窖泥中揮發(fā)性物質和微生物群落的空間分布規(guī)律及其關系

張朝正，張?zhí)焖?，董思文，孫 偉，趙 華,

（1.天津科技大學生物工程學院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457；2.安徽文王釀酒股份有限公司，安徽臨泉 236400）

窖池是濃香型白酒的發(fā)酵裝置，其中窖泥的質量決定了濃香型白酒的品質[1?2]。在濃香型白酒發(fā)酵的過程中，窖泥中棲息的微生物在糟醅與窖泥接觸的界面長期接觸與反應，進行物質交換，進而產生各種香氣成分[3?4]。研究窖泥不同空間位置微生物分布與香氣成分的構成對深入理解窖泥在濃香型白酒生產中的作用具有重要意義。

窖泥中的揮發(fā)性物質的含量是表征窖泥優(yōu)劣的一項重要指標，是與糟醅相互交換的物質基礎。頂空固相微萃取（head-space solid-phase microextraction,HS-SPME）偶聯(lián)氣質聯(lián)用法（gas-chromatography mass spctromrtry, GC-MS）具有操作簡便、結果易于處理等優(yōu)點，近年來在窖泥和酒糟中揮發(fā)性物質的研究上應用廣泛[5?6]。對糟醅中香氣成分的空間分布研究發(fā)現(xiàn)，同層糟醅中距離窖泥越近的部分酯類和酸類含量越高，且呈逐步遞減趨勢，而醇類和醛酮類香氣成分的含量并未因空間位置的不同而呈現(xiàn)出顯著的差異[5]，表明糟醅酯類和酸類的形成和窖泥相關，而醇類和醛酮類的形成和窖泥關系不大。另一項研究表明窖泥中有機酸含量隨窖池深度的加深而增加[6]，結果和糟醅中的有機酸含量變化一致。對五糧液窖池中的窖泥和對應位置的出窖糟醅的香氣成分進行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)窖泥和對應的窖邊糟中的優(yōu)勢香氣成分高度相似，進一步研究發(fā)現(xiàn)窖邊糟中香氣成分含量顯著高于中心糟，表明窖泥和窖邊糟在白酒發(fā)酵過程中一直在相互作用，發(fā)生物質交換。

窖泥微生物中的優(yōu)勢菌群是維持窖泥微生物網絡結構穩(wěn)定、維持微生態(tài)平衡、進行微生物代謝和種間物質交換、產生重要香氣物質及其前體的主要微生物，并隨著空間深度的增加，不斷反應和富集，形成與窖泥的空間位置密切相關的規(guī)律，進而影響著酒體中的呈香物質組成。窖泥中微生物群落的組成受空間分布的影響，與窖泥所在的空間位置密切相關。利用16S rRNA基因克隆文庫技術分析了窖池上、中、底三個不同部位的窖泥中原核微生物，發(fā)現(xiàn)上層窖泥中微生物群落組成較為單一，中層和底層較為豐富[7]；高通量測序技術解析窖泥中微生物群落的多樣性，同樣得出在上部和下部的窖泥之間微生物群落組成存在差異的結論[8]。這些研究均表明，窖池中不同部位的窖泥中微生物組成的差異和窖泥中揮發(fā)性成分含量，尤其是與酸類和酯類的含量特別相關。

本研究以濃香型白酒窖池中不同空間位置的窖泥為研究對象，采取固相微萃取偶聯(lián)氣質聯(lián)用法，分析不同空間位置的窖泥中揮發(fā)性物質的種類及分布規(guī)律，利用高通量測序技術分析不同空間位置窖泥中的微生物種類和分布規(guī)律，探索微生物分布規(guī)律和揮發(fā)性風味物質的分布規(guī)律之間的關系，以期為研究不同空間位置的窖泥對酒質的影響提供數(shù)據(jù)支持，為濃香型白酒的實際生產提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

窖泥 取自安徽文王酒業(yè)老車間窖池3-122，分別取窖池的上部、中部、下部、池底的窖泥，每個部位按照前后左右取四個長約5 cm，直徑1.5 cm的圓柱形樣品，將四個樣品在低溫下均勻混合作為一個試樣。

手動SPME進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stableflex固相微萃取頭 默克Supelco公司；Agilent 7890-5975C氣質聯(lián)用儀 美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固相微萃取操作條件 先將萃取頭置于氣相質譜的進樣口處250 ℃老化30 min[9]，取窖泥樣品5 g置于20 mL頂空采樣瓶中，45 ℃恒溫水浴中加熱平衡30 min，然后頂空吸附萃取60 min，吸附結束后，將萃取頭插入GC-MS進樣口250 ℃解吸3 min。每個樣品重復取樣三次分析。

1.2.2 氣質聯(lián)用分析條件 色譜柱：CP-Wax 57 CB（60 m×0.25 mm×0.4 μm）；載氣：He；恒壓：33 cm/s；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，然后以3 ℃/min 升溫速率升至180 ℃，保持1 min；再以8 ℃/min上升至225 ℃，保持3 min。

質譜電離方式：EI；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：220 ℃；掃描方式：全掃描（full）；質量掃描范圍：m/z 33~450 amu；發(fā)射電流：100 μA。

1.2.3 窖泥高通量測序分析 將混合好的窖泥樣品取樣5 g，樣品送蘇州GENEWIZ生物科技有限公司做高通量測序，分析樣品中含有的細菌的種類和數(shù)量，所得數(shù)據(jù)通過軟件進行分析。

使用金唯智生物科技公司提供的Magen Hipure Soil DNA Kit試劑盒從窖泥樣本中提取DNA，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit試劑盒檢測DNA濃度。PCR擴增及文庫構建，以20~30 ng DNA為模板，使用金唯智生物科技公司設計的一系列PCR引物擴增原核生物16S rDNA上包括V3及V4的2個高度可變區(qū)。采用包含"CCTACGGRRBGCAS CAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含"GGA CTACNVGGGTWTCTAATCC"序列的下游引物擴增V3和V4區(qū)。另外，通過PCR向16S rDNA的PCR產物末端加上帶有Index的接頭，以便進行NGS測序。

PCR反應參數(shù)：預變性參數(shù)94 ℃ 3 min；變性參數(shù)94 ℃ 5 s，退火參數(shù)57 ℃ 90 s，延伸72 ℃ 10 s，共進行24個循環(huán)；終延伸參數(shù)72 ℃ 5 min。PCR擴增結果鑒定：PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測（表1）。

表1 PCR擴增條件Table 1 PCR amplification conditions

上機測序，通過Qubit3.0 Fluorometer（Invitrogen, Carlsbad, CA）檢測文庫濃度。將文庫定量到10 nmol/L，按Illumina MiSeq（Illumina, San Diego,CA, USA）儀器說明進行PE250/FE300雙端測序，由MiSeq自帶的MiAeq Control Software（MCS）讀取序列信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所用數(shù)據(jù)平行及重復次數(shù)均為3次，繪圖軟件使用R語言和GraphPad Prism 8。

揮發(fā)性物質的定性與定量分析利用隨機攜帶工作站，在NIST08和AMDIS標準譜庫檢索分析各組分質譜數(shù)據(jù)，確定分離得到的每個峰對應的風味物質，利用面積歸一化法計算各組分的相對含量，利用面積加和比較法計算不同空間位置窖泥中的總酸、總酯、總醇、總醛酮及總揮發(fā)性物質的相對含量。

使用Bcl2fastq（v2.17.1.14）軟件對測序結果原始圖像數(shù)據(jù)進行基本調用，使用CutAdapt（v1.9.1）、Vsearch（1.9.6）和Qiime（1.9.1）軟件對測序數(shù)據(jù)進行質量優(yōu)化，去除其中的嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)。對序列進行歸類操作，使用Vsearch（1.9.6）按照97%相似性對unique序列進行OUT聚類，在聚類過程中進一步去除嵌合體序列，將優(yōu)化后的序列與OUT代表序列進行比對，與OUT代表序列相似性在97%以上的序列為同一OUT[10]，統(tǒng)計生成OUT豐富表。根據(jù)OUT聚類分析結果，統(tǒng)計不同樣本共有和特有的OUT，使用R語言繪制韋恩圖。使用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析[11]，得到每個樣本在各個水平的群落組成。使用Qiime（1.9.1）軟件對有效序列進行隨機抽樣進行OUT分析，分別計算各α-多樣性指數(shù)，估計環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。

2 結果與討論

2.1 窖池中不同空間位置窖泥中揮發(fā)性物質的分析

對不同空間位置處的窖泥樣品進行分析，總離子流圖如圖1所示，通過檢索譜庫NIST08和AMDIS，分析確定窖泥中揮發(fā)性物質成分。不同空間位置窖泥中各類揮發(fā)性物質成分及相對含量見表2。

表2 揮發(fā)性物質成分表及相對含量（%）Table 2 Volatile substance composition table and relative content (%)

圖1 窖泥中揮發(fā)性物質的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in pit mud

由圖2和表3得到的分析結果可知，窖泥中含有豐富的揮發(fā)性風味物質，但是不同空間位置的窖泥中這些揮發(fā)性物質的分布差異明顯。初步鑒定出池壁上部窖泥樣品中主要揮發(fā)性物質組分有25種，其中醛酮類4種（49.48%）、烴類10種（30.47%）、酚類2種（5.21%）、酯類5種（7.68%）、酸類1種（4.08%）、醇類3種（3.10%），其中最主要的揮發(fā)性物質是苯甲醛（40.03%）和5-（1,5-二甲基-4-己烯基）-2-甲基-，[S-（R*，S*）]-1,3-環(huán)己二烯（15.54%）。池壁中部窖泥樣品中的主要揮發(fā)性物質組分有15種，其中酯類3種（67.13%）、醇類3種（19.08%）、酸類2種（5.88%）、酚類2種（4.26%）、醛酮類4種（3.46%）、烴類1種（0.17%），其中最主要的揮發(fā)性風味物質是己酸己酯（60.98%），其次是1-己醇（11.43%）。池壁下部窖泥樣品中的主要揮發(fā)性物質組分有25種其中酯類14種（66.56%）、酸類6種（31.80%）、醇類3種（1.02%）、酚類2種（0.63%），其中最主要的揮發(fā)性物質是己酸乙酯（19.94%）、己酸（17.79%）、辛酸乙酯（15.52%）、己酸己酯（14.58%）；池底窖泥樣品中的主要揮發(fā)性物質組分有31種，其中酯類18種（76.35%），酸類5種（19.37%）、醇類4種（3.42%）、酚類2種（0.57%）、醛酮類1種（0.26%）、烴類1種（0.04%），其中最主要的揮發(fā)性物質是己酸己酯（28.62%）、辛酸乙酯（14.98%）、己酸乙酯（13.02%）、己酸（12.26%）。

圖2 不同空間位置窖泥中各類揮發(fā)性物質的相對含量Fig.2 The relative percentages and types of various volatile substances in pit mud in different spatial locations

2.1.1 酯類物質 由圖2-a可知，窖泥池壁上部含有的酯類相對含量較少，中下底部遠遠高于池壁上部，且圖3中池壁下部和底部酯類的種類數(shù)也較多，池底最多為18種。池壁中部雖然含有較多的酯類物質，但種類數(shù)只有3種。窖泥中所含酯類的峰面積總量隨窖池深度的增加呈現(xiàn)大幅遞增趨勢，從池壁上部峰面積1.66×108增加到池底部276.63×108。表2中，己酸己酯、辛酸乙酯、苯丙酸乙酯為四組窖泥樣品中共有成分，其中，己酸己酯由池壁中部位置處開始大量生成，成為池壁中部的主要酯類，占比60.98%，隨著窖池深度的增加，酯類物質種類逐漸豐富，己酸己酯在酯類中的占比降低，池壁下部14.58%、池底部28.62%，但生成己酸己酯的量在增加。原因可能是在池壁上部，未能構成良好的厭氧環(huán)境，厭氧菌豐度不夠未能成為優(yōu)勢菌屬，不能將營養(yǎng)物質完全分解轉化，產生的酸類和醇類等酯類的前體物質較少，故生成的酯類物質較少。

圖3 不同空間位置窖泥中各類揮發(fā)性物質的種類數(shù)Fig.3 The relative types of various volatile substances in pit mud in different spatial locations

2.1.2 酸類物質 由圖2-b和圖3可知，窖泥池壁下部所含酸類物質的種類最多為6種，相對含量與其他位置相比最高，池底部次之，池壁上部和池壁中部所含酸類物質種類數(shù)和相對含量都較少。窖泥中所含酸類物質的峰面積總量隨窖池深度的增加而增加，下底部增長較大，由池壁上部0.88×108增加到中部4.48×108再到池壁下部65.67×108和池底70.14×108。表2顯示己酸均在四組窖泥樣品中檢測到，這與己酸己酯的分布一致，且己酸的含量呈現(xiàn)大幅增加趨勢，這可能與產生己酸的菌群為厭氧菌群有關。

2.1.3 醇類物質 在圖3中，窖泥各空間位置所含醇類物質種類數(shù)無明顯差異，其中，池壁上、中、下部均含有3種，池底含有4種醇類物質。圖2-c中池壁中部所含醇類物質的相對含量遠遠高于其它位置處，為19.08%。由表2可知，1-辛醇和1-己醇在四組窖泥樣品中均可被檢測到， 池底的醇類物質含量較池壁下部多，池壁中部最多?？赡苁且驗樵诔乇谥胁浚驙I養(yǎng)豐富、環(huán)境適宜，大量微生物生長繁殖，豐度提高，對營養(yǎng)物質的分解較為充分，醛酮類和烴類物質大幅減少，醇類大量生成。

2.1.4 酚類物質 在圖2-d中，窖池不同深度窖泥所含酚類物質均為2種，為苯酚和4-甲基苯酚。池壁上、中部酚類物質的相對含量大于池壁下部和池底。池壁上部的4-甲基苯酚含量高于其余部位，4-甲基苯酚可能與厭氧程度相關[12]。

2.1.5 醛酮類物質 圖2-e和圖3中，池壁上部所含醛酮類物質相對含量遠遠高于其它位置處窖泥，達到了49.48%，池壁中部含有四種醛酮類物質，相對含量為3.46%；池壁底部僅有一種，相對含量為0.26%；池壁下部則無醛酮類物質。濃香型白酒生產原料主要為糧食，其細胞壁中含有木質素。窖泥中的微生物將木質素降解，氧化生成苯酚類物質和芳香醛類物質[13]。故而丁香醛等物質多在池壁上部和中部被檢測到。

2.1.6 烴類物質 由圖2-f和圖3可知，烴類物質較多的存在于窖泥池壁上部，10種相對含量為30.47%；池壁的中部和底部都只含有一種，相對含量各自為0.17%和0.04%；池壁下部未檢測出烴類物質。釀酒生產過程中，釀酒的原料主要與池壁上部接觸，木質素含碳量較高，被降解形成烴類物質，未能構成良好的厭氧環(huán)境，厭氧菌豐度不夠未能成為優(yōu)勢菌屬，未能將烴類進行進一步的轉化，導致烴類物質較多地在上部被檢測到。

窖池不同空間位置處窖泥含有的揮發(fā)性物質主要有酯類化合物、醇類化合物、酸類化合物、酚類化合物、醛酮類化合物、烯烴類化合物，這些物質與白酒中呈香化合物基本一致[14]。其中，酯類、酸類和醇類的種類數(shù)較多，且含量呈現(xiàn)出隨著窖池深度的增加逐步增加的趨勢。這可能是因為窖池中糟醅的水分由上自下逐漸浸落，部分微生物逐漸在窖池的下底部富集，因此窖池下底部的原核微生物群落與中上層存在明顯差異的同時也具有一定的相似性[15]，也進一步證明了白酒中風味物質的產生位置主要在窖池的中部以下。不同空間位置的窖泥中優(yōu)勢菌群構成存在差異，影響著代謝反應循環(huán)，進而影響著酒體中的呈香物質組成，例如己酸菌發(fā)酵產生己酸、丁酸和少量的乙酸[16]；有機酸代謝過程中會產生氫，存在著微生物代謝控制的底物抑制現(xiàn)象，窖泥中的甲烷菌和硝酸鹽還原菌均具有解除產酸菌的氫抑制現(xiàn)象[17]，促使有機酸的產生。

綜上所述，窖泥中含有的烯烴類物質和醛酮類物質較多分布在池壁的上部，在池壁中下部和池底窖泥中存在較多的揮發(fā)性物質主要是酯類、醇類和酸類。不同位置主要揮發(fā)性成分存在差異是由于窖池中不同部位的厭氧程度決定的[18]。窖池的中部及以下厭氧性明顯強于窖池上部，利于窖泥中厭氧菌的生長和代謝，對有機質的分解代謝較徹底[19]，利用營養(yǎng)物質代謝生酸并酯化，因此烯烴類物質較少，而醇、酸類物質較多，進一步反應生成酯類物質也較多[20]。在池壁下部和池底，由于厭氧環(huán)境良好，厭氧菌屬和耐高酸等惡劣環(huán)境的菌屬如梭菌屬等成為優(yōu)勢菌屬，能將纖維素、半纖維素等降解為含碳物質[21]，還能為酒香中重要的風味物質己酸乙酯的合成提供前體物質，對窖池中微生物群落的結構組成擁有調控能力，故而在這一空間位置能充分生成酯類和酸類等呈香性物質。說明長期低氧環(huán)境更有利于窖泥中的微生態(tài)系統(tǒng)的完善[22]和有機質的分解。

2.2 窖池中不同空間位置窖泥中的微生物群落分布分析

2.2.1 窖泥中微生物群落的α-多樣性 群落生態(tài)學中，α-多樣性通過一系列統(tǒng)計學指數(shù)的分析來估計環(huán)境群落的物種豐度和多樣性[23]。計算菌群豐度的指數(shù)有ACE和Chao指數(shù)，ACE是用來估計群落中含有OUT數(shù)目的指數(shù)，Chao是用Chao1算法估計樣本中所含OUT數(shù)目的指數(shù)[24]，ACE和Chao指數(shù)越大，說明群落中含有的OUT數(shù)目越多，群落的豐富度越大。計算菌群多樣性的指數(shù)有Shannon和Simpson指數(shù)，Shannon用來估算樣本中微生物多樣性[25]，值越大說明群落多樣性越高，Simpson在生態(tài)學中反映優(yōu)勢種在群落中的地位和作用。通過對原始序列進行質量控制和優(yōu)化，共得到了65688條有效序列，平均長度為449.72 bp。每個窖泥樣品中的序列數(shù)量從126576~163696個不等。且池壁中部窖泥中的序列數(shù)量最多，池底窖泥中的序列數(shù)量最少。

Observed OUT表示含有的物種數(shù)目，由表3可知，池底部和池壁中部的窖泥物種豐富度較高，池壁下部稍少于池壁中部，池壁上部的窖泥中物種豐富度最低。Shannon指數(shù)從2.130增加到4.970，Simpson指數(shù)從0.557增加到0.932，均隨著窖泥深度的增加而增加，表明不同空間位置窖泥的物種多樣性隨窖泥深度的增加呈現(xiàn)增加的趨勢，池壁中下部和底部的Simpson指數(shù)增長較為平緩，表明中下底部窖泥物種多樣性增加的同時趨于穩(wěn)定，且池壁中下部和池底的窖泥中微生物多樣性顯著高于池壁上部。ACE指數(shù)由70.026增加到112.271，隨后有小幅度降低，又由99.510增加到114.523。Chao1指數(shù)由67.51增加到112.00，小幅降低至98.50，再增加到114.50。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)表明窖泥微生物物種豐富度呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，池底的物種豐富度最高。Chao1、Shannon、Simpson、ACE指數(shù)均表明，在整個窖池中，池底的窖泥中微生物物種多樣性和物種豐富度最高。

表3 不同空間位置窖泥中微生物群落的α-多樣性Table 3 α-Diversity of microbial communities in pit mud in different spatial locations

2.2.2 不同空間位置窖泥中微生物群落門、綱水平的變化 根據(jù)圖4 OTU注釋，共鑒定出10個門，其中細菌門9個，古細菌門1個。共發(fā)現(xiàn)8個優(yōu)勢菌群（平均豐度>0.1%），占每個樣品細菌總數(shù)的98.86%~99.93%，其中厚壁菌門（Firmicutes）為絕對優(yōu)勢菌群。窖池上部優(yōu)勢菌群由高到低的順序為：厚壁菌門（Firmicutes）>廣古菌門（Euryarchaeota）> 擬桿菌門（Bacteroidetes）>變形菌門（Proteobacteria）；池壁中部和下部優(yōu)勢菌群由高到低的順序較為相似：厚壁菌門（Firmicutes）>擬桿菌門（Bacteroidetes）>廣古菌門（Euryarchaeota）>互養(yǎng)菌門（Synergistetes）>軟壁菌門（Tenericutes）>放線菌門（Actinobacteria）；窖池底部由高到低分別為：厚壁菌門（Firmicutes）>廣古菌門（Euryarchaeota）>放線菌門（Actinobacteria）>擬桿菌門（Bacteroidetes）>暗黑菌門[26]（Atribacteria）>互養(yǎng)菌門（Synergistetes）>軟壁菌門（Tenericutes）。隨著窖池深度的增加，窖泥中的優(yōu)勢菌群逐漸由4個類群向多個菌群轉變，最后又回到單一的絕對優(yōu)勢菌群，厚壁菌門數(shù)量先減少后增加，其他優(yōu)勢菌群均有不同程度的先增加后減少最后在池壁底處最少。

圖4 窖池不同空間位置微生物群落門水平（a）和綱水平（b）的分布Fig.4 Levels of phylum microflora（a）and class microflora（b）in pit mud samples at different spatial locations

在綱水平上，從所有窖泥樣品中檢測到15類原核微生物。共發(fā)現(xiàn)6個優(yōu)勢菌群（平均豐度>1%），從高到低的順序為：梭菌綱（Clostridia）>桿菌綱（Bacilli）>擬桿菌綱（Bacteroidia）>甲烷 微菌綱（Methanomicrobia）>互養(yǎng)菌綱（Synergistia）>甲烷桿菌綱（Methanobacteria）。池壁中部和池底窖泥中都有豐富的細菌分布，池壁下部和池壁上部次之。梭菌綱的含量隨著窖池深度的增加而逐漸增加，在池壁下部和池底窖泥中達到最高；桿菌綱的含量則隨著窖池深度的增加而逐漸減少，在池壁下部和池底的窖泥中接近于0；擬桿菌綱和互養(yǎng)菌綱的含量隨著窖池深度的增加逐漸增加，并在池底部時降到最低；隨著窖池深度的增加，甲烷微菌綱和甲烷桿菌綱的數(shù)量呈現(xiàn)先降低再增加再降低的規(guī)律。窖泥微生物的群落組成因處于窖池的不同空間位置而具有明顯的空間差異性。

2.2.3 不同空間位置窖泥中微生物群落優(yōu)勢菌屬水平的變化 在屬水平上，從4個不同空間位置的窖泥樣品中檢測到64個可識別屬和未分類屬。對每份窖泥樣品中1%以上核心屬進行統(tǒng)計分析，共有21個核心屬，含量分別為98.43%（池壁上部）、85.01%（池壁中部）、85.65%（池壁下部）、77.73%（池底），表明池壁底是窖泥中微生物最復雜的位置。

本研究選取每個樣品的前30個屬進行熱譜分析，從較小的分類水平上揭示窖泥中微生物群落組成的差異。結果如圖5所示，通過熱圖的顏色差異可直觀顯示物種的相似性和差異性。前30個屬占比分別占每個樣品的88.79%~99.2%。根據(jù)圖6可知，池壁上和池壁中、池壁下和池壁底明顯地被分為兩個聚類，下底部窖泥中微生物結構與中上部存在部分相似性又存在較大的差異性。在窖池上部，芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina）的含量最高，隨著窖池空間位置的增加逐漸降低，在窖池的下底部含量幾近為零，符合多分布于泥土表面的習性。Sedimentibacter、Unclassified_Unclassified、f_Syntrophomonadaceae_Unclassified、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、Caproiciproducens等屬的變化規(guī)律大體相同，都隨著窖池空間位置的增加逐漸增加；部分菌如互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、Petrimonas、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、Proteiniphilum等則呈現(xiàn)從池壁上至池壁下先增加后在池壁底部降低的規(guī)律。說明窖池中微生物種類的空間分布與窖池的空間位置有關。

圖5 每個樣品中TOP30微生物屬水平分布熱圖Fig.5 Heat map of the horizontal distribution of TOP30 microorganisms in each sample

圖6 不同空間位置窖泥基于OUT水平的韋恩圖Fig.6 Venn diagram of OTU level in pit mud samples at different spatial locations

梭菌屬（Clostridium）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、Sedimentibacter、泰氏菌屬（Tissierella）、Garciella等梭菌科屬是生成丁酸、己酸等酯類前體物質的重要菌群，其他優(yōu)勢菌屬Petrimonas、Proteiniphilum等微生物的代謝產生物也構成白酒中的重要風味物質或風味物質前體。本研究中檢出的優(yōu)勢古菌屬中，甲烷菌屬（Methanobacterium）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷囊菌屬（Methanoculleus）屬氫營養(yǎng)型甲烷菌[27]，而氫營養(yǎng)型產甲烷古菌可以H2為代謝底物促進己酸的合成[15]，甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）可同時利用乙酸和H2，這些甲烷菌可以通過種間作用來實現(xiàn)己酸乙酯產量的提升。這些優(yōu)勢菌群都是維持窖泥微生物網絡結構穩(wěn)定、維持微生態(tài)平衡、進行微生物代謝和種間物質交換、產生重要香氣物質及其前體的主要微生物，并隨著空間深度的增加，不斷反應和富集，形成與窖泥的空間位置密切相關的規(guī)律。

韋恩圖中不同顏色的圈表示不同的樣本分組，圖中數(shù)字代表每個樣本分組特有或共有的OUT數(shù)目，最中間數(shù)字表明所有樣本分組共有的OTU數(shù)目。根據(jù)OUT聚類分析結果，由圖6可知，共有屬部分數(shù)量為51種，占43.59%，池壁上含有特種屬，數(shù)量和占比分別為2和1.71%，池壁中下部和池底窖泥中微生物群落較池壁上部具有更大的相似性。

2.2.4 多樣本比較分析β-多樣性值為兩個樣本間的相異系數(shù)，反映不同樣本間的多樣性的差異。

樣本點之間距離表明了樣本中功能分類分布的相似性，距離越近，相似度越高。圖7-a中，在主成分1（PC1）的條件下，樣本中池壁上部和池壁中部極為接近，相似度較高，與池壁下部和池底部存在差異。在主成分2（PC2）的條件下，樣本中的池壁下部和池底距離極為接近，與池壁中部較為相近，相似度較高，與池壁上部距離較遠，存在較大差異性。非度量多維尺度法是根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點的形式反應在多維空間上，通過點與點之間的距離來反映不同樣本間的差異程度。圖7-b中，每一個點代表一個樣本，表明窖泥池壁上部的菌群組成與窖泥池壁中下底部的菌群組成存在明顯差異，而窖泥池壁中部和池壁下部菌群結構組成類似。β-多樣性分析表明，窖泥中的群落結構隨著窖泥空間位置的加深與環(huán)境因子相互作用而逐漸趨于穩(wěn)定，空間位置在一定程度上影響了窖泥中原核微生物群落的α-和β-多樣性，這主要是由于不同位置窖泥的理化性質不同所致，這是影響微生物群落多樣性變化的根本因素[28]。

圖7 PCA圖（a）和非度量多維標度分析（b）Fig.7 PCA diagram(a) and non-metric multidimensional scaling analysis(b)

2.3 窖池中不同空間分布窖泥中揮發(fā)性物質分布和微生物群落分布之間的關系

本研究發(fā)現(xiàn)窖池下部和池底窖泥中的原核菌群的豐度和多樣性[29]要高于窖池上部和中部的窖泥，這與揮發(fā)性物質的種類分布規(guī)律相吻合，與窖池下部和底部長期良好的厭氧環(huán)境有關，與高酸環(huán)境也有一定關聯(lián)。生孢產氫菌（Hydrogenispora）在窖池的各個空間位置均有分布，主要產物是乙酸、乙醇和氫等[30]。在池壁上部，芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina）為上層的優(yōu)勢菌屬，能發(fā)酵產生二氧化碳和乙酸等，但因厭氧環(huán)境較差，厭氧菌豐度不夠，不能將營養(yǎng)物質完全分解，導致烯烴類和醛類物質較多；池壁中層窖泥擁有豐富的營養(yǎng)物質，環(huán)境因子較為適宜，原核微生物群落的多樣性也反映著豐富的風味物質組成，優(yōu)勢菌群如柯生菌屬（Fastidiosipila）等梭菌屬菌群豐度增加，白酒呈香性物質中重要的己酸乙酯及其前體物質等含量也開始增加；池壁下部和底部窖泥因長期處于良好的厭氧環(huán)境中，適宜在極端生長環(huán)境中的原核微生物充分代謝反應，甲烷細菌屬（Methanobacterium）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷囊菌屬（Methanoculleus）屬等甲烷菌，在促進己酸的合成的同時，還可以通過種間作用與己酸菌共生共養(yǎng)[31]，實現(xiàn)己酸和己酸乙酯產量的提升，在此空間位置豐度較高的微生物物種，對窖池中的微生物群落結構組成擁有調控能力，故而在這一空間位置能充分生成酯類和酸類等呈香性物質。隨著窖泥空間位置的加深，越靠近下層厭氧環(huán)境越好，厭氧菌在下底部大量沉積繁殖，在發(fā)酵過程中產生的醇、醛、酸、酮、酯等代謝產物不僅為酒體的呈香物質，部分還能作為生長因子或代謝前體物質促進微生物的生長繁殖，為多樣的風味物質組成提供了物質基礎。

3 結論

隨窖池深度的增加，揮發(fā)性物質總量也在逐漸增加,峰面積總量由池壁上部21.65×108增加到池底部362.31×108。其中酯類和酸類種類較多，占比達到73.01%~98.36%。窖泥樣品中池壁下部和池底部窖泥中的微生物菌群豐度和多樣性高于池壁上部和中部，這與揮發(fā)性物質的種類和含量分布規(guī)律相吻合。微生物門水平上優(yōu)勢菌群占細菌總數(shù)的98.86%~99.93%，厚壁菌門為絕對優(yōu)勢菌群。梭菌屬和甲烷菌屬等優(yōu)勢菌屬是進行微生物代謝和種間物質交換、產生重要香氣物質及其前體的主要微生物，并隨著空間深度的增加，不斷反應和富集，形成與窖泥的空間位置密切相關的規(guī)律?？臻g差異性是導致窖泥不同空間位置原核微生物菌群和揮發(fā)性物質成分存在差異性的重要原因。

窖泥生態(tài)系統(tǒng)中蘊藏著一個與窖泥密切相關的復雜原核生物群落[32?33]，微生物群落與風味物質之間并非簡單的一一對應的關系。本項研究聯(lián)系了窖泥空間特征對原核生物群落的影響及揮發(fā)性物質的空間分布規(guī)律，研究結果對于不同空間位置窖泥中微生物群落的分布規(guī)律及其間的原核生物群之間的相互作用起到一定的參考，對酒質的影響提供數(shù)據(jù)支持。