紫蘇硬脂酰-ACP 脫氫酶基因家族鑒定及表達(dá)分析

邢 志，董書(shū)言，王 超，周雅莉，楊宏斌，王計(jì)平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所,山西太谷 030801)

紫蘇(Perillafrutescens)古名荏，又名赤蘇、桂荏、香蘇，系唇形科紫蘇屬一年生草本植物，在亞洲國(guó)家種植廣泛[1]。紫蘇具有豐富的種質(zhì)資源，在中國(guó)已有2000多年的栽培歷史，適宜在光照充足、土壤疏松、肥力足及排水好的環(huán)境條件下種植[2]。紫蘇具有特異芳香，主要用于油用、藥用、食用及香料方面，是衛(wèi)計(jì)委首批公布的60種藥食同源植物之一，可以開(kāi)發(fā)出多種保健食品[3]。紫蘇種子中含油量高達(dá)45%～55%，其不飽和脂肪酸含量豐富，占總脂肪酸含量的 90%以上，其中油酸含量約占12.01%，亞油酸含量約為15.43%，α-亞麻酸含量高達(dá)62.73%，是目前發(fā)現(xiàn)的亞麻酸含量較高的油料作物之一[4-5]。α-亞麻酸能夠提高人體免疫力、降低膽固醇、延緩機(jī)體衰老、預(yù)防阿爾茨海默病等，常用于保健和治療疾病[6]。因此，紫蘇油極具開(kāi)發(fā)價(jià)值，是良好的植物保健資源，其在醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域都具有重要的的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和良好的市場(chǎng)前景[7]。

植物油脂主要通過(guò)脂肪酸(FA)的生物合成和 TAG 的合成積累來(lái)形成，脂肪酸的從頭合成途徑主要發(fā)生在質(zhì)體中，該過(guò)程以乙酰輔酶 A 作為底物，在?；d體蛋白(ACP)的參與下進(jìn)行催化合成[8]。在脂肪酸合酶復(fù)合物(FAS)的催化下，丙二酰輔酶 A 與 ACP 結(jié)合，?；溍總€(gè)循環(huán)經(jīng)歷 2 個(gè)碳原子形式的連續(xù)縮合反應(yīng)，產(chǎn)生16∶0-ACP和18∶0-ACP[9]。硬脂酰-ACP脫氫酶(stearoyl-ACP desaturase，SAD)以硬酰基-ACP(C18∶0-ACP)為底物，催化18∶0-ACP 在第9-10碳原子間脫氫形成一個(gè)雙鍵產(chǎn)生18∶1-ACP，得到的18∶1-ACP可以進(jìn)入原核甘油脂途徑，或被水解成游離脂肪酸，進(jìn)而在酰基-CoA 合成酶的作用下活化成脂酰-CoA，并從質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞質(zhì)中[10-11]。植物脂酰-ACP 脫飽和酶定位于植物質(zhì)體中，是植物中唯一可知的可溶性脫飽和酶家族，包括Δ9硬脂酰 ACP 脫飽和酶、Δ6 軟脂酰 ACP 脫飽和酶和Δ4 軟脂酰ACP 脫飽和酶等，其中SAD催化硬脂酰基-ACP在Δ9 位置去飽和形成油酰ACP，使硬脂酸脫飽和后形成油酸(18∶1)，其存在于質(zhì)體基質(zhì)中，調(diào)控紫蘇不飽和脂肪酸成分的比例，是不飽和脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶[12]，對(duì)調(diào)節(jié)油料作物種子中脂肪酸組成具有重要意義。目前，已經(jīng)從蓖麻[13]、油菜[14]和棉花[15-16]等植物中克隆獲得SAD基因，并驗(yàn)證了其功能和表達(dá)特性。Liu 等[16]利用 RNA 干涉對(duì)棉花SAD基因進(jìn)行沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)棉花中的硬脂酸含量從20%上升到40%，而棉籽油中的3種主要脂肪酸(棕櫚酸、油酸和亞油酸)含量減少。在煙草中過(guò)表達(dá)SAD基因，硬脂酸(18∶0)被催化為油酸(18∶1)，使得多不飽和脂肪酸含量增加，轉(zhuǎn)基因煙草及其種子的抗寒性顯著提高[17]。前人研究表明，SAD家族基因在不同組織器官中具有不同的表達(dá)模式[15,18-19]。Kachroo等[18]研究表明擬南芥AtSADs呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)，且在發(fā)育種子中的表達(dá)量比其他組織都高。Shang等[15]對(duì)棉花中SAD基因家族進(jìn)行鑒定，研究發(fā)現(xiàn)棉花GhSAD2 和GhSAD4 在開(kāi)花后20～35 d的發(fā)育種子中表達(dá)量較高，在其他組織中表達(dá)較低。已有報(bào)道顯示，SAD基因家族已在棉花[15]、擬南芥[18]、可可[19]等作物中被鑒定，而關(guān)于紫蘇PfSAD的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，為解析紫蘇硬脂酰-ACP 脫氫酶基因家族(PfSAD)在脂肪酸合成過(guò)程中發(fā)揮的作用，本研究對(duì)紫蘇SAD家族成員的基因結(jié)構(gòu)及酶蛋白理化性質(zhì)等序列特征進(jìn)行分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)對(duì)紫蘇PfSAD家族基因的表達(dá)特性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探究PfSAD家族基因的功能以及紫蘇油脂合成機(jī)制、提高紫蘇油品質(zhì)與產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料為‘晉紫蘇1號(hào)’品種，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗(yàn)基地，以點(diǎn)播方式進(jìn)行種植，每小區(qū)分6行，每行6株，株距50 cm，行距50 cm，小區(qū)間距50 cm，播種1個(gè)月后進(jìn)行間苗。在苗期、花期及種子發(fā)育不同時(shí)期分別取樣，取6周齡左右的幼苗根、莖、葉、盛花期的花，以及開(kāi)花后10、20、30、40 d的種子，所有樣品液氮速凍后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫蘇PfSADs基因的鑒定在課題組前期自測(cè)序獲得的紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出功能注釋為SAD的基因序列及氨基酸序列，根據(jù)不同物種間同源基因核苷酸序列相對(duì)保守的特點(diǎn)，將紫蘇SAD的基因序列與擬南芥和蓖麻等植物中的SAD序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得紫蘇PfSADs基因的CDS序列。

1.2.2 紫蘇PfSADs基因編碼蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析利用生物信息學(xué)軟件對(duì)紫蘇PfSAD家族基因進(jìn)行分析，通過(guò)在線(xiàn)工具NCBI-ORF Finder分析紫蘇PfSAD家族基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)；通過(guò)在線(xiàn)軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)PfSADs蛋白的分子量、等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)PfSADs蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域；使用Plant-Multi和TargetP在線(xiàn)網(wǎng)站對(duì)PfSADs編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析；運(yùn)用NCBI-CDD分析紫蘇PfSADs蛋白序列的功能結(jié)構(gòu)域；采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html)軟件預(yù)測(cè)PfSADs蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactiv)對(duì)PfSADs蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模和預(yù)測(cè)分析；采用多序列比對(duì)工具ClustalW對(duì)紫蘇PfSAD家族基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；運(yùn)用MEGA7軟件鄰接法(neighbor-joining，NJ)對(duì)紫蘇及其近緣種的SAD蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 RNA提取及cDNA的合成用艾德萊公司的 EASYspin植物 RNA 快速提取試劑盒提取紫蘇根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期種子的RNA，并檢測(cè)各個(gè)組織RNA 濃度與質(zhì)量；使用ABM公司的5×All-In-One MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 紫蘇PfSAD家族基因組織特異性表達(dá)分析利用Primer 6.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)特異性引物(表1)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為150～220 bp，退火溫度為53～61 ℃之間，其中以紫蘇Actin為內(nèi)參基因[20]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用GenStar公司的2×RealStar Green Power Mixture試劑盒，反應(yīng)體系為：cDNA模板0.5 μL，正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，ddH2O 4.1 μL，2×RealStar Green Power Mixture 5 μL，總計(jì)10 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，Tm 1 min，共40個(gè)循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s。應(yīng)用CFX96TM OpticsModule實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，利用2-ΔΔCt法[21]計(jì)算紫蘇PfSADs基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PfSADs基因qRT-RCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇PfSADs基因家族的鑒定及基因結(jié)構(gòu)和蛋白理化性質(zhì)分析

從紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到SADs基因，利用擬南芥AtSADs基因序列為模板進(jìn)行比對(duì)分析，通過(guò)NCBI-CDD將獲得的紫蘇SAD序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，鑒定獲得6個(gè)具有?；?ACP 脫氫酶保守結(jié)構(gòu)域的PfSAD家族成員，且均屬于含有Fe-O-Fe中心的Ferritin-like鐵蛋白超家族。

通過(guò)在線(xiàn)軟件ProtParam對(duì)紫蘇6個(gè)SAD家族基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示：紫蘇PfSAD家族基因編碼蛋白長(zhǎng)度范圍為367～396 aa，其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量最低的為89 848.27 Da(PfSAD6)，最高的為97 876.78 Da(PfSAD1)，理論等電點(diǎn)在5.02～5.07之間，均小于7.0，因此預(yù)測(cè)PfSADs家族可能為一類(lèi)酸性蛋白，且均為不穩(wěn)定疏水性蛋白，6個(gè)PfSADs蛋白的理化性質(zhì)均與其他植物SAD的理化性質(zhì)相近。使用SOPMA網(wǎng)站對(duì)PfSADs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，由表3可知，PfSADs的二級(jí)結(jié)構(gòu)由4種元件構(gòu)成，其中α-螺旋所占比例較高為53.08%～57.88%，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例為29.43%～34.10%，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈則鑲嵌于整個(gè)蛋白中，所占比例均小于10%。通過(guò)TMHMM、Plant-Multi和TargetP分別預(yù)測(cè)PfSADs蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位及N-末端轉(zhuǎn)運(yùn)肽(TP)，結(jié)果顯示，PfSADs蛋白均不存在跨膜結(jié)構(gòu)域；其中PfSAD1、PfSAD2、PfSAD3、PfSAD4、PfSAD5和PfSAD6分別含有24、33、19、19、35 和33個(gè)氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，cTP值分別為0.665 3、0.909 9、0.0082、0.784 6、0.879 5和0.970 6，表明這6種蛋白定位在葉綠體，在葉綠體中發(fā)揮作用。

表2 紫蘇SAD家族蛋白的基本理化性質(zhì)

表3 紫蘇SAD家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)跨膜區(qū)及亞細(xì)胞定位分析

利用 SWISS-Model 軟件預(yù)測(cè)分析紫蘇PfSADs蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行同源建模(圖1)。對(duì)紫蘇PfSADs蛋白進(jìn)行同源建模時(shí)使用的模板為蓖麻1afr.1.A蛋白[13]，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示PfSADs蛋白均與蓖麻1afr.1.A蛋白序列相似度較高，相似性范圍為51%～59%，序列覆蓋度在87%～92%之間；X射線(xiàn)衍射發(fā)現(xiàn)紫蘇PfSADs蛋白編碼多肽的保守性基本一致，其蛋白活性形式為二聚體，多個(gè)二聚體共同形成催化Fe2+的活性位點(diǎn)；PfSADs蛋白包含4個(gè)鐵輔基[FE(II)ION]配體，其蛋白單體主要由α-螺旋、β-折疊和其他無(wú)規(guī)則卷曲組成，含有一個(gè)由4個(gè)α-螺旋束包圍的二鐵離子，每個(gè)蛋白單體還含有2個(gè)與其相互作用的金屬配合物，由α-螺旋束組成的氨基酸側(cè)鏈或基團(tuán)為Fe2+的配基，兩個(gè)單體的二鐵離子位于蛋白二聚體底物結(jié)合凹槽的內(nèi)部，共同構(gòu)成了催化SAD的活性中心，該中心催化?；?ACP上第九個(gè)和第十個(gè)碳原子脫氫形成不飽和鍵，表明其在蛋白脫氫過(guò)程中發(fā)揮作用。

2.2 紫蘇SAD蛋白同源序列比對(duì)

通過(guò)ClustalW軟件對(duì)紫蘇PfSADs蛋白家族進(jìn)行多序列比對(duì)分析，將其氨基酸序列與蓖麻(Ricinuscommunis)RcSAD1、擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtSSI2、甘藍(lán)油菜(Brassicanapus)BnSAD1和可可(Theobromacacao)TcSAD1的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。紫蘇SAD蛋白同源序列比對(duì)結(jié)果如圖2所示，紫蘇PfSADs氨基酸序列與蓖麻 RcSAD1、擬南芥 AtSSI2、甘藍(lán)油菜BnSAD1和可可TcSAD1 氨基酸序列的相似性較高，均大于50%，其保守結(jié)構(gòu)域與RcSAD1、AtSSI2的保守結(jié)構(gòu)域相類(lèi)似，都分布在11個(gè)α-螺旋和2個(gè)β-轉(zhuǎn)角之內(nèi)。前人報(bào)道顯示，植物SAD脫氫酶催化中心的8個(gè)關(guān)鍵氨基酸影響著不同脂肪酰-ACP的選擇特異性。例如，擬南芥 AtSSI2的關(guān)鍵氨基酸殘基(M152、L153、T155、L156、P217、T219、G226和F227)和蓖麻 RcSAD1(M114、L115、T117、L118、P179、T181、G188和F189)均能使其進(jìn)行特異性選擇并催化 18∶0-ACP 生成 18∶1-ACP[22]。紫蘇PfSADs多序列比對(duì)結(jié)果表明，PfSAD1-PfSAD5具有與 RcSAD1和AtSSI2完全相同的關(guān)鍵氨基酸，PfSAD6含有5個(gè)變異氨基酸，分別為M134G、T137S、P199V、T201W和G208A，預(yù)測(cè)其催化脫氫作用可能對(duì)底物的選擇有所差異。EENRHG 和 DEKRHE為典型SAD特征的保守組氨酸富集區(qū)，PfSADs家族的6個(gè)蛋白均存在這兩個(gè)保守區(qū)域，其天冬氨酸(D)和組氨酸(H)為PfSADs蛋白單體的二鐵離子提供了必需的結(jié)合位點(diǎn)，為脫氫酶的催化中心Fe2+提供了催化活性。

2.3 紫蘇SAD蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建紫蘇PfSADs蛋白與其他植物SADs蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖3所示，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，6個(gè)紫蘇SAD家族蛋白與其他7種植物蛋白被聚為三大類(lèi)：PfSAD1與向日葵HaSAD、蓖麻RcSAD1、可可TcSAD1、白頭翁LcSAD3等親緣關(guān)系較近，被聚為一類(lèi)，而PfSAD2和PfSAD3與擬南芥AtSAD3、擬南芥AtSAD4、芝麻SiSAD和白頭翁LcSAD2相似性較高，聚在第二類(lèi)，PfSAD4、PfSAD5和PfSAD6與擬南芥AtSAD6聚在一類(lèi)，具有較近的親緣關(guān)系。

2.4 紫蘇PfSADs基因的表達(dá)特性分析

以Actin作為內(nèi)參基因，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)分析紫蘇PfSADs基因在‘晉紫蘇1號(hào)’不同組織及不同發(fā)育時(shí)期種子(開(kāi)花后10、20、30及40 d)的表達(dá)情況。結(jié)果(圖4)顯示，紫蘇PfSAD家族基因表達(dá)情況具有多樣性。紫蘇PfSAD1、PfSAD2、PfSAD3在各個(gè)組織及不同發(fā)育時(shí)期種子中均有表達(dá)，其中PfSAD1在根中表達(dá)量最弱，在葉中表達(dá)量最高，PfSAD3在所有組織器官中均有高表達(dá)；PfSAD4在葉和開(kāi)花后10 和40 d基本不表達(dá)，在花及開(kāi)花后20 d時(shí)表達(dá)較弱，在根、莖、開(kāi)花后10和30 d時(shí)表達(dá)量較高；PfSAD5和PfSAD6分別在開(kāi)花后30 d種子和花中表達(dá)較高，其他時(shí)期及組織基本不表達(dá)。在不同發(fā)育時(shí)期種子中，PfSAD1和PfSAD3的表達(dá)隨著種子發(fā)育先升高后降低，PfSAD2、PfSAD4呈現(xiàn)先下降后升高再下降的趨勢(shì)，且PfSAD2在植株開(kāi)花后10、30和40 d的表達(dá)量相較于其他組織具有明顯的表達(dá)優(yōu)勢(shì)；PfSAD1-PfSAD5均在開(kāi)花后30 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，其中PfSAD2較其他基因具有明顯的表達(dá)優(yōu)勢(shì)。研究結(jié)果表明6個(gè)基因均具有轉(zhuǎn)錄活性，PfSAD1在葉中表達(dá)量最高，PfSAD2-PfSAD5在種子發(fā)育成熟期時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰，PfSAD6在花中表達(dá)量最高，推測(cè)紫蘇PfSADs基因在不同組織器官中發(fā)揮不同的功能。

3 討 論

紫蘇是一種多用途經(jīng)濟(jì)作物，既可食用，又可作為醫(yī)用藥品，其中紫蘇籽油富含不飽和脂肪酸，在保健和醫(yī)療等方面都具有重要作用[3]。硬脂酰-ACP脫氫酶作為高等植物中唯一的脂溶性脫氫酶，在不飽和脂肪酸合成過(guò)程中起重要調(diào)控作用[10,12]。因此，探究紫蘇硬脂酰-ACP 脫氫酶的催化活性及其分子合成機(jī)制，對(duì)紫蘇SAD的功能鑒定及通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高油酸紫蘇具有重要指導(dǎo)意義。

本研究通過(guò)篩選紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定并獲得6個(gè)紫蘇SAD基因，其編碼蛋白長(zhǎng)度、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)有所差異，如PfSAD6 編碼蛋白長(zhǎng)度為367 aa，相對(duì)分子量為89 848.27 Da，二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋含量最高，分布較為均勻；而 PfSAD3編碼蛋白序列較長(zhǎng)(390 aa)，相對(duì)分子質(zhì)量也較大(96 289.25 Da)，二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋含量相對(duì)最少，在序列中間分布密集；PfSADs蛋白質(zhì)序列不包含跨膜區(qū)域，預(yù)測(cè)其定位于葉綠體上，這與其他物種中硬脂酰-ACP脫氫酶在細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的研究結(jié)果相一致[23-24]；對(duì)PfSADs蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，均無(wú)信號(hào)肽，這與預(yù)測(cè)的PfSADs是非跨膜蛋白的結(jié)論相一致；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PfSADs具有Acyl_ACP_Desat的保守結(jié)構(gòu)域，蛋白活性形式均為同型二聚體，每個(gè)蛋白單體包含一個(gè)由2個(gè)鐵原子組成的二鐵中心，二鐵中心鑲嵌在α-螺旋束中，這表明6個(gè)PfSADs均具有催化硬脂酰-ACP脫氫酶的活性中心，屬于類(lèi)鐵氧化還原蛋白超家族。

已有研究證明，植物SAD酶蛋白的8個(gè)關(guān)鍵氨基酸種類(lèi)影響著SAD 對(duì)不同酰基-ACP的選擇特異性，當(dāng)這些關(guān)鍵氨基酸發(fā)生突變時(shí)，該脫氫酶對(duì)底物選擇活性會(huì)發(fā)生改變。蓖麻 RcSAD1的關(guān)鍵氨基酸殘基(M114、L115、T117、L118、P179、T181、G188 和 F189)能催化 18∶0-ACP 生成 18∶1-ACP[22]，當(dāng)蓖麻 RcSAD1的 T117、L118、F189和T206突變?yōu)槠渌被?，則 RcSAD1 酶所催化的底物對(duì) 16∶0-ACP 的選擇活性遠(yuǎn)高18∶0-ACP[23,25]。本試驗(yàn)多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)紫蘇PfSADs與擬南芥、蓖麻、可可和甘藍(lán)型油菜的關(guān)系較近，都含有硬?；?ACP脫氫酶的關(guān)鍵氨基酸和保守基序，說(shuō)明SAD的關(guān)鍵氨基酸和典型結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上是高度保守的，且其關(guān)鍵氨基酸和保守基序在鐵氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是SAD進(jìn)行底物特異性選擇的重要識(shí)別區(qū)域。對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，紫蘇6個(gè)SAD家族基因分別被聚到三類(lèi)，其中PfSAD1屬于第一類(lèi)，第二類(lèi)包含PfSAD2和PfSAD3，PfSAD4、PfSAD5和PfSAD6與擬南芥SAD6聚為第三類(lèi)，表明SAD的特定結(jié)構(gòu)域在生物進(jìn)化中具有高度保守性。

在擬南芥中，發(fā)現(xiàn)缺失SAD基因擬南芥突變體葉片中硬脂酸含量較高，且AtSSI2基因活性較高，在油酸(18∶1)合成中發(fā)揮重要作用[17,26]；牡丹PoSAD基因在花瓣及60 d種子中表達(dá)量最高，在根和10 d種子中的表達(dá)量最低[27]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)可可TcSAD1、TcSAD2和TcSAD7在各組織中均有表達(dá)，TcSAD3和TcSAD4在花中表達(dá)較高，TcSAD5在根中表達(dá)較高[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，PfSADs基因在紫蘇各組織器官中的表達(dá)有所差異。其中：PfSAD1在各組織中表達(dá)廣泛，但在葉中表達(dá)量最高，表明其主要在葉中行使功能；PfSAD2、PfSAD4在各組織中均有表達(dá)，特別是在發(fā)育種子中具有極高的表達(dá)量，且PfSAD2在開(kāi)花后30 d達(dá)到最高，PfSAD4在開(kāi)花后10 和30 d時(shí)較其他組織中具有更高的表達(dá)量，說(shuō)明PfSAD2和PfSAD4主要在種子中行使功能；PfSAD3在各組織中表達(dá)量均較高，尤其在種子發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量顯著高于在其他組織中的表達(dá)，推測(cè)其在各組織中均發(fā)揮作用，在發(fā)育種子中較顯著；PfSAD5僅在開(kāi)花后30 d表達(dá)較強(qiáng)，在其他組織中表達(dá)均較弱。PfSAD2-PfSAD5等4個(gè)基因均在發(fā)育種子中表達(dá)量較高，并且都在開(kāi)花后30 d達(dá)到最高值，說(shuō)明這4個(gè)基因在種子中發(fā)揮著重要作用并主要催化成熟期種子的表達(dá)，在脂肪酸合成過(guò)程中催化飽和脂肪酸脫氫反應(yīng)。PfSAD6僅在花中表達(dá)，在其他組織中不表達(dá)，且在同源序列比對(duì)中PfSAD6的關(guān)鍵氨基酸含有5個(gè)變異氨基酸，這可能與該基因在底物特異選擇上及其在紫蘇組織發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的功能存在一定的聯(lián)系，這與Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)可可TcSAD3和TcSAD4在花中表達(dá)較高的功能較為相似。

油酸為不飽和脂肪酸的重要組成部分，其含量是植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及理化性質(zhì)穩(wěn)定的重要影響因子，近年來(lái)，在油菜[14]、花生[28]等油料作物中已經(jīng)對(duì)SAD的功能進(jìn)行了鑒定，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行品種改良，實(shí)現(xiàn)了高油酸化。本研究獲得了紫蘇硬脂酰-ACP脫氫酶基因PfSADs，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)特性的研究，為進(jìn)一步提高紫蘇油酸含量提供了理論依據(jù)。