依帕列凈調(diào)節(jié)糖尿病相關(guān)非編碼RNA表達(dá)機(jī)制

上官同琴 (鄭州市第九人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

2型糖尿病(T2DM)約占所有糖尿病患者的90%，其胰島素產(chǎn)生能力并未完全喪失但胰島素受體卻有明顯減少。T2DM治療除了胰島素外主要還包括雙胍類、噻唑烷二酮類、磺脲類、α糖苷酶抑制劑等藥物，但這些藥物均有增加體重同時(shí)提高心血管疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)〔1，2〕。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起重要作用，因?yàn)樗鼈兪瞧咸烟峭ㄟ^細(xì)胞膜時(shí)的載體與通道。在哺乳動(dòng)物中，有兩類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們屬于溶質(zhì)載體(SLC)基因序列，包含50多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。促進(jìn)型葡萄糖擴(kuò)散系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT1)-4和GLUT6-12由SLC2家族編碼，而鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLT)1～5由SLC5家族編碼。

SGLT2 負(fù)責(zé)過濾后的葡萄糖在腎臟中的大量重吸收。SGLT2抑制劑是一類新型T2DM降糖藥物，其通過抑制腎臟對血糖重吸收來增加尿糖濃度〔3〕。依帕列凈是這類抑制劑中最有效的一種藥物，被廣泛用于治療T2DM〔4〕，其主要作用機(jī)制為通過抑制近端小管上的SGLT2蛋白來抑制腎臟對葡萄糖的重吸收，使得尿糖增加、血糖降低達(dá)到治療糖尿病的目的〔5，7〕。之前的研究都較多集中于對依帕列凈臨床安全性、藥理作用、藥動(dòng)學(xué)等方面的研究〔8，9〕，而分子機(jī)制尤其非編碼RNA方向的研究則鮮有報(bào)道。本研究對依帕列凈引起組織非編碼RNA表達(dá)差異進(jìn)行研究，初步闡述其導(dǎo)致差異表達(dá)的相關(guān)機(jī)制，為其研究提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 TRIZOL(Invitrogen，美國, 15596-026)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Thermo Fisher Scientific，美國, K1621)、熒光定量PCR 試劑盒 ( TAKARA，日本，RR014A), SGLT2 一 抗(abcam，美國，ab85626)、 NF-κB一抗(abcam，美國，ab16502)、GAPDH 一抗(abcam，美國，ab8245)、山羊抗兔二抗(abcam, 美國，ab6721)。

1.2方法

1.2.1小鼠給藥 選取6周齡的T2DM STZ模型小鼠6只，分成對照組(3只)和依帕列凈組(3只)。依帕列凈組小鼠通過飲食給藥法，按照每天300 mg/kg給與依帕列凈治療，連續(xù)給藥12 w。對照組小鼠給予相同飲食，但不含依帕列凈。按時(shí)對小鼠血糖和體重進(jìn)行檢測及記錄，檢測時(shí)剪去小鼠尾巴端部約1 mm，待有血滴滲出后滴加于血糖檢測儀器上，同時(shí)記錄。

1.2.2Western印跡檢測 Western印跡檢測兩組SGLT2、NF-κB蛋白表達(dá)。將小鼠處死后分別取出腎臟及胰腺，加入800 μl RIPA 冰浴研磨裂解30 min，4℃溫度下12 000 r/min離心30 min后去除沉淀。測定濃度后取30 μg加入4×上樣緩沖液及RIPA配制20 μl體積，100℃煮沸5 min后冷卻上樣，進(jìn)行聚丙酰胺凝膠電泳，80 V電泳120 min后濕法70 V轉(zhuǎn)膜100 min。5%脫脂奶粉封閉1 h后，一抗孵育過夜，第2天PBST清洗后加入二抗室溫孵育1 h后滴加顯色液曝光。

1.2.3qRT-PCR 將小鼠處死后分別取出腎臟及胰腺，用1 ml TRIZOL研磨裂解后提冰上靜置5 min，加入200 μl三氯甲烷，12 000 r/min 4℃離心15 min取上清加入等體積異丙醇，冰浴靜置30 min后4℃溫度下12 000 r/min離心30 min，用75%乙醇洗滌沉淀2次并用無RNA酶的水溶解。測定濃度后取500 ng總進(jìn)行RT-PCR，并用所得cDNA經(jīng)行Q-PCR并進(jìn)行分析,內(nèi)參為β-actin。miR-370的Q-PCR中，直接取用2 ng總RNA進(jìn)行發(fā)轉(zhuǎn)，后用miR-370特異探針進(jìn)行Q-PCR檢測，內(nèi)參為U6。

1.2.4靶向SGLT2的mRNA序列 通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析(www.mirbase.org)可能靶向SGLT2(official symbol：SLC5A2)的mRNA序列及其結(jié)合區(qū)域。連續(xù)給藥12 w的小鼠犧牲后，取腎臟提取總RNA。Q-RT-PCR檢測靶向SGLT2 mRNA的miRNA及糖代謝相關(guān)LncRNA的表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行雙尾t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1依帕列凈可抑制SGLT2表達(dá)并降低T2DM模型小鼠血糖水平 與對照組相比較，依帕列凈組腎臟中SGLT2的蛋白及mRNA水平明顯降低(P<0.05)。依帕列凈組血糖含量明顯低于對照組(P<0.01)。依帕列凈組體重相比于對照組也有降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、表1、表2。

圖1 Western印跡檢測小鼠腎臟組織SGLT2表達(dá)

2.2依帕列凈可促進(jìn)靶向SGLT2的miRNA表達(dá)增加 miR-370可靶向結(jié)合SGLT2基因的3′UTR區(qū)域，其序列為UUGGUCCAAGGUGGGGUCGUCCG-5′，共有8mer的配對序列。依帕列凈組腎臟中靶向SGLT2 mRNA的miR-370的表達(dá)量有明顯高于對照組(P<0.05)。見圖2、表1。

2.3依帕列凈可影響胰腺中糖尿病相關(guān)LncRNA的表達(dá) 與對照組比較，依帕列凈組Lnc-P12792、MALAT1的表達(dá)有下降，而KCNQOT1的表達(dá)量改變不明顯。依帕列凈組NF-κB(p65)較對照組顯著下降。見圖3、表1。

表1 兩組相關(guān)指標(biāo)比較

表2 兩組不同時(shí)間體重及血糖比較

圖2 生物信息學(xué)預(yù)測靶向SGLT2的miRNA及靶向位點(diǎn)

圖3 Western檢測小鼠腎臟中LncRNA相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平

3 討 論

T2DM及其心血管、腎臟并發(fā)癥的發(fā)生率呈上升趨勢。因此，除了生活方式的干預(yù)外，針對T2DM及其微血管和大血管并發(fā)癥的預(yù)防及治療，患者還需要使用不同種類的藥物。在抗糖尿病藥物中，二甲雙胍被認(rèn)為是治療T2DM的初始藥物，但許多患者需要添加第二種藥物。SGLT2抑制劑的使用已被證實(shí)與許多T2DM患者的代謝和心血管益處相關(guān)，其處方率有望大幅增加。

依帕列凈是近年來應(yīng)用于治療而型糖尿病的新型藥物，其對血糖及體重的控制有較明顯的作用。為了驗(yàn)證抑制作用的可靠性，本研究結(jié)果顯示，依帕列凈有效抑制SGLT2的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平，表明本研究給藥方法切實(shí)可行且與之前試驗(yàn)研究一致〔10，11〕，對小鼠血糖含量檢測結(jié)果也顯示，給藥組小鼠的血糖含量降低到正常水平(100 mg/dl)。同時(shí)對小鼠體重監(jiān)測結(jié)果顯示，依帕列凈可在降低血糖同時(shí)降低體重，這一結(jié)果與之前報(bào)道一致〔12〕。

隨后對依帕列凈抑制SGLT2表達(dá)的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，只有miR-370靶向作用與SGLT2的mRNA，其特異性的結(jié)合于3′UTR區(qū)域，介導(dǎo)SGLT2 mRNA的降解抑制其表達(dá)。本研究結(jié)果提示依帕列凈作用機(jī)制之一可能通過促進(jìn)miR-370的表達(dá)使得SGLT2的mRNA大量降解，從而抑制SGLT2蛋白的表達(dá)量。為了更進(jìn)一步分析依帕列凈對糖尿病相關(guān)非編碼RNA的影響，本研究對給藥小鼠胰腺進(jìn)行分離并提取了RNA及蛋白。Lnc-P12792、MALAT1兩種LncRNA的表達(dá)量有降低，而在之前的研究中發(fā)現(xiàn)在T2DM的胰島B細(xì)胞中這兩種LncRNA的表達(dá)量均有升高表達(dá)〔13，14〕。這一結(jié)果提示依帕列凈在抑制腎臟對血糖重吸收的同時(shí)也在分子水平上改善著胰島β細(xì)胞的功能。為了更進(jìn)一步探究其調(diào)控的分子機(jī)制，本研究對腎臟組織蛋白樣品進(jìn)行Western印跡檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(p65)的表達(dá)量有降低趨勢。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，依帕列凈可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(p65)的表達(dá)從而降低Lnc-P12792、MALAT1兩種LncRNA的表達(dá)量。

綜上所述，依帕列凈抑制SGLT2的分子機(jī)制可能是通過促進(jìn)miR-370的表達(dá)從而介導(dǎo)SGLT2 mRNA的降解并抑制其蛋白的表達(dá)，這一結(jié)果降低腎臟對血糖重吸收效率導(dǎo)致尿糖含量增加。同時(shí)依帕列凈在降低血糖的同時(shí)也通過調(diào)節(jié)LncRNA的表達(dá)改善著胰島細(xì)胞的功能，這一結(jié)果可能是長期正常血糖含量所引起的，同時(shí)也有可能是依帕列凈存在其他調(diào)節(jié)機(jī)制，這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究為依帕列凈治療糖尿病的機(jī)制提供了新的依據(jù)與分析角度，也為評估其可能存在風(fēng)險(xiǎn)的分析提供新視野，即依帕列凈會(huì)引起轉(zhuǎn)錄因子及非編碼RNA的表達(dá)改變則會(huì)對機(jī)體造成其他影響。