不同光質(zhì)對紅花檵木愈傷組織生長及黃酮類物質(zhì)含量的影響

郭佩瑤，鄧斯穎，張藝帆，許 璐，于曉英,3*，李炎林,3

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，長沙 410128；2 湖南省中亞熱帶優(yōu)質(zhì)花木繁育與利用工程技術(shù)中心，長沙 410128；3 教育部園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育工程研究中心, 長沙 410128)

紅花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)屬于金縷梅科檵木屬的常綠灌木或小喬木，具有較高的觀賞價(jià)值，廣泛應(yīng)用于園林種植，同時(shí)也是重要的民間藥用植物資源?，F(xiàn)代藥理研究表明紅花檵木根、花和葉均可藥用，含有較多的鞣質(zhì)、脂肪酸、還原糖、甙類、異槲皮甙、黃酮類和酚類物質(zhì)，臨床上廣泛用于上消化道出血、肺結(jié)核出血、產(chǎn)后出血及各類燒、燙傷等病癥。紅花檵木葉片中含有豐富的不飽和脂肪酸如亞油酸、山崳酸等，可以作為抗癌藥物和天然農(nóng)藥原料開發(fā)[1-4]。盧成瑛等[2]研究發(fā)現(xiàn)紅花檵木粗提物對細(xì)菌的生長有明顯的抑制作用。唐華等[3]的研究表明紅花檵木葉片揮發(fā)油的主要成分可用于醫(yī)藥衛(wèi)生、香料、食品添加劑和抗菌殺蟲劑等領(lǐng)域。唐華等[4]通過分離和鑒定紅花檵木葉的脂肪酸成分，發(fā)現(xiàn)含有大量不飽和脂肪酸，可作為中藥材原料。

然而，依靠土壤種植的植株獲得富含黃酮的植物提取物往往會受到很多環(huán)境因素以及病蟲害的影響，培養(yǎng)周期長，人工消耗大，而且通過種植次生代謝產(chǎn)物積累往往與生長環(huán)境條件需求方面存在矛盾[5]。但植物組織培養(yǎng)周期短、節(jié)約耕地及經(jīng)濟(jì)成本、周年可以規(guī)模化生產(chǎn)、培養(yǎng)條件可人為控制[6]，而且相關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過組織培養(yǎng)多數(shù)植物次生代謝產(chǎn)物的含量高于或接近原生植物[7-9]，如檵木[Loropetalumchinense(R.Br.)Oliv.]、白英(Solanumlyratum)和人參(Panaxginseng)等次生代謝產(chǎn)物含量均高于原生植物,因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物已成為生物制藥的趨勢[10]。在組培的環(huán)境條件中，光是非常重要的因子之一，光對植物的生長、光合作用、形態(tài)、次生代謝產(chǎn)物的合成和積累、基因表達(dá)都具重要的調(diào)控作用[11]。如王宇等[12]的研究表明UV-A可以顯著誘導(dǎo)成熟津田蕪菁(Brassicarapa‘Tsuda’)膨大肉質(zhì)根表皮花青素的大量積累。居鑫等[13]的研究結(jié)果顯示UV-A顯著提高了小豆芽菜(VignaangularisL.)類黃酮和總酚的含量。目前，關(guān)于紅花檵木植物組織培養(yǎng)技術(shù)較成熟，但對光質(zhì)影響其愈傷組織黃酮類物質(zhì)含量的研究還鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)以紅花檵木葉片誘導(dǎo)的愈傷組織為試驗(yàn)材料，通過測定不同光質(zhì)處理下愈傷組織的鮮重、干重、可溶性糖、丙二醛(MDA)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、花色素苷含量和總黃酮含量的變化，分析其對不同光質(zhì)的響應(yīng)機(jī)制，探究其次生代謝產(chǎn)物黃酮類物質(zhì)合成和累積的適宜光質(zhì)條件，以期為人為調(diào)控紅花檵木細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

以湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林花卉教學(xué)基地紅花檵木資源圃的 ‘花葉檵木1號’(編號為H1)、‘湘農(nóng)粉嬌’(編號為H2)為植物材料，以MS為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基附加1.0 mg·L-1NAA和0.5 mg·L-16-BA，將所誘導(dǎo)的葉片愈傷組織接種于MS+2.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代，置于不同光質(zhì)條件下培養(yǎng)。

1.2 光源參數(shù)與處理方法

試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)觀賞植物教學(xué)基地的組織培養(yǎng)室進(jìn)行，以黑暗為對照組(CK)，采用LED調(diào)制不同光質(zhì)對愈傷組織進(jìn)行光照培養(yǎng)。具體光質(zhì)條件參數(shù)見表1。所用LED均統(tǒng)一規(guī)格，處理組之間用黑色塑料膜隔開，避免光質(zhì)干擾。培養(yǎng)溫度為(25±0.5)℃，光照時(shí)間16 h·d-1。將愈傷組織隨機(jī)分為7組，每組30瓶，每瓶處理2 g，培養(yǎng)第15天和第30天時(shí)，測定愈傷組織的生長指標(biāo)、生理指標(biāo)和次生代謝物含量，每個(gè)指標(biāo)3個(gè)重復(fù)。

表1 試驗(yàn)光源控制系統(tǒng)

1.3 測定指標(biāo)及方法

分別取不同光質(zhì)處理15天和30 d后的愈傷組織，稱取其鮮重；將愈傷組織在60 ℃烘箱中烘干至恒重，稱取其干重；愈傷組織PAL活性、丙二醛和可溶性糖含量采用南京建成生物工程研究所定量試劑盒測定；花色素苷含量采用pH示差法[14]。

總黃酮含量參考文獻(xiàn)[15]方法，并稍作改動(dòng)，具體為：將愈傷組織烘干后，研磨成細(xì)粉，稱取干粉0.2 g，加60% 乙醇，料液比為1∶100，在100 W，60 ℃超聲提取40 min后，于12 000 r·min-1冷凍離心機(jī)中離心2次，每次10 min。取1 mL上清液，加入5% NaNO2溶液4 mL靜置6 min后，加入10% Al(NO3)3溶液4 mL靜置6 min，再加入4% NaOH 4 mL，最后用60%乙醇將溶液定容10 mL，靜置15 min后待測。以60%乙醇為空白，在510 nm波長處測量吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010整理數(shù)據(jù)；用OriginPro 2018作圖；用SPSS Statistics 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對愈傷組織生長的影響

不同光質(zhì)處理顯著影響紅花檵木愈傷組織的鮮重和干重(表2)。在鮮重上，處理第15天，W處理H1的愈傷組織的鮮重最高，比0 d時(shí)增加了14.5%；UV-A處理H2的鮮重最高，比0 d時(shí)增加了44%。30 d時(shí)，R處理H1和H2的鮮重增加顯著，對比0 d時(shí)分別增加了43.0%和76.0%；在干重上，15 d時(shí)，R處理H1的愈傷組織的干重最高，為0.14 g，比0 d時(shí)增加了55.6%；UV-A處理H2的干重最高，比0 d時(shí)增加了100%；第30天時(shí)，B+UV-A處理H1的干重比0 d時(shí)增加了100%，而各處理H2的干重增加不明顯，UV-A、BP和B+UV-A處理還略有下降趨勢。

表2 不同光質(zhì)對愈傷組織生長的影響

總體而言，相對其他幾種光質(zhì)，R更有利于愈傷組織鮮重的增加，B+UV-A和UV-A更有利于干重的增加；另外，在愈傷組織干重方面光質(zhì)的影響還存在一定的基因型差異，其中H1的干重在R、BP和B+UV-A處理下顯著提高(P<0.05)，但H2的干重增加不顯著，在處理30 d時(shí)還稍有下降趨勢。

2.2 不同光質(zhì)對愈傷組織生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 可溶性糖含量由表3可知，處理第15天，R處理的H1和H2的可溶性糖含量最高，分別為31.06和25.85 mg·g-1，比CK分別高30.17%和34.22%，其次是B和W，顯著高于其他處理組(P<0.05)；處理第30天時(shí)，R處理的H1和H2的可溶性糖含量分別高達(dá)36.69和34.75 mg·g-1，比0 d時(shí)分別增加了53.77%和50.17%，其次是B和W；CK、BP、B+UV-A和 UV-A 處理的H1和H2可溶性糖含量變化存在一定的基因型差異，H1都呈下降趨勢，其中B+UV-A處理第30天與0 d相比下降了15.75%，而H2的可溶性糖含量除了CK下降之外，BP、B+UV-A和 UV-A處理都略有增加。

表3 不同光質(zhì)對愈傷組織可溶性糖含量的影響

2.2.2 MDA含量由表4可知，處理第15天時(shí)，B+UV-A處理的H1的MDA含量為4.82 nmol·mg-1，BP處理的H2的MDA含量為6.14 nmol·mg-1，顯著高于其他處理組(P<0.05)，R處理H1和H2的MDA含量都為最低，分別是2.11和2.37 nmol·mg-1；處理第30天時(shí)，置于B+UV-A光下的H1和H2愈傷組織的MDA含量達(dá)到最高，分別為5.23和7.69 nmol·mg-1，比0 d分別增加了95.88%和196.91%，顯著高于其他處理組(P<0.05)。

表4 不同光質(zhì)對愈傷組織MDA含量的影響

總體而言，短波長光質(zhì)處理顯著提高了紅花檵木愈傷組織中的MDA含量，其中B+UV-A處理的增值最高；兩個(gè)試驗(yàn)材料相比，B+UV-A處理第30天時(shí)，H2的MDA含量比H1高了47.04%，可能是H2比H1的抗氧化特性要弱，以致B+UV-A對H2的膜質(zhì)傷害程度更重。

2.2.3 PAL活性由表5可知，處理15 d時(shí)，除R外，其他處理組處理的H1的愈傷組織PAL活性均比CK高，其中BP最高，為19.41 U·g-1鮮重，其次是B+UV-A，為18.30 U·g-1鮮重，顯著高于其他處理組(P<0.05)；UV-A處理的H2的愈傷組織PAL活性最高，為27.06 U·g-1鮮重，其次是BP，而R最低。

表5 不同光質(zhì)對愈傷組織 PAL活性的影響

處理第30天時(shí)，BP和B+UV-A處理的H1和H2的PAL活性顯著高于其他處理組(P<0.05)，B+UV-A處理的H1的PAL活性最高，比0 d時(shí)增加了58.49%；BP處理的H2的PAL活性高達(dá)53.57 U·g-1鮮重，比0 d時(shí)增加了44.7%，而R處理H1和H2的PAL活性都為最低，分別是14.34 U·g-1鮮重和11.52 U·g-1鮮重。BP和B+UV-A處理的H2的PAL活性比H1分別高52.23%和42.28%?？傮w而言，短波長光質(zhì)處理更有利于提高紅花檵木愈傷組織的PAL活性，其中BP和B+UV-A處理的增效最為顯著。

2.3 不同光質(zhì)對愈傷組織黃酮類物質(zhì)含量的影響

2.3.1 花色素苷含量如圖1所示，除R處理，其余處理從0 d到30 d H1和H2的花色素苷含量逐漸增加。處理15 d時(shí)，B處理的H1的花色素苷含量最高，比0 d時(shí)增加了18.27%，而R降低了2.4%，其他處理組之間不顯著(P>0.05)；BP處理的H2的花色素苷含量比0 d時(shí)增加了19.46%，而R降低了14.48%。

處理第30天時(shí)，BP處理的H1的花色素苷含量最高，為3.15 μmol·g-1，比處理前增加了51.44%，B、B+UV-A和UV-A分別增加了42.79%、33.65%和23.56%，而CK和W之間不顯著(P>0.05)。BP和B+UV-A處理的H2的花色素苷含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，分別增加了72.85%和68.33%，最低的是R，僅有1.57 μmol·g-1，比0 d時(shí)降低了28.5%。

短波長的光質(zhì)(B、BP、B+UV-A和UV-A)可促進(jìn)H1和H2的花色素苷合成，BP處理效果最為顯著，與藍(lán)紫光可以誘導(dǎo)CHS、F3H和DFR的表達(dá)有關(guān)[16]，BP處理30 d后，H2的花色素苷含量比H1高21.59%，可能是因?yàn)镠2的與花色素苷的合成有關(guān)的PAL活性高于H1。

2.3.2 總黃酮含量由圖2可知，不同光質(zhì)處理第15天，置于B+UV-A光下的H1的愈傷組織總黃酮含量最大，為125.91 mg·g-1，比0 d時(shí)增加了19.97%，而置于R、B和BP光下的愈傷組織總黃酮含量分別降低了13.52%、6.68%和6.23%；H2的愈傷組織總黃酮含量變化則與H1的有一定差異，它是在B處理下的含量最高，為192.79 mg·g-1，比處理前增加了37.17%；處理第30天，除置于R光下的H1和H2的愈傷組織總黃酮含量最低，分別比處理前降低了37.28%和7.14%之外，其他處理的含量均有增加。

總體而言，R光處理不利于紅花檵木愈傷組織黃酮類物質(zhì)的積累，短波長光質(zhì)B+UV-A和B處理更有利于總黃酮含量的增加，其中H1的含量在B+UV-A處理下增加效果最為顯著，H2的含量則在B處理下增加效果更為顯著。

3 討 論

適宜的光質(zhì)在愈傷組織增殖過程中，能降低黃酮生產(chǎn)過程中的能耗，提高生產(chǎn)效益。植物愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)可獲取大量愈傷組織材料用于黃酮類物質(zhì)的生產(chǎn)，目前關(guān)于不同光質(zhì)對紅花檵木黃酮含量的影響研究較少。相關(guān)學(xué)者對小麥(TriticumaestivumL.)[17]、非洲菊(GerberajamesoniiBolus)[18]和煙草(NicotianatabacumL.)[19]的研究結(jié)果表明，紅光或者紅光比例較高的光質(zhì)處理更有助于植物的生長。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，R處理后的紅花檵木生長狀態(tài)最佳。在處理過程中，單藍(lán)光處理不利于愈傷組織的生長，而在藍(lán)光與其他光質(zhì)組合的復(fù)合光質(zhì)(BP和B+UV-A)處理下，有利于愈傷組織的生長，與前人研究結(jié)果一致。

糖類是植物體內(nèi)重要的組成成分，可溶性糖含量作為中間產(chǎn)物能反映生長過程中代謝的快慢[20]。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)在紅光或紅光比例較高的光質(zhì)處理下，植物體內(nèi)可溶性糖含量較高。但是光質(zhì)對植物可溶性糖積累的影響也因植物種類不同而存在差異。例如，白菜葉片中可溶性糖含量在紅光的照射下最高[21]。在白光處理下的香椿芽苗菜的可溶性糖含量最高[22]，在白光和紅藍(lán)光比例相同的光質(zhì)處理下，更有利于櫻桃蘿卜成熟肉質(zhì)根中可溶性糖含量的積累[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，W和R處理均能促進(jìn)紅花檵木愈傷組織可溶性糖的合成。同時(shí)，R處理的愈傷組織鮮重和干重均最高，可能是R處理愈傷組織合成和累積的產(chǎn)物高于其他6組，從而促進(jìn)了愈傷組織的生長。

MDA含量常常反映植物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，可間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。當(dāng)植物處于逆境環(huán)境中，MDA含量越高，表明細(xì)胞膜受損的程度越大[24]。本試驗(yàn)中，R處理愈傷組織MDA含量較CK顯著降低，原因可能是植物體內(nèi)CAT活性提高從而增強(qiáng)自身活性氧解毒能力的效果，導(dǎo)致MDA含量降低，減輕了細(xì)胞膜受傷害的程度，這也是R處理促進(jìn)愈傷組織生長的原因之一。據(jù)報(bào)道，紅光處理下煙草[19]MDA含量最低，藍(lán)光處理增加了非洲菊[25]中膜質(zhì)傷害程度，表明當(dāng)植株受到嚴(yán)重的逆境傷害時(shí)，會影響植株的生長。本研究中，短波長光質(zhì)處理不同程度地增加了MDA含量，與前人研究結(jié)果相似。

PAL是苯丙烷類代謝和酚類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶，與植物體內(nèi)一些重要的次生代謝產(chǎn)物合成密切相關(guān)，在植物正常生長發(fā)育和抵御病菌侵害過程中起重要作用。當(dāng)植物處于逆境環(huán)境中，植物通過增強(qiáng)與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)酶的基因表達(dá)，來保護(hù)自身免受損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BP、B+UV-A和UV-A處理下，愈傷組織中PAL活性高于對照和其他處理組。魯燕舞等[26]研究發(fā)現(xiàn)，相比于黑暗條件，藍(lán)光處理更能提高蘿卜中PAL的活性。有關(guān)光質(zhì)對次生代謝產(chǎn)物合成過程中其他關(guān)鍵酶的影響，還需進(jìn)一步研究。

藍(lán)光和紫外光是促進(jìn)植物花色素苷合成最有效的光質(zhì)，紫外線輻射激活植物內(nèi)的抗氧化酶，引起氧化反應(yīng)，同時(shí)合成谷胱甘肽、抗壞血酸和酚類等抗氧化物質(zhì)[27]。不同光質(zhì)處理后的植物生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)來應(yīng)對環(huán)境的改變，這可能是植物的一種自我防御機(jī)制。多數(shù)研究表明藍(lán)光或藍(lán)光比例較高的光質(zhì)處理有利于植物花色素苷的合成。如藍(lán)光處理更有利于番茄幼苗中花色素苷的合成[28]，在培養(yǎng)紅葉白菜時(shí)，增加藍(lán)光能促進(jìn)其花色素苷的合成[29]；藍(lán)光處理的馬鈴薯花色素苷含量較高[30]。藍(lán)光和紫外光誘導(dǎo)擬南芥(Arabidopsisthaliana)[31]花色素苷的合成。同時(shí)，紅光對植物合成花色素苷起到抑制作用，如紅光處理后菊花(Chrysanthemum)舌狀花顏色變淺，與花色素苷合成相關(guān)的基因表達(dá)量明顯下降[32]；單一光照或紅光比例較高時(shí)，紫葉甘薯(Ipomoeabatatas)[33]中花色素苷含量較低。但也有研究發(fā)現(xiàn)紅光能促進(jìn)植物合成花色素苷[34-35]。說明光質(zhì)對植物合成花色素苷的影響與植物種類或基因型有關(guān)。本試驗(yàn)中，短波光質(zhì)B、BP、B+UV-A和UV-A處理可促進(jìn)紅花檵木愈傷組織花色素苷合成，而紅光(R)處理使花青素苷總含量有所下降，BP處理30 d后，H2的花色素苷含量就比H1高21.59%。

不同的光質(zhì)對黃酮類化合物的合成也有較大的影響。相關(guān)學(xué)者對蘿卜芽苗菜[26]、青錢柳葉(Cyclocaryapaliurus)[36]和大豆芽苗(Glycinemax)[37]的研究表明藍(lán)光和紫外光處理后黃酮類化合物含量顯著提高；也有研究發(fā)現(xiàn)，紅光有助于三葉崖爬藤(Tetrastigmahemsleyanum)合成黃酮類成分[38]。在本試驗(yàn)中，紅光(R)處理不利于黃酮類物質(zhì)的積累，短波B+UV-A和B處理更有利于總黃酮含量的增加，且存在一定的基因型差異，研究結(jié)果與前人不完全一致，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

R更有利于紅花檵木愈傷組織鮮重的增加，但不利于其黃酮類物質(zhì)的積累；B+UV-A和UV-A有利于干重、PAL活性的增加，其中B+UV-A處理效果比較顯著；短波光質(zhì)B、BP、B+UV-A和UV-A處理可促進(jìn)紅花檵木愈傷組織花色素苷合成，B+UV-A和B處理更有利于總黃酮含量的增加；在愈傷組織干重、花色素苷與總黃酮含量方面光質(zhì)的影響存在一定的基因型差異。