莖瘤芥異戊烯基轉移酶家族基因全基因組鑒定及表達分析

蔡兆明，程春紅，廖靜靜，王殿東

(長江師范學院 生命科學與技術學院, 重慶 408100)

細胞分裂素是一種重要的植物激素，可調控植物細胞分裂、蛋白合成、愈傷組織形成、分枝數(shù)目、響應逆境脅迫等多個過程[1-5]，同時細胞分裂素在提高植物產量和結實率方面具有很大潛力[6-8]。異戊烯基轉移酶(isopentenyl transferases，IPT)是合成細胞分裂素的關鍵限速酶，可分為兩類，一類以ATP/ADP為底物催化產生異戊烯基腺嘌呤(isopentenyladenine，iP)和反式玉米素(trans-zeatin)，另一類以tRNA為底物合成順式玉米素(cis-zeatin)[9]。在擬南芥中，共鑒定到9個AtIPT蛋白，其中AtIPT1和AtIPT3-8以ATP/ADP為原料合成細胞分裂素，AtIPT2和AtIPT9則以tRNA為原料合成細胞分裂素[10]。IPT基因在調控植物生長發(fā)育和抵御逆境脅迫過程中具有重要功能。在小麥中異源過表達來源于根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的IPT基因后，可顯著減少干旱脅迫造成的產量損失[11]，而將該基因在煙草中過表達后，轉基因植株則表現(xiàn)為葉片衰老延緩的表型[12]。

目前，已在多個物種中克隆出了IPT基因，如在北沙參(Glehnialittoralis)中，GlIPT1基因被克隆并發(fā)現(xiàn)該基因在花中表達水平很高[13]。在杭菊(Chrysanthemummorifolium)中，CmIPT1被克隆出來并發(fā)現(xiàn)過表達該基因可增加擬南芥的分枝[14]。在苜蓿(Medicagotruncatula)中，有21個IPT基因被鑒定出來，并發(fā)現(xiàn)MtIPT3可能參與根瘤數(shù)目調控過程[15]。在與苜蓿同為豆科植物的大豆(Glycinmax)中，有17個IPT基因被鑒定出來，并發(fā)現(xiàn)GmIPT3和GmIPT15參與對土壤氮元素的響應[16]。這些研究為后續(xù)解析IPT基因在不同物種中的功能奠定了基礎。

莖瘤芥(Brassicajunceavar.tumida)是重慶地區(qū)主栽的經(jīng)濟作物之一，其莖部發(fā)生膨大(又名青菜頭)，是制作榨菜的主要原料，具有很高的經(jīng)濟價值?；诩毎至阉卦谡{控植物細胞分裂和抵抗逆境脅迫方面的功能，對細胞分裂素合成基因IPT家族成員進行研究可為提高莖瘤芥的瘤莖產量和培育優(yōu)質抗逆栽培品種提供依據(jù)。本研究在全基因組水平對莖瘤芥IPT家族成員進行了鑒定，并分析了它們的基因和蛋白結構特性、系統(tǒng)進化情況，以及在不同組織器官和主要逆境條件下的表達模式，以期為后續(xù)的功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

為了檢測IPT基因在莖瘤芥不同器官中的表達水平，將栽培品種‘永安小葉’的種子播種在含有培養(yǎng)基質(蛭石∶營養(yǎng)土=3∶1)的7 cm直徑的花盆中，置于培養(yǎng)室中進行光照培養(yǎng)，溫度為22 ℃，光照時間16 h，黑暗8 h。對培養(yǎng)至生殖生長期植株的根、莖、葉、花和種莢進行取樣。每個器官取3株樣品的混合材料包于錫箔紙中，立即用液氮速凍后放入超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)總RNA提取及PCR檢測。

為檢測IPT基因在鹽脅迫條件下的基因表達模式，利用上述培養(yǎng)方法將‘永安小葉’培養(yǎng)2周，將200 mmol/L NaCl溶液50 mL澆至植株根部，分別在處理6、12、24和48 h后對植株根系進行取樣，0 h對照為澆灌50 mL蒸餾水后立即進行根系取樣，取樣方法同上。該取樣進行3次生物學重復。

為檢測IPT基因在根腫菌脅迫條件下的基因表達模式，以5 mLOD600為0.07的根腫菌休眠孢子提取液澆灌培養(yǎng)2周大的莖瘤芥幼苗根周，于處理后12、24、36和72 h對植株根系進行取樣，0 h為對照，取樣方法同上。該取樣進行3次生物學重復。

1.2 方 法

1.2.1 生物信息學分析在擬南芥基因資源庫(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥IPT家族基因的蛋白序列，其基因ID見表1。以擬南芥IPT蛋白序列為搜索條件，在蕓薹屬網(wǎng)站(http://brassicadb.org/brad/)中的莖瘤芥全基因組(chromosome V1.5)中搜索與其序列一致性較高的蛋白，參數(shù)設置為E< 1e-10, 一致性> 70%，覆蓋度> 95%，其他參數(shù)選擇默認。采用在線分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對獲得序列的蛋白結構域進行預測，去除冗余序列和不含腺苷酸異戊烯基轉移酶或轉運RNA二甲丙烯基轉移酶結構域的序列。利用在線分析工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)計算各蛋白的分子量和等電點。采用在線分析軟件(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結構。使用MEGA5軟件構建莖瘤芥IPT蛋白系統(tǒng)進化樹，選擇鄰接樹算法，p距離模型，插入缺失處理方式選擇配對刪除，靴帶值(bootstrap)選擇1 000次重復。

表1 擬南芥IPT基因名和ID

1.2.2 莖瘤芥總RNA提取及熒光定量PCR檢測采用SimGEN公司(杭州，中國)的植物總RNA提取試劑盒進行總RNA提取，使用全式金公司(北京，中國)的TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄加入模板RNA的用量為500 ng，并將cDNA稀釋10倍用于qRT-PCR檢測。采用羅氏(Roche)Light Cycler 480 Ⅱ 熒光定量PCR儀進行qRT-PCR分析，使用全式金公司TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒配制10 μL反應體系：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 5 μL，cDNA 0.5 μL，正、反向引物各0.5 μL，ddH2O 3.5 μL。反應程序為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。內參基因為莖瘤芥Bju18SrRNA(BjuA046942)，所用引物序列見表2。

表2 熒光定量PCR引物

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用2-ΔΔCt方法對qRT-PCR結果數(shù)據(jù)進行分析，計算各基因相對于內參基因的表達量。使用Heml軟件對IPT基因在莖瘤芥不同組織中的表達進行熱圖分析，利用SigmaPlot 10.0軟件對鹽脅迫和根腫菌脅迫條件下IPT基因表達檢測結果進行分析并作圖，使用SPSS 16.0軟件，選則one-way ANOVA的單因素方差分析(LSD)檢驗基因表達差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 莖瘤芥IPT基因鑒定及特性分析

通過序列比對和篩選，在莖瘤芥基因組中共鑒定到27個IPT家族基因(表3)，它們的基因長度在996 bp(BjuA041428)～5 326 bp(BjuA041927)之間，基因編碼序列(CDS)長度在942 bp(BjuB010173)～2 172 bp(BjuB041047)之間，蛋白序列長度在313 aa(BjuB010173)～723 aa(BjuB041047)之間。等電點和分子量分析結果表明，莖瘤芥IPT蛋白等電點在5.46(BjuB010173)～9.41(BjuB000734)之間，分子量在37.12 kD(BjuB007803)～81.67 kD(BjuB041047)之間(表3)。

表3 莖瘤芥IPT基因的基本信息

2.2 莖瘤芥IPT基因結構及系統(tǒng)進化分析

進化分析結果顯示，9個擬南芥IPT蛋白和27個莖瘤芥IPT蛋白在系統(tǒng)進化樹上可聚類為7個分支，IPT1/4分支包含擬南芥AtIPT1、AtIPT4和4個莖瘤芥IPT蛋白；IPT6/8分支包含擬南芥AtIPT6、AtIPT8和3個莖瘤芥IPT蛋白；IPT3分支包含擬南芥AtIPT3和4個莖瘤芥IPT蛋白；IPT5分支包含擬南芥AtIPT5和5個莖瘤芥IPT蛋白；IPT7分支包含擬南芥AtIPT7和5個莖瘤芥IPT蛋白；IPT2分支包含擬南芥AtIPT2和2個莖瘤芥IPT蛋白；IPT9分支包含擬南芥AtIPT9和4個莖瘤芥IPT蛋白(圖1)。

基因結構分析結果表明，IPT1/4、IPT3和IPT7三個分支中的基因只含一個外顯子；在IPT6/8分支中的4個莖瘤芥IPT基因含有2個外顯子和1個內含子，與擬南芥AtIPT8的基因結構相同。在IPT5分支中除BjuB010173外(2個外顯子)，其余4個基因僅含1個外顯子。在IPT2分支中，BjuB026254與AtIPT2均含有10個外顯子，而BjuA016315則含有13個外顯子(圖1)。在IPT9分支中，BjuB045839與BjuA041490均含有12個外顯子，而BjuB041047與BjuA041927含有14個外顯子，它們的基因結構與AtIPT9(11個外顯子)有較大差異(圖1)。

2.3 莖瘤芥IPT基因染色體定位分析

染色體定位分析結果表明，莖瘤芥IPT基因在全基因組18條染色體中的14條染色體上均有分布，其中A05、A06、A08和B04染色體上不含IPT基因(表 4)。B05染色體上含有的IPT基因數(shù)目最多(4個)，其次在A01和A02染色體上各含有3個IPT基因。莖瘤芥A染色體組中共含有14個IPT基因，B染色體組含有13個IPT基因，IPT基因在兩個染色體組中的數(shù)目近似均等。

表4 莖瘤芥IPT家族基因染色體定位信息

2.4 莖瘤芥IPT家族蛋白保守結構域分析

蛋白保守結構域分析結果表明，IPT1/4、IPT3、IPT5、IPT6/8和IPT7家族蛋白均含有一個PLN02165結構域(圖2)，為腺苷酸異戊烯基轉移酶(adenylate isopentenyl transferase)的典型結構域，該結構對于以ATP/ADP為底物和合成細胞分裂素的ADP/ATP型IPTs發(fā)揮功能十分重要。IPT2和IPT9家族蛋白均含有一個PLN02748結構域，該結構域為tRNA二甲丙烯基轉移酶(tRNA dimethylallyl transferase)的典型結構域。依據(jù)所含的主要保守結構域可以判斷，在莖瘤芥中，IPT1/4、IPT3、IPT5、IPT6/8和IPT7家族蛋白全部成員為ADP/ATP型IPT，IPT2和IPT9家族蛋白全部成員為tRNA型IPT。此外，IPT2分支中的BjuA016315還含有一個transcrip_act結構域，推測該蛋白可能同時具有轉錄激活活性。

2.5 莖瘤芥IPT家族基因在不同器官中的表達分析

為分析IPT家族基因在莖瘤芥不同組織中的表達模式，采用qRT-PCR的方法對不同器官中IPT家族基因表達水平進行了檢測。結果表明，BjuB006281在各個器官中的表達水平均相對較高(圖3)，且在莖中的表達水平最高，說明該基因可能在調控瘤莖發(fā)育過程中發(fā)揮功能。相比于其他組織，BjuA027211、BjuB010173、BjuB010174和BjuA001839在根中的表達水平較高，推測它們主要對根的相關功能進行調控；BjuA014415、BjuB022918、BjuA041428、BjuA044830、BjuA046449和BjuB007352主要在根和莖中表達。在葉和花中特異表達的IPT基因較少，僅BjuB041047在葉中表達高于其他組織；雖然在各器官中BjuA012640在花中的表達水平高于其他組織，但相比于內參基因其表達量仍舊很低，推測在莖瘤芥中IPT對葉和花器官的調控作用可能較小。

2.6 莖瘤芥IPT基因在鹽脅迫條件下的表達分析

為鑒定出響應鹽脅迫的莖瘤芥IPT基因，選擇了18個在根中表達水平相對較高的IPT成員，并對它們在200 mmol/L NaCl脅迫處理不同時間點的根中的表達水平進行了檢測。結果(圖4)表明，大部分的IPT基因均受鹽脅迫的下調表達。其中，BjuB006281、BjuA036403、BjuB010173、BjuB026254在鹽脅迫處理12～48 h顯著下調表達；BjuB022918和BjuB007352則在鹽處理24～48 h顯著下調表達；BjuA041428、BjuA044830、BjuA016315的表達水平在鹽脅迫處理6～24 h就受到顯著的抑制，說明它們可能在鹽脅迫早期即參與植物的響應過程。與其他基因不同，BjuA014415在鹽處理6和12 h受到顯著的誘導表達，推測該基因與其他基因在莖瘤芥相應鹽脅迫過程中的功能不同。

2.7 莖瘤芥IPT基因在根腫菌脅迫下的表達分析

基于細胞分裂素在植物抗病方面的作用，為挖掘調控莖瘤芥在抗根腫病中可能發(fā)揮功能的IPT基因，選擇了18個在根中表達水平相對較高的IPT成員，檢測它們在根腫菌處理后莖瘤芥根中的表達變化。結果表明，大部分莖瘤芥IPT基因在12 h受到根腫菌侵染的顯著誘導，如BjuB006281、BjuA036403、BjuA014415、BjuB022918、BjuB002482、BjuB024133、BjuA046449、BjuB007352、BjuA001840、BjuA001839、BjuA016315和BjuB026254，說明這些IPT基因可對根腫菌侵染做出快速反應；同時也有一些基因在侵染24～72 h表達水平發(fā)生顯著變化。如BjuB022918和BjuB007352不僅在12 h被誘導表達，在24 h的表達水平也顯著高于對照；而BjuB024133雖然在12 h被顯著誘導表達，但在72 h其表達水平則受到抑制(圖5)，說明該基因參與莖瘤芥對根腫菌侵染的響應過程更為復雜。

3 討 論

目前已有多個物種的IPT家族基因被鑒定出來，如在水稻(Oryzasativa)[17]、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[18]、麻風樹(Jatrophacurcas)[19]、蘋果(Malusdomestica)[20]、白菜(Brassicarapa)[21]中分別鑒定到9、10、6、12、13個IPT家族成員。在莖瘤芥中鑒定到的IPT家族基因數(shù)目約為擬南芥和水稻的3倍，為白菜的2倍有余，這與莖瘤芥及其祖先在進化過程中基因組擴張有關。已有研究報道，在十字花科中，蕓薹屬植物由擬南芥進化而來后又發(fā)生了一次基因組三倍化事件[22]，但白菜IPT基因數(shù)目遠小于擬南芥的3倍，表明基因組三倍化后存在IPT基因的丟失[21]，而莖瘤芥作為白菜和黑芥異源雜交的變種在該進化過程中又發(fā)生了一次染色體組加倍[23]，導致莖瘤芥IPT基因數(shù)目進一步增加。此外，莖瘤芥A01染色體含有3個IPT基因，而白菜A01染色體僅含有2個IPT基因，推測基因的串聯(lián)重復也是導致莖瘤芥IPT基因數(shù)目進一步增加的原因。由于不同IPT基因可能在合成細胞分裂素功能上存在冗余，加之莖瘤芥IPT基因的加倍化，后續(xù)對它們進行功能研究需要著重考慮基因間功能互補產生的影響。

相比于其他組織，IPT3、IPT5和IPT7分支的絕大部分基因在根中的表達水平最高，可能與細胞分裂素主要在根部合成有關。在擬南芥和白菜中，同樣發(fā)現(xiàn)了這3個基因在根中的高表達[21, 24]，說明這3個亞家族的基因功能十分保守，均是根部細胞分裂素合成過程中的主要成員。

已有研究表明，鹽脅迫可導致擬南芥細胞分裂素含量降低，進而增強植株對鹽脅迫的耐受性[25]。KNOX基因可以通過IPT3促進細胞分裂素合成，在玉米中，經(jīng)過鹽處理的根中差異表達的ZmKNOX基因絕大多數(shù)為下調表達，與本研究中鹽處理抑制大部分IPT基因的表達情況一致[26]。在擬南芥中，過表達IPT8后，植株活性氧含量增加，同時對鹽脅迫的耐受性降低[27]。在莖瘤芥中，鹽脅迫處理后，大部分IPT基因顯著下調表達，說明通過抑制IPT的表達來減少植株體內細胞分裂素合成也是莖瘤芥響應鹽脅迫的主要方式之一。

已有研究表明內源或外源的細胞分裂素處理可增強植物對病原菌的抗性[28]，在擬南芥中過表達IPT1、IPT3、IPT5或IPT7均可以抑制病原菌Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000的生長，此外，過表達IPT3還可使擬南芥在病原菌侵染后積累更多的胼胝體以抵御病原菌的侵害[29]。IPT作為合成細胞分裂素的主要基因同樣可能在莖瘤芥抗根腫病方面發(fā)揮功能。在檢測的莖瘤芥IPT家族基因中，大部分成員均在根腫菌侵染后上調表達，推測莖瘤芥在被侵染早期即可通過迅速增加內源細胞分裂素含量來抵御根腫菌的侵害。研究發(fā)現(xiàn)，根腫菌侵染白菜1 d后，根中的BrIPT1可被誘導表達8倍以上，與莖瘤芥大部分基因具有類似的被根腫菌侵染誘導表達的特點一致[30]。然而，莖瘤芥IPT1分支的基因在根中表達水平過低導致很難檢測得到，但多個其他分支的IPT基因在根部均受根腫菌侵染的顯著誘導，推測這些基因很可能與白菜BrIPT1一樣可在抵抗根腫菌侵染過程中發(fā)揮作用。

作者貢獻：蔡兆明和程春紅負責本研究的實驗計劃與執(zhí)行，廖靜靜負責數(shù)據(jù)和部分結果分析，蔡兆明負責論文初稿寫作；王殿東是項目的負責人，指導實驗設計、數(shù)據(jù)分析以及論文的修改。全體作者都閱讀并同意最終文本。