微流控芯片系統(tǒng)在循環(huán)腫瘤細胞分離檢測中的應(yīng)用進展

曹榮凱, 張 敏, 于 浩, 秦建華*

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

作為液體活檢的重要標志物之一,循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)在外周血中的含量可以用來輔助判斷患者的癌癥病發(fā)狀況[1-3]。除此以外,CTCs對于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移行為等基礎(chǔ)研究也具有非常重要的意義[4,5]。然而人體血液中的CTCs含量極其稀少,通常僅有0～10個/mL,與之相對,紅細胞、白細胞和血小板的含量則分別達到5×109個/mL、4×106個/mL和3×108個/mL,而且腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移過程中可以通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)來不斷地改變自身的特征[6]。正是由于其稀缺性和異質(zhì)性,以及血液中復(fù)雜基質(zhì)的干擾,CTCs的精準檢測成為巨大的難題。

由于常規(guī)的光學(xué)分析手段在檢出限和靈敏度上均難以達到直接檢測的要求,因此通常在進行外周血中CTCs的檢測之前,要通過一些樣品前處理方法來實現(xiàn)其分離和富集。常采用的樣品前處理方法可以分為物理法和化學(xué)法[7],物理法主要根據(jù)細胞在物理特征上的差異來進行分離,例如膜過濾分離[8-10]和密度梯度離心[11,12],就是分別依據(jù)細胞的大小和密度來完成篩選?；瘜W(xué)法則主要依靠生物大分子的特異性識別作用[13-15],例如抗原抗體相互作用,核酸適配體與靶標的選擇性結(jié)合。

上述樣品前處理方法雖然能夠在不同程度上實現(xiàn)CTCs的分離富集,但也存在著一定的缺陷。由于這些方法都是非連續(xù)性的,在吸附、洗脫和轉(zhuǎn)移的過程中難免會造成細胞的丟失,加之CTCs本身的稀缺性,很容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。利用微流控芯片功能集成的特點則可以很好地解決這一問題,CTCs的捕獲、釋放、計數(shù)及檢測等操作均可在芯片上完成,連續(xù)的自動化處理可以有效減少人為誤差的干擾[16]。此外,微流控芯片所需要的進樣量非常小,可以大大減少珍貴樣品和試劑的消耗,降低檢測成本。并且在微尺度下表面力的作用會明顯放大,可以有效提高物質(zhì)混合和反應(yīng)的效率,實現(xiàn)快速高效的分離分析。因此,近年來多項研究嘗試利用微流控芯片平臺開展CTCs分離檢測工作,取得了良好的效果[17]。本文對微流控芯片技術(shù)用于CTCs分離檢測的相關(guān)研究進展進行了綜述,將采用的分離方法主要分為物理篩選和生物親和兩大類,同時囊括正向富集和反向富集兩種策略。此外,對于近期發(fā)展的芯片原位檢測CTCs新方法也進行了介紹。

1 CTCs分離芯片研究進展

作為商品化較為成功的CTCs分離檢測系統(tǒng),強生公司的CellSearch產(chǎn)品采用的是基于上皮細胞黏附分子(EpCAM)抗體特異性識別腫瘤細胞的方法[18],類似的方法在CTCs分離芯片中也被廣泛使用,可以視作利用生物親和作用進行CTCs分離富集的代表。另一方面,依據(jù)細胞在物理性質(zhì)方面的差異,無須生物標志物的條件下即可實現(xiàn)CTCs的篩選,其中有無外力介入的被動分離方法,例如利用微尺度下流體力學(xué)中的慣性效應(yīng)[19-21]和黏彈性效應(yīng)[22,23]來進行篩分。也有外加物理場的主動分離方法,諸如介電泳[24-26]、表面聲波[27,28]和光鑷技術(shù)[29]等。除了直接對CTCs進行特異性識別實現(xiàn)正向富集外,也可以通過選擇性結(jié)合諸如白細胞等干擾,再將其排除,從而達到反向富集的效果[30-32]。

1.1 基于生物親和作用的正向富集

由于利用EpCAM抗體來特異性識別腫瘤細胞的方法取得了不錯的成效,許多研究者就采用該方法構(gòu)建微流控芯片來篩選CTCs[33-35]。通過將EpCAM抗體修飾在芯片通道表面上,即可利用抗原抗體的結(jié)合作用來捕獲CTCs。但由于微通道中的流體通常呈低雷諾數(shù)的層流流動,物質(zhì)的混合僅能依靠橫向擴散,且只有接觸通道表面上的CTCs才可能被捕獲,擴散速率低和接觸面積小的問題導(dǎo)致CTCs的凈捕獲率較低。

為了解決這些問題,一般采用在芯片上增加微結(jié)構(gòu)或?qū)νǖ佬螤钸M行特殊設(shè)計的方法。Stott等[36]設(shè)計了一種人字形脊芯片,即在芯片通道上表面增添了長短臂交錯的魚骨狀槽道。根據(jù)流體力學(xué)模擬,這種結(jié)構(gòu)能夠使流體通過溝槽附近時產(chǎn)生側(cè)向的二次流,由此引起的渦流可以明顯增大混合效率,促使細胞與通道及溝槽表面充分接觸,從而提高對CTCs的捕獲率。采用人字形脊芯片進行全血樣分析,在1.2 mL/h的流量下得到的CTCs加標回收率為91.8%±5.2% (n=6),與直通道樣式的芯片相比有了顯著的提高。Sun等[37]采用微柱陣列結(jié)構(gòu)的芯片,構(gòu)建流動域和捕獲域的功能化分區(qū),并在捕獲域微柱上修飾EpCAM抗體,即便在整體流速較高的情況下,依然能保證CTCs的高捕獲率,大大提高了芯片在實際應(yīng)用時的通量。

然而芯片結(jié)構(gòu)的改善涉及加工工藝的問題,對于微結(jié)構(gòu)和微槽道的精密刻蝕,需要昂貴設(shè)備與專業(yè)技能的支持。為了避開這一難題,同時又能保證CTCs的捕獲率,以聚合物分子鏈或天然生物膜取代微結(jié)構(gòu)的方法被提出。Yu等[38]采用靜電紡絲技術(shù)在玻璃芯片基底上制備了呈隨機排列形貌的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米纖維(見圖1a), PLGA具有良好的生物相容性,利用其帶有末端羥基的性質(zhì),可以很方便地通過縮合反應(yīng)連接上生物素,再借助生物素與親和素的相互作用,即可修飾上EpCAM抗體。隨機排列的PLGA納米纖維構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),不僅可以有效防止因直接碰觸通道表面而導(dǎo)致的非特異性吸附,也大大提高了反應(yīng)接觸面積,從而增加了CTCs的凈捕獲率。通過加標回收的方式,測得該芯片對人體全血樣本中CTCs的捕獲率可達到90%。Jan等[39]利用相似原理,采用修飾有抗體的雜化硅納米線結(jié)構(gòu)來捕獲CTCs,并先后結(jié)合激光捕獲顯微分離技術(shù)、溫度控制及免疫競爭等方法研發(fā)了4代CTCs分離芯片,實現(xiàn)了CTCs捕獲后的單細胞分析和可控釋放。Sun等[40]則以帶有目標腫瘤細胞印跡的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜為模板,通過在印跡區(qū)域修飾EpCAM抗體來捕獲目標CTCs(見圖1b),細胞印跡的引入可以提高捕獲的特異性,減少假陽性結(jié)果的產(chǎn)生,改變印跡數(shù)目還可以控制芯片的捕獲容量。Wu等[41]采用EpCAM適配體功能化的白細胞納米囊泡來修飾芯片,構(gòu)建了多價納米流體界面(見圖1c),相較于普通的適配體功能化芯片,不僅捕獲效率提高了7倍,而且由于天然生物膜可減少對血細胞的非特異性吸附,捕獲純度也顯著提升。Cheng等[42]將帶有金納米顆粒涂層的3D導(dǎo)電支架集成在微流控芯片中,Au-S作用便于抗體功能化修飾和電化學(xué)釋放,支架的大孔結(jié)構(gòu)可以促進流體混合,高密度的納米金顆粒界面則能夠提高與細胞的相互作用。該系統(tǒng)不僅能夠可逆捕獲/釋放CTCs,還可以通過非特異性吸附損耗白細胞,提高回收的CTCs純度。

圖 1 基于生物親和原理的循環(huán)腫瘤細胞分離芯片F(xiàn)ig. 1 Microfluidics for separation of circulating tumor cells (CTCs) with biological property-based methods a. microfluidics with epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibody-modified nanofibers[38]; b. microfluidics with cancer cell-replicated surface[40]; c. microfluidics with fluidic multivalent membrane nanointerface[41]. PLGA: poly lactic-co-glycolic acid; PEG: polyethylene glycol; CellRePDMS: cell-replicated topological structure on the surface of polydimethylsiloxane; PBMC: peripheral blood mononuclear cell.

然而單純依賴EpCAM抗體的特異性識別作用來進行CTCs捕獲具有一個較大的缺陷,由于高度轉(zhuǎn)移性的CTCs可能經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,引發(fā)EpCAM表達明顯下調(diào),最終導(dǎo)致這部分CTCs被忽略,從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。Liao等[43]為了精確篩選出這部分EpCAM表達下調(diào)的CTCs,結(jié)合免疫捕獲芯片和光誘導(dǎo)介電泳(ODEP)技術(shù)進行了實驗探究。首先采用EpCAM抗體來標記腫瘤細胞、CD45抗體標記白細胞以及鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein AM)標記所有活細胞,則正常的CTCs表達為Calcein AMpos/EpCAMpos,干擾最大的白細胞表達為Calcein AMpos/CD45pos,經(jīng)歷了EMT的CTCs表達為CD45neg/EpCAMneg。然后利用ODEP技術(shù),根據(jù)熒光顯色情況的差異,即可在芯片主干通路與分支通路的交叉口實現(xiàn)CD45neg/EpCAMneg細胞的分選,且分離純度高達100%。該方法不僅可以用于捕獲因經(jīng)歷過EMT而被遺漏的CTCs,同時也為研究低EpCAM表達的腫瘤細胞提供了有效的手段。Wu等[44]在PLGA纖維化基底上同時修飾了EpCAM和N-鈣黏蛋白兩種適配體,在確保捕獲EpCAM表達正常的CTCs同時,也能夠減少EpCAM低表達CTCs的遺漏,可以提高整體捕獲率并減少假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

1.2 基于物理篩選方法的正向富集

物理篩選法依據(jù)的主要是細胞本身物理性質(zhì)的差異,相較于生物親和法而言,實驗操作往往更加簡單,無須進行化學(xué)修飾和生物標記,因此對細胞活性影響較小。效仿宏觀體系下的物理分離方法,微流控芯片上的物理篩選法通常依賴于外加物理場的誘導(dǎo),或是直接依據(jù)孔篩原理利用細胞大小差異來分離。Jahangiri等[45]依據(jù)不同種細胞間電極化常數(shù)的差異,通過在芯片上施加低頻交流電場,完成了對不同種乳腺癌CTCs和血細胞的分離。Gascoyne等[46]則在外加交流電場的條件下,利用介電場流分離(depFFF)的方法對血液中的CTCs進行分離篩選,依據(jù)細胞介電特性等的差異實現(xiàn)了CTCs的富集,細胞捕獲率超過90%,且對10 mL的臨床樣本進行處理僅需15 min,分離效率遠高于生物親和法。Wu等[47]利用表面聲波分離原理,通過外加聲場和表面聲波傳感器,依據(jù)大小、密度和形狀不同的細胞在駐波場中的排列分離,實現(xiàn)了外周血中CTCs的分選(見圖2a),在7.5 mL/h的通量下可得到86%以上的回收率。

然而外加場源在芯片上的集成化是比較困難的,因此Lin等[48]根據(jù)孔篩過濾原理設(shè)計了一種非常簡單的CTCs分離芯片。通過調(diào)控濾孔的大小,依據(jù)細胞尺寸的差異即可完成CTCs的分離,實驗所得回收率超過90%。Chen等[49]基于仿生脾竇微結(jié)構(gòu)構(gòu)建了孔篩式芯片系統(tǒng),裂隙結(jié)構(gòu)的濾孔相對于傳統(tǒng)的圓形結(jié)構(gòu)具有更低的流動阻力,通過流速和狹縫寬度的優(yōu)化,可以在實現(xiàn)高效分離的同時,保證CTCs的高細胞活性。但是由于白細胞與CTCs在大小上基本相當(dāng),該方法篩選精度較低,可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。此外,在細胞流動通路上設(shè)置濾孔容易因堵塞導(dǎo)致負壓增大,從而影響分離效率。為了解決上述問題,同時保留方法的便利性,研究人員對依據(jù)細胞尺寸實現(xiàn)CTCs篩選的方法進行了優(yōu)化,將起過濾作用的微柱結(jié)構(gòu)或捕獲腔室設(shè)置在側(cè)向,來避免由于細胞堵塞所引起的主干通路負壓過大的問題。Ren等[50]依據(jù)細胞尺寸和變形性的差異設(shè)計了一種高通量的CTCs捕獲芯片(見圖2b)。該芯片具有多條通道,且通道間由多排微型收縮管相連通,微型收縮管中有依據(jù)CTCs尺寸設(shè)計的捕獲腔。血液在流經(jīng)主通道與微型收縮管交匯處時,由于表面張力所產(chǎn)生的毛細作用會驅(qū)使流體通過收縮管,此時CTCs會被困在捕獲腔中,血液中其他組分則能順利通過,繼而進入相鄰?fù)ǖ?。為了保證較高的CTCs捕獲率,該過程可在多條通道間重復(fù)進行。采用該芯片對每毫升含有50個前列腺癌細胞的小鼠全血樣品進行處理,當(dāng)通道數(shù)達到6條時,CTCs捕獲率可超過95%。Liu等[51]將過濾的概念與確定性側(cè)向位移原理(DLD)相結(jié)合,設(shè)計了級聯(lián)DLD微柱陣列芯片,能夠在1 mL/min的高通量下實現(xiàn)96%的CTCs回收率,同時能夠剔除99.99%的白細胞。

圖 2 基于物理篩選方法的循環(huán)腫瘤細胞分離芯片F(xiàn)ig. 2 Microfluidics for separation of circulating tumor cells with physical property-based methods a. acoustic CTC separation chip[47]; b. sequential size-based chip[50]; c. inertial force-based straight chip[52]. WBC: white blood cell; SAW: surface acoustic wave; PDMS: polydimethylsiloxane.

依據(jù)細胞尺寸進行CTCs篩選的芯片中通常會有許多起物理阻隔作用的微結(jié)構(gòu),這些精密結(jié)構(gòu)的加工往往是比較困難的。隨著微尺度下流體力學(xué)理論的發(fā)展,基于微流體中顆粒運動規(guī)律的研究,出現(xiàn)了無須任何微結(jié)構(gòu),僅僅通過對流體的調(diào)控便可實現(xiàn)CTCs分離富集的方法。Kulasinghe等[52]依據(jù)微尺度下的慣性效應(yīng)設(shè)計了一種結(jié)構(gòu)十分簡單的方形通道芯片(見圖2c)。在方形管道中由于Dean渦與慣性升力的共同作用,在管道長邊中點附近會產(chǎn)生平衡位點,直徑大的細胞會優(yōu)先在該位點中心聚集。因此CTCs會富集在靠近通道中心處,其他組分則排布在外側(cè)。該芯片中沒有微結(jié)構(gòu)或捕獲腔來增加負壓,因此在處理通量上能有更高的突破,此外,由于無任何其他外部作用的影響,細胞能夠更好地保留其生理活性和形態(tài)特征。Lim等[53]同樣依據(jù)慣性效應(yīng),通過在T形通道處引入切向流,篩去靠近管壁側(cè)的血細胞,從而實現(xiàn)CTCs的分離。Zhang等[54]與Tian等[55]則利用非牛頓流體中的黏彈性效應(yīng)完成了對CTCs的分選,當(dāng)采用低黏度、無剪切稀化的流體時可達到與慣性效應(yīng)相近的效果。而且該方法的理論匯聚模式較為簡單,便于進行更為準確的數(shù)值模擬分析。Zhu等[56]以聚合物薄膜為材料,通過拼圖技術(shù)構(gòu)建了梯形通道的螺旋狀微流控芯片,利用梯形通道中的慣性力和Dean渦流綜合作用,可以在3 mL/min的高通量下實現(xiàn)CTCs的分選,實驗回收率為90%～94%。Lu等[57]設(shè)計的微流控芯片系統(tǒng)將微尺度流體力學(xué)和孔篩原理相結(jié)合,先通過慣性效應(yīng)完成對血細胞的初步分離,再利用三角微柱陣列實現(xiàn)對CTCs的捕獲,該方法在保證94.8%的高捕獲率的基礎(chǔ)上,通量可以達到40 mL/h。

圖 3 基于綜合作用的循環(huán)腫瘤細胞分離芯片F(xiàn)ig. 3 Microfluidics for separation of circulating tumor cells using integrated methods a. microfluidics integrating lateral filter arrays with immunoaffinity[62]; b. antibody-functional microsphere-integrated filter chip with inertial microflow[63]; c. deterministic lateral displacement (DLD)-patterned chip modified with multivalent aptamer-functionalized nanospheres[65]. AP: aptamer; GSH: glutathione.

上述CTCs分離芯片大都只關(guān)注于單個細胞,并沒有針對CTCs簇設(shè)計專門的選擇性分離方法?？紤]到CTCs簇的研究對于腫瘤學(xué)也具有非常重要的意義,Sarioglu等[58]設(shè)計了含有三角形微柱結(jié)構(gòu)的芯片對CTCs簇進行高精度分選。當(dāng)CTCs簇流經(jīng)三角微柱時,由于胞間連接作用會在其頂點處被捕獲,單個細胞則會直接沿著微柱側(cè)腰面通過,該方法要求流速不能過高,否則較大的剪切力會破壞CTCs簇的結(jié)構(gòu)致使捕獲失敗。采用該芯片對實際樣品進行分離,確定了CTCs簇的異質(zhì)性,并發(fā)現(xiàn)其中可能含有腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs),該發(fā)現(xiàn)對TAMs與CTCs間相互作用的研究具有重要意義。

1.3 生物親和與物理篩選相結(jié)合的正向富集

總體而言,基于生物親和作用和物理篩選方法的CTCs分離芯片各有其優(yōu)勢。前者選擇特異性更強,后者分離效率更高。同時二者也都存在不足之處,例如生物親和法依賴于外源性標記,往往會影響CTCs細胞活性,物理篩選法分離精度較低,容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此研究人員嘗試將兩種方法相結(jié)合[59-61],取長補短以實現(xiàn)更好的分離效果。Chen等[62]采用側(cè)向微柱陣列結(jié)構(gòu)的芯片,在微柱上修飾了EpCAM抗體,結(jié)合孔篩原理與免疫親和作用來提高CTCs的捕獲效率,同時由于主流場方向無阻塞,可以保證較高的通量(見圖3a)。Su等[63]利用相同的原理,在此基礎(chǔ)上引入表面功能化修飾的氧化鋅微球,大大提高了有效捕獲面積(見圖3b)。相似地,Chen等[64]先利用修飾了EpCAM抗體的磁珠去特異性結(jié)合CTCs,再讓樣品流經(jīng)橢圓微柱陣列區(qū),吸附了磁珠的CTCs變形性減弱,且由于外加磁場的作用不能通過窄間隙陣列,從而達到分離效果。利用該方法對11例不同癌癥臨床樣本進行分析,捕獲率超過90%,且即便在高流速下,細胞存活率也能達到96%。Song等[65]則結(jié)合確定性側(cè)向位移原理設(shè)計了多價核酸適配體納米微球(AuNP-SYL3C)修飾的芯片(見圖3c),尺寸和彈性不同的細胞在流經(jīng)轉(zhuǎn)角三角形微柱陣列區(qū)時,會因與微柱的碰撞選擇不同的路徑,通過調(diào)控微柱大小和間距,可使CTCs碰撞微柱時產(chǎn)生側(cè)向位移,其他血細胞則沿原路徑流出。此外,微柱上修飾有AuNP-SYL3C,通過核酸適配體多價效應(yīng)可以大大增強結(jié)合力,從而顯著提高對CTCs的捕獲性能,與單價核酸適配體修飾芯片相比,該方法的捕獲效率提高了3倍以上。

圖 4 基于反向富集策略的循環(huán)腫瘤細胞分離芯片F(xiàn)ig. 4 Microfluidics for negative enrichment of circulating tumor cells a. 3D-printed microfluidic device with immunocapture channels and microfiltration[66]; b. microfluidic chip integrated with DLD arrays and magnetic field[68]; c. CD45 antibody-based MACS combined with an inertial focusing chip[69]. MACS: magnetic activated cell sorting; RBC: red blood cell; PLT: platelet.

1.4 反向富集

由于白細胞與CTCs在尺寸上差別不大,在對血液中的CTCs進行分選時,白細胞往往是干擾最大的因素。因此可以通過選擇性分離白細胞,以達到CTCs富集的目的,也就是反向富集。采用反向富集的策略不僅能有效實現(xiàn)CTCs的分離,而且對于因EMT導(dǎo)致EpCAM表達下調(diào)的CTCs,甚至于非上皮性腫瘤細胞都可進行富集,同時也能夠避免直接標記對CTCs細胞活性產(chǎn)生影響。Chu等[66]利用3D打印構(gòu)建了功能化分區(qū)的微流控系統(tǒng)(見圖 4a),血液樣本先流經(jīng)修飾有CD45抗體的免疫捕獲區(qū),選擇性篩去白細胞,再通過3 μm孔徑的濾膜,除去小體積的紅細胞和血小板,從而實現(xiàn)CTCs的分離。Karabacak等[67]設(shè)計了集成雙芯片的分離體系,先通過DLD和慣性效應(yīng)兩種物理篩選法將白細胞和CTCs從血液中快速分離出來,再用修飾了CD45和CD66b復(fù)合抗體的磁珠來選擇性結(jié)合白細胞,繼而在外加磁場的誘導(dǎo)下實現(xiàn)白細胞與CTCs的精確篩分。該方法在保證高CTCs捕獲率的情況下,還能達到較高通量,處理8 mL血液樣本僅需2 h。Wang等[68]采用了相似的DLD-MACS(免疫磁珠分選)方法(見圖 4b)對肝癌患者臨床樣本進行分析,在60 μL/min的流量下得到CTCs的捕獲率為85.1%±3.2%,且實驗表明該方法對于EpCAM低表達的腫瘤細胞依然有很好的分離效果。Mishra等[69]設(shè)計的CTC分離芯片將免疫磁分選與慣性效應(yīng)相結(jié)合(見圖 4c),利用修飾多種抗體的免疫磁珠來標記白細胞,在外加強磁場和流體調(diào)控下可以實現(xiàn)CTCs和白細胞的高效分離,該芯片對CTCs的富集作用可以達到105倍,通量高達168 mL/h?；谖⒘骺丶夹g(shù)的各種CTCs分離方法匯總詳見表1。

2 芯片原位CTCs檢測

對于CTCs的檢測,通常采取先進行細胞染色,再用熒光顯微鏡觀察的方法[70],但該方法在靈敏度上有待提高,且重現(xiàn)性較差,需要手動操作和人工計數(shù)。近年來研究人員對芯片上的CTCs成像分析方法進行了優(yōu)化改良,Pahattuge等[71]研發(fā)的SMART-Chip將CTCs分選、細胞計數(shù)和免疫熒光成像模塊集成于一體,實現(xiàn)了對血液中CTCs分離檢測的全自動化操作,避免了人為干擾。Lee等[72]則通過多通道熒光成像,同時表征CTCs上的雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長因子受體2(HER2)表達狀況,完成對乳腺癌的快速診斷和分型。Wang等[73]在集成化的CTCs分離、免疫熒光染色和成像系統(tǒng)中引入了氣體驅(qū)動裝置,大大縮減了時間和試劑的消耗,能夠在90 min內(nèi)實現(xiàn)CTCs的捕獲和識別。Shi等[74]在集成化的微流控系統(tǒng)中實現(xiàn)了CTCs的單細胞分離和免疫染色鑒定,以及細胞的裂解和單細胞內(nèi)容物的靶向收集,不僅在單細胞水平上完成了CTCs的檢測,還為后續(xù)的單細胞RNA測序奠定了堅實的基礎(chǔ)。Wang等[75]反其道而行之,采用修飾CD45抗體的免疫微球來標記白細胞,通過楔形芯片完成血細胞初步分選后,可在明場顯微成像下直接區(qū)分出CTCs并通過圖像處理軟件實現(xiàn)自動計數(shù)。

表 1 基于微流控技術(shù)的循環(huán)腫瘤細胞分離方法Table 1 Separation methods of circulating tumor cells with microfluidics

此外,以熒光光譜為代表,一些常見的光譜檢測手段也被廣泛應(yīng)用在芯片上CTCs的檢測中。Wu等[76]用同時負載有抗體和熒光編碼的磁性納米顆粒來標記CTCs上的靶標蛋白,在外加磁場下利用芯片捕獲CTCs,并能通過熒光強度完成對單個CTC上表皮生長因子受體(EGFR)、HER2和EpCAM含量的表征(見圖5a)。Dhar等[77]通過液滴微流控技術(shù),將慣性渦流分離后得到的CTCs包裹在含有基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)反應(yīng)體系的液滴中,由于目標CTCs具有很高的MMP反應(yīng)活性,可由該酶促反應(yīng)體系產(chǎn)生的共振熒光轉(zhuǎn)移現(xiàn)象來實現(xiàn)對CTCs的檢測和計數(shù)。Shen等[78]設(shè)計了一種以金膜為基底的芯片,通過免疫磁性分離的方法對CTCs進行分選,之后采用基于表面等離子共振的近紅外熒光法實現(xiàn)對CTCs的觀察和檢測,由于近紅外區(qū)生物樣品基體光吸收和自發(fā)熒光強度很小,且表面等離子體共振效應(yīng)大大增強了熒光信號強度,該方法的檢測靈敏度與普通的熒光分析方法相比提高了近10倍。Cho等[79]采用修飾有抗體和拉曼信號分子的金納米顆粒來標記CTCs,通過表面增強拉曼技術(shù)即可對芯片上被捕獲的CTCs進行原位表征和檢測。該方法不僅具有高靈敏度,還可以依據(jù)拉曼信號峰的差異區(qū)分普通的CTCs以及循環(huán)腫瘤干細胞(CCSCs)。Reza等[80]結(jié)合表面增強拉曼和微流控技術(shù),在單細胞水平上實現(xiàn)了對CTCs多種蛋白標志物的原位動態(tài)監(jiān)測,CTCs在蛋白表達水平上的異質(zhì)性能夠反映更多的關(guān)鍵信息,為癌癥臨床診斷和治療提供判斷依據(jù)。

除了光學(xué)分析方法外,研究人員通過使用傳感元件實現(xiàn)了CTCs芯片檢測結(jié)果的數(shù)字化直讀或可視化分析。Chen等[81]以具有高電子遷移率的AlGaN/GaN為材料制作場效應(yīng)晶體管(FETs),在芯片上設(shè)置FETs傳感器陣列,并在其表面修飾上特異性識別EpCAM的核酸適配體,從而實現(xiàn)了CTCs的連續(xù)捕獲和計數(shù)。FETs的高跨導(dǎo)增益使得該生物電子傳感器具有很高的檢測靈敏度,實驗表明該方法能夠在較寬的動態(tài)范圍內(nèi)實現(xiàn)CTCs的快速自動化檢測,并能夠提供準確的細胞計數(shù)數(shù)據(jù)。Gao等[82]將采用復(fù)合免疫磁珠進行篩選的CTCs芯片與液滴數(shù)字PCR芯片相結(jié)合,通過PCR擴增來提高檢測的靈敏度。Abate等[83]在待測血樣中加入修飾有核酸適配體的鉑納米粒子(PtNPs),通過免疫磁性分離得到結(jié)合有PtNPs的目標CTCs,將其引入預(yù)載有H2O2和染料的檢測芯片中,由于Pt可以催化H2O2的分解,產(chǎn)生的氧氣會導(dǎo)致染料液柱的上升,根據(jù)液柱高度可以判斷血液中CTCs的含量(見圖5b)。Jian等[84]用修飾有葡萄糖氧化酶的磁性MOF納米顆粒來標記CTCs,芯片上的TiO2納米管陣列借由磁力完成對CTCs的捕獲后,通過TiO2的光催化作用將MOF中的Fe2+/Fe3+還原為Fe0,利用微分脈沖伏安法得到電化學(xué)信號,即可實現(xiàn)CTCs的定量檢測(見圖5c)。

圖 5 芯片原位檢測循環(huán)腫瘤細胞方法Fig. 5 On-chip analysis of circulating tumor cells a. optically combined encoding of single CTC on chip[76]; b. visual quantifiable detection of CTCs in a volumetric bar-chart chip[83]; c. electrochemical determination of iron ions leaking from CTCs by DPV technique[84]. BTC: bis(trichloromethyl)carbonate; magMOF: magnetic metal-organic framework; FITC-GOD: fluorescein isothiocyanate-glucose oxidase; CB: conduction band; VB: valence band.

3 總結(jié)與展望

本文對CTCs分離微流控芯片的技術(shù)原理、分離策略和研究進展進行了綜述。其技術(shù)原理主要分為物理篩選和生物親和兩大類,分離策略分為正向富集和反向富集兩個方向。同時,介紹了CTCs芯片原位檢測的主要技術(shù)方法和優(yōu)化策略。隨著微流控芯片技術(shù)的快速發(fā)展,其微尺度流體操控、微結(jié)構(gòu)加工和集成傳感檢測能力得到極大提升,進一步推動了CTCs分離微流控芯片技術(shù)的發(fā)展。多項研究顯示,以微流控芯片為平臺來分離檢測外周血中的CTCs,可以充分發(fā)揮芯片本身微量、高效、易于自動化和集成化的優(yōu)勢,最終實現(xiàn)對臨床血液中CTCs的快速精準分析,在腫瘤早期診斷、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移監(jiān)測以及抗腫瘤藥物評價等多個領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用空間。

現(xiàn)階段,CTCs芯片在篩選精度和篩選效率方面仍存在較大的提升空間。針對這一挑戰(zhàn),由于精準與高效二者難以兼得,未來的芯片設(shè)計應(yīng)該更專注于單個目標的實現(xiàn)。一方面,針對基礎(chǔ)研究,應(yīng)當(dāng)注重于提高CTCs篩選的細胞純度及細胞活性?？梢韵壤脩T性效應(yīng)對血液進行粗分離,篩分出尺寸較大的白細胞和CTCs。再采用液滴分選的方法,通過免疫磁性分離實現(xiàn)CTCs的精確篩選。液滴分選技術(shù)能夠達到單細胞分析的精度,利用液滴分選進行腫瘤細胞篩選也已有文獻報道[85]。另一方面,針對臨床檢測領(lǐng)域,研究重點則在于實現(xiàn)臨床樣本的高通量分析。可以采用電分析方法,依據(jù)不同種類細胞的比膜電容和細胞質(zhì)電導(dǎo)率差異來設(shè)置恰當(dāng)?shù)拈撝?對流經(jīng)檢測窗口的CTCs實現(xiàn)快速分析[86]。此外,微流控芯片技術(shù)屬于多學(xué)科交叉領(lǐng)域,CTCs芯片的發(fā)展同時也受益于微機電系統(tǒng)(MEMS)、材料學(xué)、流體力學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域的技術(shù)突破。隨著相關(guān)領(lǐng)域研究技術(shù)的發(fā)展,CTCs芯片未來有望成為腫瘤基礎(chǔ)研究和癌癥早期臨床診斷的重要平臺。