Haemophilusducreyi的Nampt 的大腸埃希菌，發(fā)酵12 h，NMN 產(chǎn)量最高可達(dá) 0.042 mmol/L。在此研究基礎(chǔ)上，增加來源于Bacillusamyloliquefaciens的核糖磷酸焦磷酸激酶(Prs)，有利于菌體 PRPP 的生成。優(yōu)化培養(yǎng)條件后，發(fā)酵 12 h，NMN產(chǎn)量最高可達(dá)0.046 mmol/L。

基于之前的研究，Black等[36]在大腸埃希菌內(nèi)構(gòu)建了3條不同的NMN的合成途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過過表達(dá)來源于Ralstoniasolanacearum的磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NadV)，可將NMN的產(chǎn)量提高到1.5 mmol/L。值得注意的是，通過加強(qiáng)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)出，重組大腸埃希菌發(fā)酵NMN的最高濃度提升了近1 000倍，達(dá)到20.3 mmol/L[37]。該研究首先比較了來源于不同微生物的Nampt 活性，發(fā)現(xiàn)Sphingopyxissp. C-1 (SSC)和Chitinophagapinensis(CP) 的酶活性較高，并選擇來源于Chitinophagapinensis(CP)的Nampt用于后續(xù)研究。7個(gè)大腸埃希菌的內(nèi)源基因 (pgi、zwf、pgl、gnd、rpiA、rpiB、prs) 被過表達(dá)，加強(qiáng)了從葡萄糖到PRPP 的合成，提高了細(xì)胞內(nèi)PRPP的濃度。然后比較了6個(gè)不同來源的煙酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NiaP 來加強(qiáng)胞外NAM的轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)現(xiàn)來源于Burkholderiacenocepacia(BC) 的NiaP基因效果最好。又比較了5個(gè)不同來源的NMN轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，發(fā)現(xiàn)PnuC-BM效果最好。綜合以上結(jié)果，構(gòu)建的基因工程菌在OD600為40, 在含有21 g/L 葡萄糖、7 g/L NAM的M9 培養(yǎng)基中反應(yīng)8 h, NAM轉(zhuǎn)化率達(dá)到86%，為目前文獻(xiàn)報(bào)道的微生物發(fā)酵法合成NMN的最高水平。

2.3 NMN的生物酶法合成

生物酶法使用純化的游離酶或固定化酶催化合成NMN。由于反應(yīng)時(shí)間短、生成的NMN濃度高，是更有利于工業(yè)化的生產(chǎn)工藝。生物酶法生產(chǎn)工藝主要分為兩類：一類是基于磷酸核糖焦磷酸工藝，一類是基于煙酰胺核糖工藝。每一大類中又包括三種方法。

2.3.1 以磷酸核糖焦磷酸為核心的工藝 ①PRPP和NAM通過Nampt制備NMN。廖一波[38]將來源于Comamonadaceaebacterium的 Nampt進(jìn)行單酶催化合成NMN。結(jié)果顯示，單酶法合成NMN，通過補(bǔ)加一次底物 PRPP，10 min，NMN 產(chǎn)量達(dá)到0.1 mmol/L，轉(zhuǎn)化效率為 204 mg/(L·h)。傅榮昭等[39]以NAM、焦磷酸或其鹽以及AMP為原料，在Nampt和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，獲得煙酰胺單核苷酸，避免了反應(yīng)中使用不穩(wěn)定底物PRPP。這個(gè)反應(yīng)的關(guān)鍵酶來自MeiothermusruberDSM 1279 的Nampt。經(jīng)人工誘導(dǎo)定點(diǎn)突變獲得的突變體酶活力大大提高，是親本的1.2～6.9倍。在150 mmol/L NAM、100 mmol/L焦磷酸鈉等條件下，50 ℃，pH值8.0～8.5反應(yīng)8 h后，即得NMN粗產(chǎn)品溶液(含NMN 96.5 mmol/L)，再經(jīng)過濾、純化、干燥后即得NMN成品。同時(shí)，本研究也報(bào)道了使用固定化酶的催化作用。使用酶固定化載體環(huán)氧型 LX 3000 (50 mg酶/g載體)，150 r/min，25 ℃反應(yīng)20 h制備固定化酶。在含75 mmol/L的NAM、75 mmol/L的焦磷酸二鈉，37 ℃，pH值7.0～8.0條件下，反應(yīng)5 h后即得NMN粗產(chǎn)品溶液(含NMN 48.8 mmol/L)。 ② 以NAM、核糖和ATP為底物，經(jīng)D-核糖激酶(Ribokinase，EC2.7.1.15)、Prs和Nampt催化反應(yīng)生成NMN。180 min時(shí)，NMN最高產(chǎn)量為0.071 mmol/L，轉(zhuǎn)化效率為8 mg/(L·h)[37]。傅榮昭等[40]考察了使用固定化的酶進(jìn)行類似的反應(yīng)。在30 mmol/L的NAM、20 mmol/L的ATP、30 mmol/L的核糖條件下，加入固定化了的10 g/L的Nampt、Prs、核糖激酶(Rbks)等，37 ℃，pH 7.0～7.5條件下，反應(yīng)4 h可以獲得NMN粗產(chǎn)品溶液，濃度達(dá)到10 mmol/L。③ 以NAM、ATP和木糖為原料，在Nampt、Prs、核糖-5-P異構(gòu)酶、核酮糖-3-P異構(gòu)酶、木酮糖激酶(XK)以及木糖異構(gòu)酶(XI)等多種酶的催化作用下，也可獲得NMN[41]。在150 mmol/L NAM、50 mmol/L ATP和木糖，pH 8.0～8.5條件下，加入Nampt等酶各100 g/L，8 h后，獲得NMN 22 mmol/L。 由上述合成路線可知，基于PRPP反應(yīng)，Nampt活性為限速步驟。并且Nampt催化可逆反應(yīng)，合成NMN同時(shí)也能水解NMN，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較低。同時(shí)，中間體PRPP化合物不穩(wěn)定，不利于反應(yīng)進(jìn)行。整條工藝路線需要消耗大量的ATP，導(dǎo)致該生物催化法的生產(chǎn)成本較高。

圖3 基于磷酸核糖焦磷酸的工藝示意圖Fig.3 Process diagram based on phosphoric ribose pyrophosphate

2.3.2 基于煙酰胺核糖的工藝 ①以煙酰胺核糖(NR)為原料，通過煙酰胺核糖激酶(Ribosylnicotinamide kinase，EC 2.7.1.22)在ATP供應(yīng)下生成NMN。肖春英[42]利用來自ThermothielavioidesterrestrisNRRL 8126煙酰胺核糖激酶，在60 mmol/L NR、60 mmol/L ATP條件下，70 ℃，pH 5.0反應(yīng)4 h，NMN的轉(zhuǎn)化率達(dá)93%。為提高煙酰胺核糖激酶(NRK)的熱穩(wěn)定性，研究者們進(jìn)行了不同的基因突變。中國專利CN110373398A[43]公開了一種來源于馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)的NRK突變體，在氨基酸序列第D45位、第D58位、第R161位、第Y164位進(jìn)行單突變、兩兩聯(lián)合突變、三個(gè)聯(lián)合突變或四個(gè)聯(lián)合突變，并將該新型NRK突變體工業(yè)酶用于NMN的合成。將5 g底物NR溶解于100 mL、50 mmol/L pH 6.0磷酸鈉緩沖液中，待底物完全溶解后加入50 mmol/L 六偏磷酸鈉、5 mmol/L ATP、50 mmol/L 氯化鎂、0.2 g NRK突變體(D45E/D58Q/R161K/Y164W)凍干粉、0.2 g 多聚磷酸激酶PPK2凍干粉，25 ℃反應(yīng)20 h后，底物轉(zhuǎn)化率>80%。來源于Homo sapiens的野生型NRK，先通過蛋白結(jié)構(gòu)自由能計(jì)算預(yù)測出可能與提高穩(wěn)定性有關(guān)的15個(gè)位點(diǎn)，然后分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。獲得的突變體，在10 mmol/L ATP，10～100 g/L NR條件下，42 ℃反應(yīng)3 h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率>99%。與野生型酶相比，NRK突變體熱穩(wěn)定性顯著提高，45 ℃加熱20 min后，剩余酶活由之前的14.05%增加到突變體的76.24%；同時(shí)，突變體的單位酶活相對于突變前提高了2.77倍，從而顯著提升了酶的反應(yīng)溫度，加快了反應(yīng)速率，降低了反應(yīng)時(shí)間和生產(chǎn)成本，有效延長了酶的保存時(shí)間，降低了酶的使用成本[44]。此外，通過表面展示的方法構(gòu)建的全細(xì)胞催化劑也可用于NMN的生物酶法合成[45]。將釀酒酵母絮凝集素錨定蛋白flo1和NRK串聯(lián)形成融合蛋白，將該融合蛋白的編碼基因定向插入S1中釀酒酵母展示表達(dá)載體pHBM368-pgk以pgk為啟動子的開放閱讀框中，經(jīng)載體的線性化和電轉(zhuǎn)化，將目的基因?qū)氲妆P細(xì)胞釀酒酵母中，目的蛋白表達(dá)后，通過凝集素錨定蛋白flo1將NRK成功展示于釀酒酵母細(xì)胞壁表面，形成具有催化功能的全細(xì)胞酶催化劑；該酶40 ℃反應(yīng)4 h可生成49.2 mmol/L NMN，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.3%，適合工業(yè)化生產(chǎn)。②以腺苷和磷酸鹽為起始，在腺苷激酶(PNP)和NRK酶組合物的催化下生成D-核糖-1-磷酸和煙酰胺核糖中間體，最后獲得NMN[46]。腺苷和磷酸鹽在PNP的作用下首先合成D-核糖-1-磷酸，并繼續(xù)在該酶的催化下，與NAM合成煙酰胺核糖，然后消耗1分子ATP在NRK的催化下不可逆反應(yīng)生成NMN。整個(gè)反應(yīng)體系需要兩種酶的參與，生成1分子NMN的同時(shí)，只需消耗1分子ATP，且加入多聚磷酸激酶實(shí)現(xiàn)ADP再生為ATP，整個(gè)工藝大幅降低了成本。在135 mmol/L 腺苷、135 mmol/L NAM、200 mmol/L MgCl2、20 mmol/L ATP、135 mmol/L多聚磷酸鈉等條件下，加入PNP、NRK粗酶液，35 ℃反應(yīng)24 h，生成NMN 128.2 mmol/L(42.8 g/L)，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%，NMN的濃度和轉(zhuǎn)化率均達(dá)到了文獻(xiàn)報(bào)道的最高水平。③以D-核糖、NAM為底物，在RbKs、磷酸核糖變位酶及NRK的催化作用下合成NMN[47]。D-核糖在RbKs的作用下合成核糖-5-P；在磷酸核糖變位酶的作用下生成核糖-1-P，然后在1-P-核糖解磷酸酶的作用下合成NR；NR在NRK的磷酸化作用下合成NMN。在反應(yīng)體系中依次加入終濃度為100 mmol/L的核糖，100 mmol/L的NAM，120 mmol/L ATP，以及固定化的RbKs、NRK、磷酸核糖變位酶等各32 g/L，25 ℃反應(yīng)4 h得到NMN 92 mmol/L，反應(yīng)收率92.51%。以上結(jié)果表明，基于NR為原料的NMN合成工藝，底物轉(zhuǎn)化率高，生成的NMN濃度高。但直接以NR為底物，價(jià)格昂貴，成本不具有優(yōu)勢。以腺苷(Adenosine)和核糖(Ribose)為底物，通過二步或三步酶反應(yīng)，均可以獲得轉(zhuǎn)化率高(>90%)、NMN濃度高的結(jié)果，而且成本低，適于大規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。但從文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果來看，酶活力不足導(dǎo)致的酶用量較大(32 g/L)，急需尋找酶活力更高的編碼基因或通過蛋白質(zhì)工程的方法獲得高活性酶蛋白，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，使這種具有超常生物活性的產(chǎn)品惠及更多人群。

圖4 基于煙酰胺核糖(NR)的工藝示意圖Fig.4 Process diagram based on nicotinamide ribose

3 展 望

最近的臨床研究發(fā)現(xiàn)，做為NAD+最理想的補(bǔ)充劑，NMN在多種人類疾病如糖尿病、肥胖、缺血再灌注、心力衰竭和心肌病、血管功能障礙、腦內(nèi)出血、神經(jīng)保護(hù)和認(rèn)知功能、阿爾茨海默癥(AD)、視網(wǎng)膜變性、角膜損傷、急性腎損傷、酒精性肝病的小鼠模型治療中已顯示出較高的療效和效益，并具有安全無毒、無明顯副作用以及耐受性良好等特點(diǎn)。一些NMN膠囊配方作為保健品已被批準(zhǔn)并投放市場，但目前NMN的價(jià)格居高不下，限制了其大范圍使用。從NMN的制備工藝來看，雖然近幾年微生物發(fā)酵法取得了巨大的進(jìn)步，NMN的產(chǎn)量由不足5 μmol/L提高到了20 mmol/L，但與生物酶法相比，底物NAM的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物NMN的濃度依然偏低，仍具有較大的提升空間。通過基因編輯技術(shù)，提高微生物細(xì)胞內(nèi)PRPP的濃度是目前提高NMN濃度的主要研究方向[48]，NAM和PRPP在Nampt的催化下生成NMN。采用合成生物學(xué)策略，篩選外源高活性Nampt，并增加前體PRPP和ATP的供應(yīng)，從而提高菌株的生產(chǎn)性能。但PRPP對微生物有毒，可能是限制其高濃度積累的瓶頸。PRPP濃度與Nampt活性的匹配是使用全細(xì)胞重組大腸埃希菌催化合成NMN的關(guān)鍵。此外，在這個(gè)體系中，底物NAM和產(chǎn)物NMN的快速進(jìn)出細(xì)胞也是影響反應(yīng)速率的重要因素。通過過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YgcS，提高了NAM進(jìn)入細(xì)胞的速率和轉(zhuǎn)化率。同時(shí)，NR的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PnuC)的過表達(dá)會進(jìn)一步提高NMN的合成效率。

生物酶法采用游離酶或固定化酶進(jìn)行的體外催化合成NMN反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率高，NMN產(chǎn)物濃度高，底物便宜，是比較理想的制備NMN的方法。尤其是基于腺苷或核糖和NAM合成NMN的方法，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達(dá)到了90%以上，濃度也高達(dá)200 mmol/L以上[44]，但該方法目前仍存在多種酶使用量大的問題。因此，ATP的循環(huán)使用以及各生物酶的高活性及高穩(wěn)定性是保證NMN能夠高效、低成本生產(chǎn)的關(guān)鍵。ATP的循環(huán)使用，可采用多聚磷酸激酶(PPK2)來實(shí)現(xiàn)。NRK的穩(wěn)定性和高活性的提升，可以通過蛋白質(zhì)工程來進(jìn)行，但這也是非常有挑戰(zhàn)性的工作。固定化是提高酶的重復(fù)利用和提高酶的抗逆性的一種重要手段?；谖⑸锛?xì)胞表面展示的酶并同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞自固定化策略，無需采用固定化材料，含有NRK的全細(xì)胞便可行固定在特殊的反應(yīng)器中，從而實(shí)現(xiàn)NR到NMN的連續(xù)化合成，提高了生產(chǎn)效率[45]，但這個(gè)反應(yīng)過程中直接使用ATP供能，提高生產(chǎn)成本?？赏ㄟ^基因編輯方法，在大腸埃希菌或釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)，通過過表達(dá)解磷酸酶和PNP或RbKs，增加腺苷和核糖代謝途徑的通量，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步調(diào)整底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加轉(zhuǎn)運(yùn)速率。使用該全細(xì)胞進(jìn)行NMN的合成，一方面可以減少ATP的用量，另一方面也可以進(jìn)行重組細(xì)胞的重復(fù)使用，從而進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。筆者所在大連理工大學(xué)合成生物學(xué)與生物催化轉(zhuǎn)化課題組建立了基于細(xì)胞自固定化策略的NRK表達(dá)系統(tǒng)，無需采用固定化材料，含有NRK的全細(xì)胞便可形成毫米級顆粒，并固定在特殊的反應(yīng)器中，在PPK2的作用下，使用多聚磷酸鹽供能，從而實(shí)現(xiàn)腺苷或核糖到NMN的連續(xù)化合成。