文心蘭OnFNR基因的克隆及抗軟腐病功能鑒定

吳曉佩，徐小萍，葉 煒,2，賴瑞聯(lián),3，賴鐘雄*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002；2 福建省三明農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，福建三明 365000；3 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福州 350003)

文心蘭(Oncidiumhybridum)為蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬植物，是重要的盆切花經(jīng)濟(jì)栽培品種。文心蘭在栽培過程中極易受由歐文氏菌(Erwiniaspp.)引起的軟腐病侵害，因此研究文心蘭軟腐病抗病機(jī)理對文心蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶(ferredoxin-NADP+oxidoreductase，F(xiàn)NR)是一種親水型的蛋白，是以非共價(jià)鍵結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔基的單體酶[1]，參與多種代謝功能。植物FNR家族主要由質(zhì)體型鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶(FNRs)與細(xì)菌型鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶(FPRs)共同構(gòu)成[2]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制柑橘潰瘍病病原菌(Xanthomonascitrisubsp.citri，Xcc)中細(xì)菌型FNR(XccFPR)將有助于減弱細(xì)菌對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，可達(dá)到抑制柑橘潰瘍病的效果[3]。Islam等[4]發(fā)現(xiàn)質(zhì)體型FNR能響應(yīng)黑腐病，由于ROS含量的影響，使得抗病油菜中LFNR呈上調(diào)表達(dá)，易感病油菜中LFNR呈下調(diào)表達(dá)。

FNR在維持NADP+/NADPH的平衡中起到重要的作用[5]，是卡爾文循環(huán)及細(xì)胞內(nèi)ROS水平調(diào)控的關(guān)鍵蛋白之一[6-7]。植物質(zhì)體型FNR蛋白可以根據(jù)其功能和定位的不同分為兩大類：一類是在光合組織(主要是植物葉片的葉綠體)中存在的LFNR(leaf-type FNRs)；另一類是在非光合組織(主要是根的質(zhì)體)中存在的RFNR(root-type FNRs)[8]。LFNR主要催化光合線性電子傳遞的最后一步反應(yīng)，負(fù)責(zé)將電子從還原態(tài)的鐵氧還蛋白(Fd)轉(zhuǎn)移給NADP+，用于卡爾文循環(huán)中固定CO2；而RFNR負(fù)責(zé)催化電子向Fd還原的方向傳遞，即由NADPH傳遞給氧化態(tài)的Fd[9]。Asada等[10]提出葉綠體中ROS的清除和氧化還原的平衡均需要NADPH來維持；Hajirezaei等[11]發(fā)現(xiàn)煙草中反義表達(dá)FNR會導(dǎo)致光合速率下降，使得NADPH的產(chǎn)量減少。Lintala等[12]發(fā)現(xiàn)FNR的缺陷可能導(dǎo)致葉綠體蛋白的輸入受到干擾，從而影響ROS的含量；Rodriguez等[13]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FNR以及類囊體釋放FNR均會增加煙草和小麥ROS的耐受性。此外，F(xiàn)NR對植物生長發(fā)育也至關(guān)重要，Palatnik等[14]發(fā)現(xiàn)在煙草中反義表達(dá)FNR會導(dǎo)致葉綠體受損，其中葉綠素a和葉綠素b的含量均降低，葉片發(fā)育受到嚴(yán)重影響；Hajirezaei等[11]發(fā)現(xiàn)煙草中度缺乏FNR基因會導(dǎo)致植株花發(fā)育遲緩，并且種子的數(shù)量也明顯減少。FNR與Fd緊密互作，它們共同完成PSⅠ電子傳遞鏈末端的電子傳遞，F(xiàn)NR與Fd之間形成的電子轉(zhuǎn)移絡(luò)合物是FNR活性的先決條件[15-17]。在LFNR四級結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)d結(jié)合在FAD結(jié)構(gòu)域和NADP+結(jié)構(gòu)域折成的裂隙之間[18]，與Fd的結(jié)合可以增強(qiáng)FNR的NADP+結(jié)構(gòu)域的靈活性[19]。

FNR雖已被用于植物非生物脅迫(低溫[6]、干旱[20-22]、高鹽[23]等)、激素脅迫[24]以及生物脅迫[3-4]的研究中，但其在文心蘭病害脅迫中的生物學(xué)功能還未知。鑒于此，本研究以文心蘭‘小櫻桃’為材料，用RACE技術(shù)克隆了OnFNR基因的全長序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)與亞細(xì)胞定位分析；使用qRT-PCR對文心蘭不同組織器官以及各組織器官在不同感病時(shí)期的OnFNR表達(dá)量進(jìn)行分析；構(gòu)建OnFNR過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化文心蘭原球莖(protocorm-like bodies，PLBs)中，研究轉(zhuǎn)基因PLBs的抗病性。以期為研究FNR在文心蘭抵抗軟腐病過程中的抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

以繼代培養(yǎng)的‘小櫻桃’文心蘭PLBs為總RNA提取的材料。以繼代培養(yǎng)35 d左右、長勢良好的文心蘭PLBs為轉(zhuǎn)化受體材料。以種植180 d 的‘小櫻桃’文心蘭植株為軟腐病侵染材料，分別取健康植株和感病植株的上端葉、下端葉、假鱗莖和根，迅速置于液氮中速凍，然后保存于-80 ℃冰箱備用。載體pCAMBIA1302和載體pCAMBIA1301、大腸桿菌DH5a和農(nóng)桿菌EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存。以上材料均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 文心蘭總RNA提取及轉(zhuǎn)錄采用Trizol UP RNA提取試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司)提取‘小櫻桃’文心蘭總RNA。用超微量分光光度計(jì)(Thermo Electron Corp，USA)以及凝膠電泳檢測RNA樣品濃度以及完整性。用SYBR ExScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將已經(jīng)提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于定量PCR分析；同時(shí)用GeneRacerTM試劑盒(TaKaRa)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于基因克隆。

1.2.2OnFNR基因的克隆與亞細(xì)胞定位以擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)中查找到FNR基因(登錄號NM101857.6和NM126017.5)的核苷酸序列作為參考序列，并將其與蘭花基因組數(shù)據(jù)庫(http://orchidstra.abrc.sinica.edu.tw/none/)進(jìn)行比對分析，篩選出相似度最高的cDNA片段(大小為209 bp)。根據(jù)該基因片段分別設(shè)計(jì)出5′-RACE的特異性引物和3′-RACE的特異性引物(表1)，以‘小櫻桃’文心蘭cDNA為模板分別擴(kuò)增出3′和5′端序列。將所得序列置于DNAMAN中進(jìn)行全長拼接，并設(shè)計(jì)引物OnFNR-ORF-F和OnFNR-ORF-R(表1)，對所拼接序列的準(zhǔn)確性進(jìn)行PCR驗(yàn)證。參照全式金HIFI Taq酶說明書配制PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 變性30 s，55～59 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳凝膠成像并將目的片段切膠回收，經(jīng)TA克隆后挑取克隆子進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證為陽性的菌液送至華大生物技術(shù)(北京)有限公司測序。

根據(jù)OnFNR基因的ORF序列設(shè)計(jì)出帶有酶切位點(diǎn)BglⅡ的上游引物FNR-subF和帶酶切位點(diǎn)SpeⅠ的下游引物FNR-subR(表1)，以pMD18-T為中間載體，將測序正確的目的條帶經(jīng)雙酶切后連入pCAMBIA1302質(zhì)粒中，獲得表達(dá)載體pCAMBIA1302-OnFNR。采用凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入EHA105農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染煙草表皮進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察，并以非轉(zhuǎn)基因和pCAMBIA1302空載體注射的煙草葉片作為陰性和陽性的對照。

表1 本試驗(yàn)所使用的引物

1.2.3OnFNR基因qRT-PCR檢測參照吳曉佩等[25]的方法進(jìn)行菌液侵染，將存儲的軟腐病病原菌液于NA培養(yǎng)基上劃板并挑取單菌落于新配置的30 mL NB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，獲得侵染菌液，并將所得菌液稀釋至OD600為0.4。取18株‘小櫻桃’文心蘭種植180 d的植株，并將其分為6組，分別為健康植株(0 d)以及注射病原菌之后1、3、6、9和12 d的樣本，每組注射3株進(jìn)行生物重復(fù)，利用1 mL的注射針將稀釋好的菌液注射進(jìn)文心蘭的假鱗莖內(nèi)，每株300 μL，并將植株置于高溫高濕環(huán)境中。通過qRT-PCR檢測OnFNR基因在‘小櫻桃’文心蘭不同感病時(shí)期以及健康植株的上端葉、下端葉、假鱗莖和根的表達(dá)情況，‘小櫻桃’文心蘭不同感病時(shí)期的發(fā)病癥狀參見吳曉佩等[25]。

1.2.4 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化利用Fermentas FastDigest(Thermo Fisher Scientific)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、PstⅠ將OnFNR基因的核苷酸序列導(dǎo)入pCAMBIA1301中，所構(gòu)成的質(zhì)粒T-DNA區(qū)域如圖1所示。利用凍融法(LBG94)，將過表達(dá)載體pCAMBIA1301-OnFNR導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)中[26]。將重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單克隆菌落至于1 mL的YEB(含有50 mg/L Rif和 50 mg/L Kan)液體培養(yǎng)基中，180 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，4 000 r/min低速離心5 min，棄去上清液，收集菌液。用MS(含50 μmol/L AS)液體培養(yǎng)基重懸菌液調(diào)至OD600為0.6左右。

參考葉煒[27]的蘭花PLBs轉(zhuǎn)基因方法，以繼代35 d的PLBs為轉(zhuǎn)化材料，將PLBs進(jìn)行切割傷害，使原球莖被切割成0.2～0.5 mm3的小塊，置于MS+0.5 mol/L甘露醇的固體培養(yǎng)基中，25 ℃、6 h黑暗條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，將預(yù)培養(yǎng)后PLBs材料置于已經(jīng)制備好的MS農(nóng)桿菌重懸液中侵染30 min，倒去重懸液，取出PLBs，用濾紙將PLBs表面的重懸液吸干，平鋪到MS固體培養(yǎng)基中，至于25 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)3 d。為防止農(nóng)桿菌過度生長，將共培養(yǎng)后的PLBs用含有200 mg·L-1頭孢(cefatoxime)和200 mg·L-1特美汀(tementin)的無菌水進(jìn)行清洗，洗菌時(shí)間為20 min，重復(fù)2次；然后再用無菌水清洗2次，用濾紙將PLBs表面的無菌水吸干，并轉(zhuǎn)移至含有50 mg·L-1頭孢和200 mg·L-1特美汀的MS固體培養(yǎng)基，25 ℃、16 h/d光照進(jìn)行第二階共培養(yǎng)，30 d后將PLBs轉(zhuǎn)入含5 mg/L潮霉素的MS篩選培養(yǎng)基，25 ℃、16 h/d光照，進(jìn)行2個(gè)月的抗性篩選，每個(gè)月將依舊存活的PLBs轉(zhuǎn)入新的抗性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每次侵染20瓶，每瓶8團(tuán)，每團(tuán)大約10個(gè)PLBs，重復(fù)6次。以上操作均在超凈工作臺中完成。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因PLBs檢測隨機(jī)取出一部分經(jīng)增殖培養(yǎng)2個(gè)月后的轉(zhuǎn)基因PLBs，并將每個(gè)PLBs分成兩部分，一部分用于GUS染色，另一部分用于PCR檢測。隨機(jī)取30個(gè)轉(zhuǎn)基因PLBs，分為3組，對每一組進(jìn)行總RNA的提取并用于qRT-PCR檢測。GUS組織化學(xué)染色：用0.5% Triton浸泡30 min，再經(jīng)過30 min流水清洗，用濾紙吸干PLBs表面附著的水分，將PLBs置于GUS組織化學(xué)染色工作液中，37℃暗培養(yǎng)過夜，最后將PLBs放入70%酒精中并置于70 ℃中進(jìn)行褪色，直至綠色褪盡，肉眼觀察染色情況。對GUS基因(370 bp)進(jìn)行PCR驗(yàn)證；對OnFNR和Fd進(jìn)行qRT-PCR檢測(表1)。

1.2.6 軟腐病病原菌侵染轉(zhuǎn)基因PLBs以增殖培養(yǎng)2個(gè)月后的轉(zhuǎn)基因PLBs做為材料，對PLBs進(jìn)行輕微的切割后，傷口沾染軟腐病病原菌，將染有病菌的PLBs置于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)基因PLBs在剛感染病菌(0 d)以及感病后2和4 d的發(fā)病情況。培養(yǎng)條件：光照時(shí)間10～12 h/d，光照強(qiáng)度1 500 Lx，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理隨機(jī)取3瓶進(jìn)行存活率計(jì)算，重復(fù)3次，取存活率的平均值。qRT-PCR檢測的數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行分析；利用SPSS 19進(jìn)行差異性顯著性檢驗(yàn)；作圖軟件為Origin85。

PLBs存活率=(未褐化PLBs數(shù)量/總PLBs數(shù)量)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 文心蘭OnFNR基因克隆與序列分析

以‘小櫻桃’文心蘭cDNA為模板，根據(jù)已知的209 bp片段設(shè)計(jì)OnFNR-5P/OnFNR-5NP特異引物(圖2)，經(jīng)5′-RACE巢式PCR擴(kuò)增，獲得1條750 bp的特異條帶(圖2，A)；以O(shè)nFNR-3P/OnFNR-3NP為特異引物，經(jīng)3′-RACE巢式PCR擴(kuò)增，獲得1條1 000 bp的特異條帶(圖2，B)，測序結(jié)果表明，5′-UTR的長度為467 bp，3′-UTR的長度為826 bp。將獲得的這2個(gè)片段與已知的目的片段進(jìn)行拼接，共得到1 406 bp cDNA全長。將該序列命名為OnFNR，登錄號為KX461908。設(shè)計(jì)OnFNR-ORF-F及OnFNR-ORF-R引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證FNR基因的ORF片段，擴(kuò)增得到一條長度為1 080 bp的單一條帶(圖2，C)。

DNAMAN分析表明OnFNR基因ORF區(qū)編碼359個(gè)氨基酸(圖3)。利用Protparam分析其理化性質(zhì)顯示，該蛋白分子式 C1793H2840N472O532S17，相對分子質(zhì)量為40 066.14 Da，等電點(diǎn)為8.72，屬于堿性蛋白。Signal P3.0 Server信號肽預(yù)測結(jié)果表明OnFNR無信號肽。保守功能域的分析結(jié)果顯示，文心蘭OnFNR蛋白隸屬于FNR-like超家族，包含有FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和NADP+結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

OnFNR與不同植物FNR蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果顯示：文心蘭OnFNR與其他植物L(fēng)FNR型聚為一類，與同為蘭科的深圳擬蘭、鐵皮石斛以及小蘭嶼蝴蝶蘭在進(jìn)化上保持了較近的親緣關(guān)系(圖4)。其中，與小蘭嶼蝴蝶蘭LFNR(XP_020597873.1)相似度高達(dá)89.1%，與鐵皮石斛(XP_020689016.1)相似度高達(dá)87.3%。OnFNR中NADP+結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其他植物的相似度在89.12%～94.7%之間；FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其他植物的相似度高達(dá)92.31%～96.5%。

2.2 文心蘭OnFNR的亞細(xì)胞定位

通過構(gòu)建OnFNR與GFP融合的表達(dá)載體pCAMBIA1302-OnFNR-GFP，利用煙草內(nèi)表皮細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)研究了OnFNR蛋白亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果表明，融合載體pCAMBIA1302-OnFNR-GFP只在葉綠體中觀察到GFP綠色熒光(圖5，A-D)；pCAMBIA1302空載體中整個(gè)細(xì)胞均有GFP熒光(圖5，E-H)；非轉(zhuǎn)基因煙草(WT)中未觀察到綠色熒光(圖5，I-L)。說明OnFNR蛋白定位于葉綠體。這一結(jié)果與擬南芥的2個(gè)LFNR定位是一樣的[12]。

2.3 文心蘭OnFNR表達(dá)分析

OnFNR在文心蘭花、下端葉、上端葉、假鱗莖以及根中的表達(dá)情況(圖6)顯示：OnFNR在文心蘭的各個(gè)組織部位中均有表達(dá)，其中在根中的表達(dá)量最低，上端葉的表達(dá)量最高，上端葉的表達(dá)量為根中表達(dá)量的99倍；下端葉中OnFNR的表達(dá)量略低于上端葉的表達(dá)量，但均高于假鱗莖和花的表達(dá)量，分別是假鱗莖以及花中OnFNR表達(dá)量的6倍和16倍。

OnFNR在文心蘭軟腐病侵染過程中的表達(dá)分析結(jié)果顯示(圖7)，接種部位假鱗莖在接入病菌后第1天，OnFNR的表達(dá)量呈現(xiàn)出極顯著下調(diào)(P<0.01)，表達(dá)量達(dá)到最低值，是對照組的0.27倍；之后各時(shí)間段的表達(dá)量均顯著低于對照組，并且在第3天假鱗莖已經(jīng)出現(xiàn)明顯病狀。軟腐病菌侵染植株1 d 時(shí)，下端葉OnFNR的表達(dá)量下調(diào)至最低值，表達(dá)量為對照0.31倍，雖然在第3天OnFNR的表達(dá)量上調(diào)到接近對照組的水平，但在第6天之后OnFNR的表達(dá)量又開始下降；并且在第9天時(shí)開始有明顯的水漬狀病癥。上端葉在植株被軟腐病菌侵染后第6天開始出現(xiàn)水漬狀病癥，其OnFNR的表達(dá)量在感病第1天就出現(xiàn)極顯著下調(diào)(P<0.01)，并在第9天時(shí)OnFNR的表達(dá)量達(dá)到最低值，其表達(dá)量為對照0.15倍。根中OnFNR的表達(dá)量在接種病原菌后并沒出現(xiàn)變化，直到第9天OnFNR的表達(dá)量才呈現(xiàn)極顯著上調(diào)，此時(shí)根也開始出現(xiàn)脫落癥狀；在第12天時(shí)OnFNR的表達(dá)量達(dá)到最高值，其表達(dá)量約為對照組的4.50倍。

2.4 文心蘭OnFNR基因過表達(dá)載體的獲得

以構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-OnFNR作為模板，利用文心蘭OnFNR基因的特異引物(OnFNRORF-F和OnFNRORF-R)進(jìn)行PCR檢測(圖8)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約為1 080 bp，與文心蘭OnFNR基因大小相符。為了進(jìn)一步驗(yàn)證文心蘭OnFNR基因插入位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，采用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和PstⅠ對重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-OnFNR進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果(圖8)顯示，有2條分別與目的基因和pCAMBIA1301大小相一致的條帶，說明OnFNR在載體上的插入位置正確。綜合PCR驗(yàn)證和雙酶切驗(yàn)證的結(jié)果表明，文心蘭OnFNR基因已成功插入中間載體pCAMBIA1301中。

2.5 轉(zhuǎn)基因文心蘭PLBs的獲得及分子檢測

用pCAMBIA1301-OnFNR質(zhì)粒農(nóng)桿菌EHA105侵染文心蘭PLBs，共培養(yǎng)結(jié)束后接種于含5 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選。未侵染農(nóng)桿菌的PLBs接種于含5 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上，作為對照。經(jīng)過1個(gè)月的抗性培養(yǎng)，非轉(zhuǎn)基因PLBs已經(jīng)全部褐化死亡(圖9，A)；而轉(zhuǎn)基因PLBs中非抗性的PLBs也褐化死亡(圖9，B)，其存活率為8.75%。將存活的轉(zhuǎn)基因PLBs再次接種于含5 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行30 d 培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)依舊有將近一半的PLBs褐化死亡(圖9，C)，最終PLBs的存活率僅為3.85%；最后將存活的轉(zhuǎn)基因PLBs接種于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行2個(gè)月的增殖培養(yǎng)(圖9，D)，發(fā)現(xiàn)有部分PLBs已出現(xiàn)分化現(xiàn)象(圖9，E)。

從增殖培養(yǎng)2個(gè)月后的轉(zhuǎn)基因PLBs中隨機(jī)選取19個(gè)，每個(gè)PLBs分為兩部分，一部分用于PCR檢測，結(jié)果(圖10)發(fā)現(xiàn)，在19個(gè)PLBs中能檢測到GUS(370 bp)條帶的有16個(gè)。因此初步推斷pCAMBIA1301-OnFNR質(zhì)粒已成功地轉(zhuǎn)入文心蘭PLBs中。另一部分進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色(圖11)，非轉(zhuǎn)基因PLBs沒有顯示藍(lán)色，轉(zhuǎn)基因PLBs中大部分材料被染成藍(lán)色。

通過熒光定量PCR對10個(gè)轉(zhuǎn)基因PLBs的OnFNR與Fd進(jìn)行總表達(dá)量分析，由圖12所示，相對于正常PLBs的總表達(dá)量，在轉(zhuǎn)基因PLBs中發(fā)現(xiàn)OnFNR總的表達(dá)量呈極顯著上調(diào)，同時(shí)Fd的總表達(dá)量也出現(xiàn)極顯著上升，表達(dá)量達(dá)到正常植株的3.67倍。

2.6 軟腐病病原菌侵染轉(zhuǎn)基因文心蘭PLBs

為了更加明確過表達(dá)OnFNR基因是否增強(qiáng)了文心蘭對軟腐病的抵抗力，本試驗(yàn)以增殖培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)基因PLBs做為材料，對PLBs進(jìn)行輕微的切割后，傷口沾染軟腐病病原菌，將染有病菌的PLBs置于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，觀察轉(zhuǎn)基因PLBs對細(xì)菌性軟腐病的抵抗力。結(jié)果(圖13)顯示，通過軟腐病菌侵染第2天，PLBs周圍均已長出軟腐病菌，并且非轉(zhuǎn)基因PLBs已經(jīng)出現(xiàn)大量褐化現(xiàn)象，存活率為48.88%；而轉(zhuǎn)基因PLBs均只有極小部分褐化，其存活率為93.34%。軟腐病菌侵染PLBs第4天，非轉(zhuǎn)基因的PLBs只有6.66%存活，而轉(zhuǎn)基因PLBs還有48.88%存活。因此轉(zhuǎn)基因PLBs提高了抗病性。

3 討 論

3.1 文心蘭OnFNR屬性

植物FNR可分為光合型(LFNR)和非光合型(RFNR)，研究發(fā)現(xiàn)LFNR基因主要在葉片中表達(dá)，在莖、花、果莢中表達(dá)量較低，而在根中幾乎不表達(dá)[28]，李蓉等[29]的研究結(jié)果顯示文心蘭LFNR在葉中的表達(dá)量顯著高于其他組織部位。本試驗(yàn)從‘小櫻桃’文心蘭中成功克隆到一條ORF長為1 080 bp的OnFNR基因，其編碼的蛋白具有極為保守的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和NADP+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與其他植物的相似度分別在92.31%～96.50%和89.12%～94.70%之間。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)OnFNR基因在文心蘭的各個(gè)組織部位中均有表達(dá)，且在葉中的表達(dá)量顯著高于其他部位。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示文心蘭OnFNR蛋白與其他植物的LFNR聚為一類，說明OnFNR屬于光合型FNR。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，文心蘭OnFNR定位于葉綠體上，這與擬南芥的2個(gè)LFNR定位一樣[12]，說明其主要存在于植物葉片的葉綠體中。以上結(jié)果表明文心蘭OnFNR是一個(gè)定位于葉綠體的光合型鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶。

3.2 文心蘭感染軟腐病后OnFNR的表達(dá)下調(diào)

研究發(fā)現(xiàn)葉綠體在植物感病過程起重要作用，因?yàn)橹参锊《揪幋a的蛋白可以直接靶向葉綠體或者葉綠體蛋白，導(dǎo)致葉綠體以及光合作用相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生變化[30-31]，從而破壞葉綠體蛋白功能以促進(jìn)植物病毒感染[32-33]。葉綠體已被清楚地認(rèn)為是ROS的主要來源[34]，植物在感受病原物入侵后，能快速產(chǎn)生大量的ROS殺死病原物或抑制病原物的入侵，而FNR含量的變化會影響植物對ROS的感知[35]。本試驗(yàn)中OnFNR定位于葉綠體上，并且屬于光合型FNR，暗示OnFNR在植物抵抗病毒以及ROS的爆發(fā)中起到重要作用。在NAD(P)H脫氧酶(NDH)介導(dǎo)的環(huán)式電子傳遞中，F(xiàn)NR與NDH復(fù)合體相連接，然后將電子從NAD(P)轉(zhuǎn)向質(zhì)醌(PQ)，最后傳遞給細(xì)胞色素b6f[16]。研究發(fā)現(xiàn)NDH復(fù)合體O亞基會與病毒在葉綠體內(nèi)發(fā)生互作，從而阻礙電子循環(huán)[36]；同樣細(xì)胞色素b6f復(fù)合體還原型鐵硫蛋白前體也會與病毒發(fā)生互作，并引起宿主對病毒適應(yīng)性發(fā)生變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，OnFNR基因主要在葉片和假鱗莖中表達(dá)；當(dāng)植株接種軟腐病病原菌后假鱗莖和葉相對于根更早顯現(xiàn)病癥，其中假鱗莖在感病后3 d即出現(xiàn)明顯的病癥，上端葉在第6天 也開始出現(xiàn)水漬狀，并且在感病后假鱗莖以及葉中OnFNR的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著下調(diào)。文心蘭感染軟腐病后OnFNR主要表達(dá)部位的表達(dá)量被顯著抑制，可能是因?yàn)橹参锔腥静【箅娮友h(huán)傳遞鏈?zhǔn)艿阶璧K，從而影響OnFNR的表達(dá)量，導(dǎo)致植物對ROS的感知受到影響，最終促進(jìn)了軟腐病菌的感染。

3.3 過表達(dá)OnFNR文心蘭軟腐病抗性增強(qiáng)

FNR與Fd之間存在緊密互作，它們共同完成光合線性電子傳遞(linear electron transport，LET)的最后一步反應(yīng)，即FNR將電子從還原態(tài)的Fd傳遞給NADP+，生成還原力NADPH，用于卡爾文循環(huán)中CO2的固定以及葉綠體中其他代謝過程[9]。Higuchi-Takeuchi等[37]發(fā)現(xiàn)超表達(dá)LFNR2會影響水稻光合線性電子傳遞以及圍繞PSⅠ的Fd-依賴的環(huán)式電子傳遞速率。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在文心蘭PLBs中過表達(dá)OnFNR，OnFNR與Fd基因均呈現(xiàn)極顯著上調(diào)，尤其是Fd表達(dá)量上調(diào)至對照植株的3.67倍。Fd表達(dá)量上調(diào)已被證實(shí)可以增強(qiáng)文心蘭、馬蹄蓮等植物抵抗軟腐病的能力[38-39]。Fd可以強(qiáng)化PTI中絲裂原活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路信號的傳導(dǎo)[40]，當(dāng)植物感染軟腐病后過表達(dá)Fd的植株能夠更早產(chǎn)生ROS[41]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植株接種病原菌后假鱗莖以及葉中OnFNR的表達(dá)量被顯著抑制，并且更早出現(xiàn)病癥；當(dāng)過表達(dá)OnFNR的PLBs在軟腐病病原菌侵染第4天的存活率仍有48.88%，而非轉(zhuǎn)基因PLBs的存活率只有6.66%，可見轉(zhuǎn)基因PLBs表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗病性。

綜上所述，過表達(dá)OnFNR可以提高文心蘭PLBs抗軟腐病的能力，這可能與其過表達(dá)提高了LET的電子傳遞效率，進(jìn)而提高Fd的表達(dá)量，促進(jìn)MAPK通路的信號傳導(dǎo)有關(guān)。