紫花苜蓿UV-B光受體基因MsUVR8的克隆及功能研究

趙麗晶，劉 英，習(xí)亞君，王小飛，高麗美

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030000)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上種植面積和種植范圍最廣泛的豆科牧草[1]，也是一種藥用植物，具有抗菌、抗炎、抗哮喘、利尿和改善記憶等藥用功效[2]。研究表明，紫花苜蓿根系對(duì)各種環(huán)境污染物具有耐受性[3]，在改善和修復(fù)生態(tài)環(huán)境方面扮演重要角色。在中國(guó)紫花苜蓿有2000多年的種植歷史，現(xiàn)主要分布于華北、東北、西北等地區(qū)。然而，北方地區(qū)太陽(yáng)紫外線輻射強(qiáng)度的不斷增加，對(duì)苜蓿種植和生產(chǎn)構(gòu)成了潛在威脅[4]，因此，研究紫花苜蓿UV-B響應(yīng)機(jī)制對(duì)于指導(dǎo)苜?？鼓嬗N具有重要意義[5]。

UV-B(280～320 nm)是太陽(yáng)光固有的組成部分。大氣中約95% UV-B被臭氧層吸收，并以1 W/m2的平均強(qiáng)度到達(dá)地球表面[6]。UV-B輻射會(huì)對(duì)植物光敏形態(tài)建成產(chǎn)生明顯影響，進(jìn)而改變植物的生長(zhǎng)發(fā)育[7]。UV-B輻射具有雙重效應(yīng)，一方面可以作為調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的信號(hào)因子，同時(shí)高劑量UV-B輻射也可以對(duì)植物器官發(fā)育造成抑制[8-9]。UV-B增強(qiáng)會(huì)誘發(fā)植物產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，如一定劑量的UV-B輻射可誘導(dǎo)植物葉片過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，激活葉片清除自由基的能力，提高植物對(duì)UV-B脅迫的抗性[10]。但是，高強(qiáng)度UV-B 輻射則會(huì)嚴(yán)重抑制植物生理代謝，降低作物的產(chǎn)量品質(zhì)[11]。因此，高等植物通過增強(qiáng)自身免疫系統(tǒng)形成了多種重要的抗逆防御機(jī)制，如UV-B特異性光受體——UVR8 介導(dǎo)的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑就是植物適應(yīng)UV-B脅迫的重要策略之一[12]。

UVR8(UV resistance locus 8)是植物感知UV-B的光受體，也是目前唯一報(bào)道的紫外光受體[13]。UV-B輻射可誘導(dǎo)UVR8發(fā)生單體化激活和核內(nèi)積累[14]，通過與一系列轉(zhuǎn)錄因子互作，參與調(diào)控植物的光形態(tài)發(fā)生[15]。在沒有UV-B的情況下，UVR8蛋白形成同源二聚體，分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中；而在暴露于UV-B輻照作用下時(shí)，UVR8利用其色氨酸作為發(fā)色團(tuán)感知UV-B，發(fā)生單體化激活[16]，快速進(jìn)入并積累到細(xì)胞核內(nèi)[17]。UVR8進(jìn)化上高度保守，在綠藻、苔蘚和被子植物光敏形態(tài)建成中都發(fā)揮著積極作用[18]。在擬南芥葉片中，UV-B輻射下類黃酮和花青素合成過程受到UVR8受體的調(diào)節(jié)[19]。他人研究表明，除了介導(dǎo)UV-B光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)外，UVR8還參與調(diào)控著了其他多個(gè)生理發(fā)育過程。例如UVR8調(diào)節(jié)番茄果實(shí)葉綠體的發(fā)育，以及葉綠素、類胡蘿卜素、淀粉和番茄紅素的合成，從而影響其成熟發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[20]。然而，目前關(guān)于UVR8的研究主要集中在蛋白結(jié)構(gòu)、分子進(jìn)化、光信號(hào)的吸收、傳遞等方面[21], 且對(duì)UVR8信號(hào)調(diào)控機(jī)制研究較清楚的僅限于模式生物擬南芥，關(guān)于豆科植物紫花苜蓿UVR8的研究報(bào)道還尚屬空白。

本研究采用RACE擴(kuò)增技術(shù)分離克隆了紫花苜蓿的一個(gè)UV-B光受體基因MsUVR8，在詳細(xì)闡述其生物信息特性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的基礎(chǔ)上，采用紫花苜蓿細(xì)胞為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，篩選獲得了紫花苜蓿MsUVR8過表達(dá)系，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步探究。這些結(jié)果將填補(bǔ)植物UV-B光受體研究領(lǐng)域的空白，也為深入了解豆科植物響應(yīng)UV-B的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)‘金皇后’種子由江蘇草業(yè)有限公司提供。紫花苜蓿種子在(21±2)℃、相對(duì)濕度70%、光/暗周期16 h/8 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)2周。

大腸桿菌DH5α(EscherichiacoliDH5α)、農(nóng)桿菌GV3101(AgrobacteriumGV3101)、真核表達(dá)載體pCAMBIA1300-GFP由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 紫花苜蓿MsUVR8基因克隆提取紫花苜蓿幼苗RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)同源物種蒺藜苜蓿MtUVR8(XM_003630280.3)序列，設(shè)計(jì)特異性引物F(CTTCACCTCCCCATGTTCTTCTTAT)和R(TTGGAACAACCGCATATCTCTCTGA)，進(jìn)行PCR反應(yīng)后回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 RACE擴(kuò)增及序列驗(yàn)證根據(jù)UVR8核心片段的堿基序列，設(shè)計(jì)3′-RACE和5′-RACE擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增。為進(jìn)一步確定紫花苜蓿MsUVR8基因的全長(zhǎng)序列，重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)測(cè)序結(jié)果找到其CDS區(qū)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析進(jìn)入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)紫花苜蓿MsUVR8基因序列進(jìn)行Blastn檢測(cè)，對(duì)紫花苜蓿MsUVR8蛋白進(jìn)行Blastp檢測(cè)，分析序列相似性。進(jìn)入ExPASy網(wǎng)站分析蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)入HMM網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用Phyre2網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。用MEGA軟件對(duì)紫花苜蓿UVR8蛋白的同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)構(gòu)建UVR8蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 黃酮醇熒光檢測(cè)及抗氧化性能檢測(cè)對(duì)野生型和MsUVR8過表達(dá)的愈傷組織，以及UV-B輻射處理的野生型和MsUVR8過表達(dá)的愈傷組織，進(jìn)行對(duì)-二苯氨基苯基硼酸(DPBA)-黃酮醇熒光染色、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色和氮藍(lán)四唑(NBT)染色，然后顯微鏡下觀察。

1.2.5 UV-B信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)對(duì)紫花苜蓿野生型和MsUVR8過表達(dá)的愈傷組織、低劑量UV-B輻射處理后的野生型和MsUVR8過表達(dá)的愈傷組織，進(jìn)行RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃酮醇合成酶(FLS)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因的特異性引物(表1)，以cDNA為模板，用試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，檢測(cè)與類黃酮合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 MsUVR8同源克隆

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，3′-RACE擴(kuò)增獲得約750 bp條帶，5′-RACE擴(kuò)增獲得約450 bp條帶，經(jīng)拼接兩段序列獲得MsUVR8基因的全長(zhǎng)序列為1 678 bp(圖1)。進(jìn)一步分析其堿基序列中開放閱讀框區(qū)域，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)為834 bp的一段CDS序列(圖2)，命名為MsUVR8。

2.2 MsUVR8生物信息學(xué)分析

分析顯示，MsUVR8基因堿基序列和編碼氨基酸序列與蒺藜苜蓿的相似度均高達(dá)95%以上。MsUVR8蛋白形成了不完整的β-折疊結(jié)構(gòu)，蒺藜苜蓿MtUVR81(>XP_003630328.2)具有7個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)，MtUVR82(>XP_003630331.2)則也形成了不完整的折疊結(jié)構(gòu)。另外，羅秋蘭等[22]的研究表明大豆中含有4 個(gè)不同的GmUVR8蛋白質(zhì)，且它們也形成了完整或不完整的七葉β-折疊的結(jié)構(gòu)(圖3)。這些預(yù)測(cè)結(jié)果表明豆科植物與模式植物擬南芥的AtUVR8在序列和結(jié)構(gòu)上有一定的相似度，但是又具有其獨(dú)特性。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明該蛋白與豆科植物鷹嘴豆屬于同一分支(圖4)。

2.3 紫花苜蓿過表達(dá)系黃酮醇熒光檢測(cè)

野生型和MsUVR8過表達(dá)的愈傷組織經(jīng)UV-B輻射后，DPBA熒光標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MsUVR8過表達(dá)愈傷組織中黃酮醇含量明顯升高。原因可能是UV-B輻射促進(jìn)了細(xì)胞中黃酮醇的合成(圖5)。

2.4 紫花苜蓿過表達(dá)系紫外吸收物的含量

野生型愈傷組織與經(jīng)UV-B輻射后的野生型愈傷組織類黃酮物質(zhì)含量無顯著差異，MsUVR8過表達(dá)愈傷組織類黃酮含量較野生型含量明顯升高，推測(cè)其原因可能是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)促進(jìn)了類黃酮物質(zhì)的生物合成。經(jīng)UV-B輻射后過表達(dá)愈傷組織的類黃酮物質(zhì)含量進(jìn)一步顯著升高，可能是UV-B激活了過表達(dá)的光受體MsUVR8活性，促進(jìn)了類黃酮化合物的合成(圖6, A)。

花青素是紫花苜蓿組織中主要的類黃酮物質(zhì)之一，經(jīng)UV-B輻射后的野生型愈傷組織花青素含量高于野生型愈傷組織，經(jīng)UV-B輻射后MsUVR8過表達(dá)愈傷組織花青素含量高于未經(jīng)UV-B輻射的MsUVR8過表達(dá)愈傷組織，可能是UV-B輻射后激活了野生型愈傷組織內(nèi)源UVR8受體活性，使花青素含量明顯升高。MsUVR8過表達(dá)愈傷組織中花青素含量高于野生型愈傷組織，說明MsUVR8過表達(dá)愈傷組織中花青素含量升高可能仍然與農(nóng)桿菌浸染的刺激作用有關(guān)(圖6, B)。愈傷組織中總酚含量經(jīng)UV-B輻射后均無顯著變化，過表達(dá)愈傷組織中總酚含量較野生型明顯增加，說明總酚含量?jī)H受到農(nóng)桿菌浸染的刺激促進(jìn)了合成，UV-B輻射對(duì)其無顯著影響(圖6, C)。

2.5 紫花苜蓿過表達(dá)系ROS積累

UV-B輻射處理后紫花苜蓿愈傷組織褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，MsUVR8過表達(dá)愈傷組織經(jīng)UV-B照射后褐化現(xiàn)象減輕。DAB和NBT染色顯示，UV-B輻射后野生型愈傷組織過氧化氫和超氧陰離子積累增加，MsUVR8過表達(dá)愈傷組織中兩種物質(zhì)積累與未經(jīng)UV-B輻射的愈傷組織差異不明顯(圖7)，可能是MsUVR8增強(qiáng)了植物組織細(xì)胞的抗氧化性能。

2.6 過表達(dá)系UVR8信號(hào)通路效應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄分析

對(duì)UV-B信號(hào)通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)結(jié)果(圖8)顯示，農(nóng)桿菌浸染處理均促進(jìn)了PAL、CHS、CHI和FLS等4種類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)，UV-B輻照后野生型愈傷組織中PAL、CHS和FLS表達(dá)明顯被激活，CHI表達(dá)無明顯差異。MsUVR8過表達(dá)愈傷組織經(jīng)UV-B處理后，4種基因表達(dá)活性均最大，相對(duì)其他3組表達(dá)量均顯著增強(qiáng)。

3 討 論

紫花苜蓿除了被用作優(yōu)質(zhì)牧草外，在保護(hù)生態(tài)環(huán)境、治理綠化荒地方面也具有積極作用[23]。UV-B輻射在表型結(jié)構(gòu)、生理代謝、光敏形態(tài)建成等方面對(duì)植物產(chǎn)生著顯著影響[24]。UVR8 是目前唯一已知的植物 UV-B 特異性光受體，介導(dǎo)UV-B 誘導(dǎo)的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和光形態(tài)建成反應(yīng)。但是關(guān)于 UVR8 的相關(guān)研究目前主要集中在模式植物擬南芥和水稻等作物中，在豆科植物紫花苜蓿中的研究還未見報(bào)道[25]。

本研究分離克隆得到的MsUVR8基因堿基序列和氨基酸序列與MtUVR8基因的相似度極高，MsUVR8蛋白形成不完整的折疊結(jié)構(gòu)與MtUVR8 蛋白序列和結(jié)構(gòu)上有一定的相似度，但又具有其自身獨(dú)特性。在大豆中也發(fā)現(xiàn)了同樣獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，GmUVR8蛋白形成了完整的和不完整的7葉β-折疊結(jié)構(gòu)[22]。人們發(fā)現(xiàn)在高等植物和真核藻類細(xì)胞中都存在UVR8 蛋白，包括蘋果、大豆、單細(xì)胞藻類萊茵衣藻、苔蘚植物小立碗蘚和地錢等[26-29]。對(duì)于早期陸地植物而言，必須進(jìn)化出一種保護(hù)自身免受 UV-B脅迫損傷的防御機(jī)制才能適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境的變化，這種機(jī)制在由水體向陸地環(huán)境過渡的過程中得到了進(jìn)化。研究表明，這種UV-B保護(hù)受體的進(jìn)化史可以追溯到單細(xì)胞藻類，所有這些 UVR8 的同源物中都顯示了色氨酸的保守性和蛋白質(zhì)的高度相似性[30]。由此可以看出，UVR8 具有共同的祖先。

對(duì)于紫花苜蓿較為成熟的遺傳轉(zhuǎn)化方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。張萬軍等[31]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將耐鹽基因rstB成功導(dǎo)入到紫花苜蓿基因組中。陳春艷等[32]用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化法篩選出苜蓿抗性愈傷組織。UV-B輻射能夠促進(jìn)花青素的合成，使其含量增加[33]。王靜等[34]研究表明，經(jīng)UV-B照射后，紫花苜蓿幼苗類黃酮、花青素、總酚的含量均顯著提高。本實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了MsUVR8過表達(dá)的紫花苜蓿細(xì)胞系，結(jié)果顯示UV-B輻射后的野生型愈傷組織中總黃酮和總酚含量無顯著差異，花青素的含量明顯升高，推測(cè)其原因可能與植物類黃酮化合物的種類較多，其種類、分布與含量會(huì)因植物種類、器官、發(fā)育階段和環(huán)境生長(zhǎng)條件的不同而異有關(guān)[35]。本研究中未經(jīng)UV-B輻射的過表達(dá)愈傷組織與野生型愈傷組織相比，MsUVR8過表達(dá)的愈傷組織類黃酮、花青素、總酚物質(zhì)含量明顯升高，其原因應(yīng)該是在農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化過程中組織細(xì)胞受到農(nóng)桿菌的刺激作用，激活了類黃酮、花青素、總酚的生物合成。低劑量UV-B輻射后，MsUVR8過表達(dá)的愈傷組織中類黃酮和花青素的含量進(jìn)一步顯著升高，其原因可能是UV-B激活了細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的UV-B光受體MsUVR8，活化的MsUVR8單體蛋白聚集于細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)了下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。然而總酚含量無明顯變化，說明總酚含量?jī)H因受到農(nóng)桿菌的刺激作用被改變，UV-B輻射則對(duì)其無顯著影響。

黃酮醇含量檢測(cè)結(jié)果表明，紫花苜蓿MsUVR8被UV-B活化后，激活了植物內(nèi)源黃酮醇的合成代謝，這些結(jié)果與前人研究一致。很多研究表明，UV-B輻射會(huì)破壞植物生物膜系統(tǒng)，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)[36]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，UV-B輻射后野生型愈傷組織過氧化氫和超氧離子積累明顯增加，而MsUVR8過表達(dá)愈傷組織中這兩種物質(zhì)積累與未經(jīng)UV-B輻射的愈傷組織差異不明顯，表明MsUVR8可以增強(qiáng)植物組織細(xì)胞的抗氧化性能，減少了UV-B脅迫對(duì)細(xì)胞引起的氧化損傷。

UVR8感知UV-B后會(huì)激活UV-B光信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控一系列下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[37]。低劑量UV-B輻射能夠促進(jìn)植物類黃酮生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因(如CHS、PAL、CHI、FLS等)的轉(zhuǎn)錄。Park等對(duì)萵苣葉片進(jìn)行基因表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，UV-B輻射后CHS、ANS、F3H基因的表達(dá)被顯著增強(qiáng)[38]。關(guān)于類黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，農(nóng)桿菌浸染處理均促進(jìn)了PAL、CHS、CHI和FLS基因的表達(dá)。與未經(jīng)UV-B輻射組相比，UV-B輻射后的野生型愈傷組織中PAL、CHS、FLS表達(dá)明顯被激活，CHI表達(dá)無明顯差異，而UV-B輻射后的MsUVR8過表達(dá)愈傷組織中，4種基因的表達(dá)活性均被激活，且在各處理組中基因表達(dá)水平最高，說明MsUVR8被UV-B激活后，促進(jìn)了類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)，激活了類黃酮合成關(guān)鍵酶的活性，提高了類黃酮物質(zhì)的合成效率，增強(qiáng)了UV-B脅迫條件下植物愈傷組織的抗氧化能力。