基于宏基因組測序的橡膠林病原微生物的分析

全 飛，蘭國玉，魏亞情,4，李明美,5，孫樹晴,6，杜昊楠,6

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所, ?？?571101; 2. 海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, ?？?570228;3. 海南儋州熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站, 海南 儋州 571737; 4. 海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，?？?570228; 5. 海南大學(xué) 林學(xué)院， ?？?570228; 6. 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院， 海口 570228）

橡膠 樹[Hevea brasiliensis(H. B. K.) Muell.-Arg.]原產(chǎn)于巴西亞馬孫地區(qū)，19世紀(jì)引入亞洲熱帶地區(qū)[1]，橡膠種植面積迅速擴(kuò)大[2-4]， 2017年世界橡膠種植面積達(dá)到1 484萬hm2[5]。我國橡膠人工林主要分布在海南和云南西雙版納，約占我國橡膠種植總面積的91.3%[6]。海南島橡膠林的分布約占海南島植被總面積的四分之一[7]。西雙版納是東南亞熱帶北緣重要的典型橡膠產(chǎn)區(qū)[8]，西雙版納橡膠林約占西雙版納植被總面積的40%， 2010年西雙版納的橡膠人工林種植面積約50萬hm2[9]。橡膠人工林已成為我國熱帶地區(qū)重要的森林生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)維持熱帶陸地生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著重要作用[10]。橡膠樹受多種真菌致病因子的影響[11]。真菌根病以破壞橡膠林根系對(duì)土壤的水分和養(yǎng)分的吸收與利用方式對(duì)橡膠根系造成危害。此外，真菌根部疾病通常只有在感染擴(kuò)散至根部死亡時(shí)才被觀察到，此時(shí)多已超過有效治療的程度[12]。

感染橡膠樹根部的真菌病原體為白根?。≧igidoporus microporus）、褐根?。≒hellinus noxius）和紅根?。℅anoderma pseudoferreum）[13-14]。在經(jīng)濟(jì)上，白根病是橡膠樹上最重要的病害，在全世界都造成橡膠產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失[15]。褐腐病和紅腐病對(duì)橡膠林的經(jīng)濟(jì)影響較小，因?yàn)樗鼈兺ǔＩL緩慢，對(duì)樹木生長和乳膠生產(chǎn)的影響較小[13]。白根病可以感染整個(gè)熱帶地區(qū)的橡膠樹，它是影響東南亞橡膠林的主要疾病之一[15-16]。健康樹木接觸到受感染的樹根和木質(zhì)碎屑，感染的根被大量的白色菌絲體覆蓋，最初為褐色，后來為白色，因此，Rigidoporus microporus有白根病的俗稱[16]，在感染后期，真菌產(chǎn)生橙褐色子實(shí)體，新鮮時(shí)邊緣為亮黃色，而樹干底部周圍的下表面變成紅棕色[15]。在感染階段，橡膠樹的葉子開始變黃，最后這種疾病破壞了樹冠和根系，導(dǎo)致樹木死亡[16]。許多植物病原體感染橡膠樹后無明顯癥狀[17]，并且可以在不利的環(huán)境條件下持續(xù)存在[18]。在疾病暴發(fā)之前，這些病原體通?；旧鲜菨撛诘?。然而，這些病原體可以通過基于DNA的方法檢測[19]。因此，基于DNA的方法可以全面了解潛在的植物病原菌群落。1978年，植物病理學(xué)家[20]將植物病原菌劃分為：農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、歐文氏菌屬（Erwinia）、諾卡氏菌屬（Nocardia）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等，歸功于DNA測序技術(shù)和分類方法的進(jìn)步，目前植物病原菌已有39個(gè)屬[21]。

宏基因組測序技術(shù)較全面的反映了樣本中微生物群落的組成。筆者通過宏基因組測序技術(shù)了解橡膠林土壤、根際、根表的病原微生物，并通過數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步了解微生物間的互作關(guān)系，對(duì)橡膠林土壤改良、提高橡膠樹抗性和乳膠產(chǎn)量、并為橡膠林的病害預(yù)防及生長管理提供有效信息，對(duì)促進(jìn)橡膠林生態(tài)多樣性研究、病蟲害的綜合防控和橡膠產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 采樣方法在海南（儋州、萬寧和樂東）和西雙版納（景洪、勐侖和勐滿）采集健康橡膠樹的土壤和根系樣本。

理化分析和土壤微生物采樣：采樣前用70%酒精取樣器具需進(jìn)行消毒滅菌處理。去除表面浮土，采樣員戴上無菌手套，以橡膠樹樹干為圓心(半徑為0.5 m)，在圓上隨機(jī)取3個(gè)點(diǎn)，去除表層5 cm的土壤，在5～20 cm土層采集橡膠樹根際周圍土壤200 g，去除可見雜質(zhì)，用2 mm篩網(wǎng)過篩處理，然后將3份土壤混合均勻，分別用自封袋裝500 g土壤作為理化分析樣品和取5～10 g土壤裝入無菌離心管中，一并放入保溫盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，所有樣品置于干冰寄送至美吉生物公司測序。

根際微生物取樣：采樣前用70%酒精對(duì)取樣器具進(jìn)行消毒滅菌處理。用消毒的剪刀在土壤微生物采樣的3個(gè)點(diǎn)上分別剪取5～8根直徑2 mm以內(nèi)細(xì)根系，每根根系長約9～12 cm（盡量不要碰傷表皮），每個(gè)點(diǎn)在根系周圍1 mm采集橡膠樹根際土壤，把根際土壤抖落在無菌自封袋中，去除植物根、動(dòng)物殘骸及其他雜質(zhì)，過0.85 mm篩，將3份土樣混合均勻，取5～10 g裝入無菌離心管，一并低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，所有樣品置于干冰中，送美吉生物公司測序。

根表微生物取樣：采樣員戴上無菌手套，在根際微生物取樣中剪取的根系置于保溫盒內(nèi)保存，24 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室用無菌刷輕輕刷去根系表層附著的土壤，將根系置于無菌離心管中，浸沒于無菌PBS緩沖溶液，在180 r·min-1下清洗20 min；用無菌鑷子取出根系組織，將根系再次置于無菌離心管中加入無菌PBS緩沖溶液，在180 r·min-1下清洗20 min；取出根系組織，將根系再次置于無菌離心管中加入無菌PBS緩沖溶液，超聲波洗滌10 min（超聲波清洗器設(shè)置：160 W，30 s/30 s，10 min）。將3次洗滌液置于無菌離心管中，用12 000 g離心10 min，收集沉淀（根表微生物）并置于-80 ℃冰箱保存。所有根表微生物樣品置于干冰中至美吉生物公司測序。

1.2 土壤理化分析土壤理化和養(yǎng)分測定參考魯如坤[22]的方法。土壤理化性質(zhì)測定了土壤含水率和pH。土壤養(yǎng)分測定主要有土壤有機(jī)質(zhì)、速效氮（氨態(tài)氮和硝態(tài)氮）、速效磷、速效鉀、全氮、全磷、全鉀（表1）。土壤有機(jī)碳測定采用重鉻酸鉀-外加熱法；全氮測定采用靛酚藍(lán)比色法；全磷測定采用鉬銻抗比色法；全鉀采用火焰光度計(jì)法；速效鉀采用醋酸銨提取火焰光度計(jì)法；速效磷測定采用鹽酸氟化銨法。硝態(tài)氮測定采用氯化鈉提取法，氨態(tài)氮測定采用靛酚藍(lán)比色法。

表1 宏基因組測序土壤樣本養(yǎng)分

1.3 宏基因組測序分析采 用 Illumina Hiseq PE150/250 高通量測序平臺(tái)。使用fastp軟件對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控，得到clean reads序列，然后利用Megahit軟件進(jìn)行序列組裝，得到的組裝序列通過MetaGene軟件進(jìn)行基因預(yù)測（序列長度≥100 bp），利用CD-HIT軟件和SOAPaligner 軟件進(jìn)行聚類（90% identity、90% coverage）和基因的豐度計(jì)算（95% identity），比對(duì)NR數(shù)據(jù)庫獲得樣本的物種分類學(xué)注釋信息，通過 NR 庫中的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋結(jié)果，計(jì)算物種的豐度，并統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品在界、門、綱、目、科、屬和種的分類學(xué)水平上物種的豐度，從而構(gòu)建相應(yīng)分類學(xué)水平上的豐度表。比對(duì)病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫（PHI），對(duì)橡膠林土壤、根際及根表進(jìn)行植物病原物種注釋，得到橡膠林土壤、根際及根表植物病原物種信息，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析RDA 即冗余分析，是約束化的PCA 分析，從圖中可以直觀地看出樣本分布和環(huán)境因子間的關(guān)系。RDA主要用于分析物種或功能與環(huán)境因子之間關(guān)系，RDA 是基于線性模型。使用R語言vegan包中RDA分析和作圖。主坐標(biāo)分析（PCoA），是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，研究樣本群落組成的相似性或差異性，PCoA是基于所選距離矩陣進(jìn)行作圖。本研究選用bray_curtis距離算法，通過降維的方式來找出影響樣本群落組成差異的潛在主成分。使用R語言PCoA分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原微生物組成分析通過宏基因組測序結(jié)果與病原和宿主互作數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋，得到植物病原微生物在土壤、根際及根表的組成，病原微生物在門、屬和種水平分別為：4、30和53（表2）。由圖1可知，植物病原微生物在門的水平上屬于：變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和子囊菌門（Ascomycota），其中變形菌門在土壤、根際及根表的平均占比為90.67%，根際樣本占比最大，根表樣本占比最少；放線菌門在土壤、根際及根表的平均占比為7.67%，根表樣本占比最多，根際樣本占比最少；子囊菌門在土壤、根際及根表的平均占比為1.11%，根表樣本占比最多，根際樣本占比最少。

表2 海南與西雙版納橡膠林土壤、根際及根表病原微生物

由圖2可知，病原微生物在屬水平上屬于：假單孢菌屬（Pseudomonas）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、泛菌屬（Pantoea）、麥角菌屬（Clavibacter）、果膠桿菌屬（Pectobacterium）和木質(zhì)部小菌屬（Xylella）。假單孢菌屬在土壤、根際及根表的占比為61.20%，根際樣本占比最大，根表樣本占比最少；勞爾氏菌屬在土壤、根際及根表的占比為10.70%，根際樣本占比最少，根表樣本占比最大；伯克霍爾德氏菌屬在土壤、根際及根表的占比為6.80%，根際樣本占比最少，根表樣本占比最大；鏈霉菌屬在土壤、根際及根表的占比為6.38%，根際樣本占比最少，根表樣本占比最大；農(nóng)桿菌屬在土壤、根際及根表的占比為4.45%，根際樣本占比最少，根表樣本占比最大。根表樣本中病原菌占比相對(duì)平均，而根際樣本中病原菌主要為假單孢菌屬，占比達(dá)到81.44%。在屬水平上主要以子囊菌門為主。

續(xù)表2

由圖3可知，在土壤、根際及根表樣本屬水平上，假單孢菌屬和歐文氏菌屬（Erwinia）有顯著差異（P=0.03），泛菌屬和果膠桿菌屬有極顯著差異（P＜0.01）。其中假單孢菌屬在根表樣本中的豐度明顯小于土壤和根際樣本，歐文氏菌屬、泛菌屬和果膠桿菌在根表樣本中的豐度明顯大于土壤和根際樣本。由圖4可知，兩地根際病原微生物在屬水平上無顯著差異。

2.2 病原微生物PCoA分析由圖5可知，PC1軸解釋74.07%，PC2軸解釋10.57%。由圖5和圖6可知，根表樣本離散程度低，說明病原微生物在根表樣本中分布均勻，而土壤和根際樣本則相反。土壤和根際樣本置信橢圓高度重合，說明土壤和根際樣本病原微生物差異更小，根表樣本在PC1軸高度聚類，也說明病原微生物在根表樣本中高度相似，但樂東的根表樣本有一點(diǎn)差異。

2.3 病原微生物與環(huán)境因子相關(guān)性分析基于病原微生物屬水平RDA分析，由圖6可知，RDA1軸解釋25.23%，RDA2軸解釋0.47%，勐侖和勐滿土壤和根際樣本病原微生物組成相似，樂東根表樣本與其他根表樣本有差異。由圖6和表3可知，只有硝態(tài)氮與病原微生物呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），其他環(huán)境因子與病原微生物無顯著關(guān)系。

表3 病原微生物RDA分析相關(guān)性因子

選取豐度前20的屬水平的病原微生物，箭頭表示方向，紅色的線表示環(huán)境因子，紫色的線表示病原微生物。

3 討 論

通過宏基因組測序結(jié)果與病原和宿主互作數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋，得到植物病原微生物在土壤、根際及根表的組成。研究表明[11]，橡膠樹受到多種真菌致病因子的影響，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，健康土壤中，土壤、根際及根表樣本中均未出現(xiàn)引起橡膠樹根病的真菌，說明健康土壤中有抑制致病菌的有益微生物，這與Weller等[23]研究結(jié)果相似。有研究表明[24]，多年生作物不斷地從土壤中吸收養(yǎng)分，導(dǎo)致土壤肥力下降，而土壤養(yǎng)分缺乏會(huì)增加植物對(duì)感染的敏感性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硝態(tài)氮與病原微生物呈顯著正相關(guān)，其他環(huán)境因子與病原微生物無顯著關(guān)系。那么在對(duì)橡膠林施肥時(shí)，是否可以增加氨態(tài)氮的比例，從而減少病原微生物的種類和豐度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物病原微生物在門的水平上屬于變形菌門、放線菌門和子囊菌門，其中變形菌門在根表樣本占比最少，而放線菌門和子囊菌門在根表樣本占比則最多，表明放線菌門和子囊菌門的病原微生物更適應(yīng)根表環(huán)境，或者說根表環(huán)境吸引放線菌門和子囊菌門的病原微生物定殖，表明不僅有益微生物會(huì)被植物根系招募，某些病原微生物也會(huì)被植物根系招募。土壤和根際樣本病原微生物組成相似，各根表樣本病原微生物組成相似，表明病原微生物的組成可能與根表環(huán)境有關(guān)。在屬水平上，病原微生物以子囊菌門種類最多，表明子囊菌門的病原微生物在橡膠樹根系中分布廣泛。假單孢菌屬主要分布在土壤和根際，歐文氏菌屬、泛菌屬和果膠桿菌主要分布在根表。兩地根際病原微生物在屬水平上無顯著差異。