硫酸鹽還原菌原位合成納米硫化亞鐵還原Cr（Ⅵ）

胡 凡，陳元彩，胡勇有，程建華

（華南理工大學(xué) 環(huán)境與能源學(xué)院工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006）

鉻污染物主要來(lái)源于電鍍、染料、制革、木材防腐等行業(yè)排放的工業(yè)廢水，常以Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）兩種價(jià)態(tài)存在［1］。Cr（Ⅵ）具有四面體結(jié)構(gòu)，可通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，破壞生物體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其生物毒性是Cr（Ⅲ）的100倍［2］。因此，處理含鉻廢水的主要目標(biāo)是將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）。傳統(tǒng)的物理化學(xué)法費(fèi)用高，存在二次污染。生物法因其兼具經(jīng)濟(jì)與環(huán)境效益而受到廣泛的重視［3］，但微生物代謝過(guò)程中緩慢的電子傳遞速率以及重金屬的生物毒性效應(yīng)限制了生物修復(fù)在廢水處理領(lǐng)域的應(yīng)用［4］。

納米硫化亞鐵（Nano-FeS）由于具有良好的吸附性、還原性被廣泛應(yīng)用于水中污染物的處理。生物合成的Nano-FeS不僅能克服納米粒子不穩(wěn)定、易團(tuán)聚的缺陷，還能彌補(bǔ)細(xì)胞膜導(dǎo)電性差的短板［5］，為微生物的胞外電子傳遞提供電子傳輸通道，加快胞外呼吸速率［6］。因此利用微生物合成Nano-FeS是一種很有前景的廢水原位處理方法。

本研究利用硫酸鹽還原菌（SRB）原位合成Nano-FeS，構(gòu)建Nano-FeS協(xié)同SRB（Nano-FeS@SRB）體系還原Cr（Ⅵ），為含Cr（Ⅵ）廢水的處理提供新的思路和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑和儀器

FeCl2·4H2O、NaOH、H2SO4（98%（w））、重鉻酸鉀、卡那霉素：均為分析純。

MLS-3705型高壓滅菌鍋：日本三洋公司；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)：北京松源華興公司；DR 6000型紫外-可見分光光度計(jì)：美國(guó)哈希公司；PH3C型臺(tái)式pH計(jì)：上海儀點(diǎn)科技儀器股份有限公司；BT125D型電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；CHI832D型電化學(xué)工作站：上海辰華儀器有限公司。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液：Na2SO40.72 g/L，K2HPO4·3H2O 0.60 g/L，NH4Cl 1.00 g/L，MgCl2·6H2O 0.06 g/L，乳酸鈉2 mL/L。

1.2 Nano-FeS@SRB體系的構(gòu)建

配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液1 L，用0.5 mol/L的NaOH溶液和1.0 mol/L的H2SO4調(diào)節(jié)pH至7.0。為避免乳酸鈉在高溫條件下發(fā)生反應(yīng)，將乳酸鈉放入超凈臺(tái)開啟紫外燈滅菌30 min以上，其他培養(yǎng)基物質(zhì)在121 ℃滅菌30 min，將乳酸鈉與其他培養(yǎng)基物質(zhì)混合后再加入0.15 g FeCl2·4H2O。

取200 mL上述培養(yǎng)基溶液置于250 mL的厭氧瓶中，將培養(yǎng)好的SRB加入培養(yǎng)基中，使最終OD600= 0.1。向厭氧瓶中通入氮?dú)?5 min后立即封閉，并將其置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為140 r/min。7~9 d后，將得到的Nano-FeS@SRB溶液在厭氧工作臺(tái)中用氮?dú)獯得撨^(guò)的去離子水洗滌，離心并收集。

1.3 Nano-FeS@SRB體系還原Cr（Ⅵ）

取SRB和Nano-FeS@SRB溶液各10 mL，用去離子水洗滌，離心吸除上清液后，分別加入200 mL Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度為10 mg/L或20 mg/L的K2Cr2O7溶液（模擬含鉻廢水）。每隔一定時(shí)間吸取10 mL上清液測(cè)定溶液中Cr（Ⅵ）的質(zhì)量濃度。

1.4 分析表征方法

采用二苯碳酰二肼分光光度法［7］（GB 7467—1987）測(cè)定溶液中Cr（Ⅵ）的質(zhì)量濃度；采用考馬斯亮藍(lán)分光光度法［8］測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；采用X射線衍射儀（Empyrean型，荷蘭帕納科公司）和X射線光電子能譜儀（UlraDLD型，英國(guó)Kratos公司）對(duì)反應(yīng)前后的物質(zhì)進(jìn)行表征。

1.5 Nano-FeS對(duì)微生物電子傳遞性能的影響實(shí)驗(yàn)

1.5.1 電化學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用循環(huán)伏安法（CV）和恒電位法（I-t）測(cè)定微生物的電化學(xué)性能。采用標(biāo)準(zhǔn)三電極電解池，使用鉑絲作對(duì)電極、玻碳電極為工作電極、Ag/AgCl電極為參比電極［9］，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液（pH=7.0）作電解液。實(shí)驗(yàn)前對(duì)玻碳電極進(jìn)行拋光打磨，并將電解池中的電解液通氮?dú)?5 min，去除其中的氧氣后，將通氣管提高到液面上方繼續(xù)通氮?dú)庖员３謪捬醐h(huán)境。隨后吸取洗滌離心后的SRB和Nano-SRB@FeS溶液各10 μL至工作電極表面，并加入適量1% Nafion溶液固定，待自然晾干固定后分別進(jìn)行測(cè)試。循環(huán)伏安法中設(shè)置電勢(shì)增量6 mV，脈沖幅度60 mV，脈沖寬度0.2 s，掃描范圍-0.8~0.8 V，掃描速率10 mV/s。恒電位法中電壓控制在-0.40 V。

1.5.2 電子傳遞抑制劑實(shí)驗(yàn)

取SRB和Nano-FeS@SRB溶液各10 mL，洗滌離心吸除上清液后分別加入K2Cr2O7溶液。通過(guò)加入不同的電子傳遞抑制劑（0.2 mmol/L雙香豆素；0.1 mmol/L辣椒素和0.1 mmol/L魚藤酮混合物；0.2 mmol/L噁唑菌酮）阻斷Cr（Ⅵ）還原過(guò)程中的生物電子傳遞，來(lái)判斷Nano-FeS的主要作用位點(diǎn)。

1.6 Nano-FeS@SRB體系還原Cr（Ⅵ）的單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度（5，10，15，20，25 mg/L）、溫度（25，30，35，40 ℃）和pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）對(duì)Nano-FeS@SRB體系還原Cr（Ⅵ）效果的影響，24 h后測(cè)定溶液中殘留Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度，并計(jì)算Cr（Ⅵ）去除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征結(jié)果

Nano-FeS@SRB的XRD譜圖見圖1。由圖1可見：在2θ為16.35°、28.52°和50.50°處有四方硫鐵礦FeS的特征峰，分別對(duì)應(yīng)著FeS在（010）、（111）和（122）晶面的衍射峰，證實(shí)了FeS的形成。結(jié)晶性差是由于中性pH條件和較短的生長(zhǎng)周期導(dǎo)致的［10-11］。

圖1 Nano-FeS@SRB的XRD譜圖

Nano-FeS@SRB的XPS譜圖見圖2。由圖2a可見：Fe 2p的峰位置在709.6，713.2，725.6 eV處，分別對(duì)應(yīng) Fe（Ⅲ）—S、Fe（Ⅲ）—O和Fe（Ⅱ）—S［12-15］，其中FeS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53%，表明在制備過(guò)程中FeS表面發(fā)生了部分氧化。由圖2b可見：S 2p的峰位置在161.0，162.2，163.8，168.7 eV處，分別對(duì)應(yīng)S2-、Sn2-、S0和SO42-，其中S0是SRB異化硫酸鹽過(guò)程中的中間產(chǎn)物。由圖2c可見：C 1s的峰位置在284.9，286.2，288.0 eV處，分別對(duì)應(yīng)C—C、C—O和C=O，可能與細(xì)胞表面的生物組分相關(guān)［16］。

圖2 Nano-FeS@SRB的XPS譜圖（Fe 2p（a）、S 2p（b）和C 1s（c））

2.2 Nano-FeS@SRB體系還原Cr（Ⅵ）的性能

SRB和Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的變化見圖3。由圖3a和圖3b可見：當(dāng)Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，SRB和Nano-FeS@SRB體系對(duì)Cr（Ⅵ）的去除效果符合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，SRB體系中Cr（Ⅵ）的反應(yīng)速率常數(shù)為2.47×10-6s-1，而Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）的反應(yīng)速率常數(shù)為2.60×10-4s-1，比SRB高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，完全去除時(shí)間從5 d降至7 h，說(shuō)明Nano-FeS@SRB體系具有較高的Cr（Ⅵ）還原能力。由圖3a可見，前2 d內(nèi)SRB體系中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度沒(méi)有明顯提升，SRB細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制；而圖3d中Nano-FeS@SRB體系中細(xì)胞生長(zhǎng)延遲期消失，說(shuō)明Nano-FeS可以有效緩解Cr（Ⅵ）對(duì)SRB細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

由圖3c和圖3d可見：當(dāng)Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，在第2天加入卡那霉素（一種阻止蛋白質(zhì)合成并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的氨基糖苷類抗生素），微生物的生長(zhǎng)立即停止，Cr（Ⅵ）的反應(yīng)速率常數(shù)由1.07×10-5s-1急劇降至2.08×10-8s-1后停止，表明Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）的還原是微生物介導(dǎo)的過(guò)程。

圖3 SRB和Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的變化

還原產(chǎn)物的XPS譜圖見圖4。其中FeS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47%，可見FeS在還原Cr（Ⅵ）后并沒(méi)有發(fā)生顯著損耗，主要在于細(xì)胞生物質(zhì)對(duì)納米粒子的穩(wěn)定作用和SRB的電子傳遞能力。由圖4c可見：Cr 2p3/2在576.8 eV和577.7 eV處的峰分別對(duì)應(yīng)Cr2O3和Cr（OH）3；在587.1eV處的峰對(duì)應(yīng)Cr 2p1/2中的FexCr1-x（OH）3或Fe（OH）3-Cr（OH）3［17］，表明還原產(chǎn)物中的鉻主要以Cr（OH）3的形式存在，少量以Cr2O3的形式存在。產(chǎn)物中S0的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%，說(shuō)明在Cr（Ⅵ）存在的條件下，部分FeS表面的硫化物被氧化為S0；SO42-的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%，說(shuō)明Cr（Ⅵ）和SO42-均可以作為電子受體，接受來(lái)自細(xì)胞代謝產(chǎn)生的電子。

圖4 還原產(chǎn)物的XPS譜圖（S 2p（a）、Fe 2p（b）和Cr 2p（c））

2.3 Nano-FeS對(duì)微生物電子傳遞性能的影響

2.3.1 電化學(xué)性能分析

SRB和Nano-FeS@SRB的I-t曲線和循環(huán)伏安曲線見圖5。由圖5a可見：在SRB的實(shí)驗(yàn)組中，電流的增加可以忽略不計(jì)；在Nano-FeS@SRB的實(shí)驗(yàn)組中，在實(shí)驗(yàn)0.65 h時(shí)電流迅速增加至50 μA，表明Nano-FeS的加入增強(qiáng)了SRB的胞外電子傳遞；在實(shí)驗(yàn)1.80 h加入可使細(xì)胞滅活的卡那霉素時(shí)，電流在微生物應(yīng)激反應(yīng)下急劇增加到54 μA后立即降至8 μA，說(shuō)明陰極產(chǎn)生的電流與微生物細(xì)胞代謝有關(guān)。

由圖5b可見：在SRB的實(shí)驗(yàn)組中沒(méi)有觀察到明顯的氧化還原峰；在Nano-FeS@SRB實(shí)驗(yàn)組中，除-0.8 V處氫還原峰外，還在-0.4 V處出現(xiàn)了明顯的還原峰，說(shuō)明Nano-FeS的存在對(duì)SRB內(nèi)的氧化還原反應(yīng)具有強(qiáng)化作用。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，Nano-FeS增強(qiáng)了SRB的胞外電子傳遞。

圖5 SRB和Nano-FeS@SRB的I-t曲線 （a）和循環(huán)伏安曲線（b）

2.3.2 電子傳遞抑制劑的作用

不同抑制劑條件下的Cr（Ⅵ）去除率和抑制率見圖6。由圖6a可見：添加雙香豆素、魚藤酮與辣椒素的混合物及噁唑菌酮后，SRB對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率從38%下降至15%、24%和11%，其抑制率分別達(dá)到58.39%、36.29%和71.07%，主要是因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)性抑制劑雙香豆素可以與復(fù)合體I結(jié)合，阻礙電子由復(fù)合體I向醌池的傳遞；而噁唑菌酮可以抑制電子向外膜細(xì)胞色素c的傳遞。Nano-FeS@SRB體系中，雙香豆素和噁唑菌酮的抑制作用得到緩解，抑制率分別降至11.59%和5.71%，主要是由于導(dǎo)電性納米粒子具有高親和力，可以附著于復(fù)合體I，占據(jù)抑制劑雙香豆素的結(jié)合位點(diǎn)，以促進(jìn)細(xì)胞電子轉(zhuǎn)移，并且Nano-FeS還可以作為電子導(dǎo)管代替受抑制的細(xì)胞色素c接受細(xì)胞代謝產(chǎn)生的電子并將其傳遞給Cr（Ⅵ）。電子傳遞抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Nano-FeS對(duì)細(xì)胞的電子傳遞具有積極作用，可以作為電子穿梭體將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的電子傳遞給胞外Cr（Ⅵ），實(shí)現(xiàn)Cr（Ⅵ）到Cr（Ⅲ）的還原。

圖6 不同抑制劑條件下的Cr（Ⅵ）去除率（a）和抑制率（b）

2.4 Nano-FeS@SRB體系去除Cr（Ⅵ）的影響因素

2.4.1 Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度

在反應(yīng)溫度為30 ℃、體系pH為7.0的條件下，Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度對(duì)Cr（Ⅵ）去除率的影響見圖7。由圖7可見：隨著Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度的升高，Cr（Ⅵ）去除率顯著降低。這是因?yàn)椋篊r（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度低于10 mg/L時(shí)，Nano-FeS過(guò)量，Cr（Ⅵ）去除率接近100%，隨著Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度升高，化學(xué)反應(yīng)趨于平衡，Cr（Ⅵ）去除率開始下降；另一方面，在Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度較高的條件下，SRB會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)變性，造成微生物中毒，使Cr（Ⅵ）去除率降低。

圖7 Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度對(duì)Cr（Ⅵ）去除率的影響

2.4.2 反應(yīng)溫度

在Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度為20 mg/L、體系pH為7.0的條件下，反應(yīng)溫度對(duì)Cr（Ⅵ）去除率的影響見圖8。由圖8可見：隨著反應(yīng)溫度的升高，Cr（Ⅵ）去除率先升高后降低；當(dāng)反應(yīng)溫度為25 ℃時(shí)，Cr（Ⅵ）去除率為47%；當(dāng)反應(yīng)溫度為35 ℃時(shí)，Cr（Ⅵ）去除率增加至77%。這是因?yàn)闇囟壬撸富钚栽黾?，活化分子?shù)增加，反應(yīng)速率加快，因而Cr（Ⅵ）去除率升高。當(dāng)反應(yīng)溫度升至40 ℃時(shí)，Cr（Ⅵ）去除率相較35 ℃有所下降，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)SRB的最適生長(zhǎng)溫度為30~35 ℃，溫度過(guò)高，SRB的生長(zhǎng)受到抑制［18］。本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)溫度為35 ℃較適宜。

圖8 反應(yīng)溫度對(duì)Cr（Ⅵ）去除率的影響

2.4.3 體系pH

在Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度為20 mg/L、反應(yīng)溫度為35 ℃的條件下，體系pH對(duì)Cr（Ⅵ）去除率的影響見圖9。由圖9可見：當(dāng)體系pH為5.0時(shí)，24 h內(nèi)Cr（Ⅵ）去除率達(dá)93%；隨著體系pH升高，Cr（Ⅵ）去除率逐漸下降。這是因?yàn)椋阂环矫?，F(xiàn)eS的溶解度隨pH的升高而下降，高pH條件下，F(xiàn)eS溶解產(chǎn)生的還原性Fe2+和S2-均急劇減少，Cr（Ⅵ）還原速率減慢；另一方面，溶液pH大于FeS的等電點(diǎn)（≈7.5）時(shí)，F(xiàn)eS與Cr（Ⅵ）之間存在靜電斥力［19］，不利于Cr（Ⅵ）的吸附，因而Cr（Ⅵ）的去除率下降。

圖9 體系pH對(duì)Cr（Ⅵ）去除率的影響

3 結(jié)論

a）在Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度為10 mg/L的條件下，Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）的去除速率遠(yuǎn)高于SRB體系，說(shuō)明Nano-FeS@SRB具有較高的Cr（Ⅵ）還原能力，Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）的還原是微生物介導(dǎo)的過(guò)程。經(jīng)Nano-FeS@SRB體系處理后，Cr（Ⅵ）被轉(zhuǎn)化為低毒的Cr（OH）3和Cr2O3，極大程度地降低了Cr（Ⅵ）對(duì)生物和環(huán)境的危害。

b）電化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，Nano-FeS的加入增強(qiáng)了SRB的胞外電子傳遞，可以作為電子穿梭體將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的電子傳遞給Cr（Ⅵ），實(shí)現(xiàn)Cr（Ⅵ）到Cr（Ⅲ）的還原。

c）在Cr（Ⅵ）初始質(zhì)量濃度為20 mg/L、反應(yīng)溫度為35 ℃、體系pH為5.0的條件下，Cr（Ⅵ）去除率為93%。