高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用油脂中合成辣椒素的不確定度評估

李姣

摘 要：目的：評定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用油脂中合成辣椒素含量的不確定度，提高測定結(jié)果的準確度和可信度，找出對不確定度影響最大的關(guān)鍵性因素。方法：依據(jù) CNAS-GL 006：2019 化學分析中不確定度的評估指南和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012），采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用油脂中合成辣椒素含量，建立不確定度評定的數(shù)學模型，通過對標準品溶液配制、樣品溶液的配制、測量重復性以及標準曲線擬合這4個方面引入的不確定度進行分析，確定各個不確定度分量，得到擴展不確定度。結(jié)果：按置信區(qū)間為95%，合成辣椒素含量為（0.374±0.044） ?g/kg，k=2。結(jié)論：測量結(jié)果的不確定度的主要來源是樣品測量重復性引入的，其次是標準品溶液和樣品溶液的配制，其他分量引入的不確定度相對較小。

關(guān)鍵詞：食用油脂;合成辣椒素;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;不確定度

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of synthetic capsaicin content in edible oil by HPLC-tandem MS， improve the accuracy and credibility of the measurement results， and find out the key factors that have the greatest impact on the uncertainty.Methods： Synthetic capsaicin content in edible oils was determined by HPLC-tandem mass spectrometry according to CNAS-GL 006：2019 Guidelines for Evaluation of Uncertainty in Chemical Analysis and Evaluation and presentation of Measurement Uncertainty by JJF 1059.1—2012，establish a mathematical model of uncertainty evaluation， analyze the uncertainty introduced in standard solution preparation， sample solution preparation， measurement repeatability， and standard curve fitting， and determine each uncertainty component，get the extended uncertainty.Results： According to the 95% confidence interval， the synthetic capsaicin content is （0.374±0.044） ?g/kg， k=2. Conclusion： The main source of uncertainty in measurement results is the introduction of sample measurement repeatability， followed by the preparation of standard solution and sample solution， and the uncertainty introduced by other components is relatively small.

Keywords： edible oil and fats; synthetic capsaicin; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; uncertainty

辣椒作為常用的烹飪調(diào)料，在烹飪過程中被廣泛使用。因此，辣椒也成為我國人民飲食中最喜歡添加的調(diào)味料之一。調(diào)味料中合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素物質(zhì)因其結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，在烹飪過程中不容易被破壞并溶于油中，因而在廢棄食用油脂中通常會殘留這些成分，而正常食用油中幾乎不含辣椒素類的物質(zhì)。目前辣椒素以其使用范圍廣、熱穩(wěn)定性良好、脂溶性較好等特點成為食用油脂分辨研究檢測中的熱點[1-4]，也是檢測食用油質(zhì)量的重要方法。

我國是食用油消費大國，食用油的安全問題已成為消費者關(guān)注的熱點問題之一。國家市場監(jiān)督管理總局于2018年發(fā)布了《食用油脂中辣椒素的測定BJS 201801》。該方法可適用于食用油脂中辣椒素（天然辣椒素、合成辣椒素、二氫辣椒素）含量的測定，方法指出當測定的樣品中辣椒素（合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素）總含量大于或等于1.0 ?g/kg時，該油脂樣品可能存在異常。

本文采用上述補充檢驗方法測定食用油脂中合成辣椒素含量，并進行不確定度評定。提高測定結(jié)果的準確度和可信度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB Triple Quad 5500）;超聲清洗機（Elma Elmasonic P）;天平（梅特勒xp205，d=0.01 mg）;天平（梅特勒AE200，d=0.1 mg），渦旋混合儀（IKA MS3）;乙腈、甲醇（Fisher Chemical LC/MS）;甲酸（Fisher Chemical色譜純）;二氯甲烷（諾爾施公司色譜純）;氫氧化鈉、濃硫酸（成都科隆化學品公司優(yōu)級純）;一級水（美國密理博公司）。

固相萃取柱： Cleanert S C18-SPE ，1 000 mg/6 mL（天津博納艾杰爾科技有限公司）;合成辣椒素對照品（純度98%;編號：BWB52508;CAS號：2444-46-4;來源：北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院）;食用油脂（拉薩市某糧油加工店自制菜籽油）。

1.2 試驗方法

1.2.1 儀器條件

（1）色譜方法。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100 mm，1.7 ?m（Waters公司）;流速：0.3 mL/min;柱溫：40 ℃;進樣量：2 ?L;流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液（梯度洗脫）。

（2）質(zhì)譜方法。電離方式：電噴霧正離子模式;檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）;霧化氣壓力：30 psi;離子噴霧電壓：5 000 V;干燥氣溫度：500 ℃;干燥氣流速：8 L/min;離子對294.1/137.1*，294.1/170.1;去簇電壓120 V，碰撞能量24 eV、13 eV。其中，*指定量離子。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取1 g左右樣品于10 mL具塞塑料試管中，加入1 mL二氯甲烷，再加入3 mL 2%氫氧化鈉溶液，渦旋提取10 min，4 000 r/min離心10 min，取上層水相;殘留有機相再用3 mL 2%氫氧化鈉溶液重復提取1次，合并水相，再用稀硫酸溶液（V∶V=1∶15）調(diào)節(jié)pH至2～3后進行固相萃取操作。C18 SPE小柱預先用3 mL乙腈淋洗3次，再用3 mL純水淋洗2次進行活化，然后將調(diào)節(jié)完pH值的水相提取液加入小柱，控制流速至1～2滴/s，待全部溶液通過SPE小柱后，以3 mL超純水淋洗2次，棄去流出液，最終以3 mL乙腈洗脫2次。乙腈洗脫液50 ℃氮吹近干，用1.0 mL甲醇溶解后過微孔濾膜（0.22 ?m，有機相），供上機測定。

1.3 建立數(shù)學模型

樣品中合成辣椒素的計算公式為：

X=C×V/m（1）

式中：X-樣品中合成辣椒素的含量，?g/kg;C-從標準曲線得到的樣品中合成辣椒素質(zhì)量濃度，ng/mL;V-樣品定容體積，mL;m-樣品取樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量不確定度的來源分析

食用油脂中合成辣椒素測量不確定度的來源包括：①標準品溶液配制引起的不確定度urel（d）;②樣品溶液配制引起的不確定度urel（r）;③試樣重復測定時引入的不確定度urel（s）;④標準曲線擬合引起的不確定度urel（p）。

2.2 各不確定度分量的評定

2.2.1 不確定度傳播律

由于數(shù)學模型是線性模型，采用相對標準不確定度合成公式為：

2.2.2 標準品溶液配制引起的相對不確定度urel（d）

（1）標準品純度引起的相對不確定度urel（d1）。合成辣椒素對照品純度98%，純度標準偏差為2%。按均勻分布，包含因子k=。

（2）標準品稱量引起的相對不確定度urel（d2）。按照天平檢定證書和《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008），十萬分之一天平稱量范圍為0.01～5.00 g時，最大允許誤差為±0.05 mg，按均勻分布，包含因子k=，2次稱量后獲得標準品質(zhì)量（天平清零也帶來稱量不確定度）。標準品質(zhì)量為10.80 mg。則：

（3）標準品稀釋定容引起的相對不確定度urel（d3）。

標準品稀釋定容引起的不確定度主要來源于玻璃量器和移液器。一般來說，玻璃量器引起的不確定度來源于允許誤差和溫度變化。按照檢定證書和《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006），容量為50 mL的容量瓶（A級）容量允許誤差為±0.05 mL，容量允許誤差引入的不確定度認為是三角分布，包含因子k=，則：

由于液體的膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，故只考慮液體的體積膨脹，配制標準品的溶劑為甲醇，甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 20/℃，實驗室溫度

19 ℃和校正溫度20 ℃偏差1 ℃。因此，溫度偏差產(chǎn)生的體積增量為50 mL×0.001 20/℃×1℃=0.06 mL，假設(shè)體積變化服從三角分布，包含因子k=，則：

經(jīng)查《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）可知，移液器容量允許誤差和測量重復性誤差。100～1 000 ?L移液器容量最大允許誤差為1 000 ?L×1.0%=10 ?L=0.01 mL，容量允許誤差引入的不確定度認為是三角分布，包含因子k=，則：

按照上述方法計算所用玻璃量器和移液器引入的不確定度，結(jié)果見表1。

稱取標準品10.80 mg，于50 mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到211.68 ?g/mL的標準品溶液，稀釋標準品溶液得到52.92 ng/mL標準貯備液。稀釋標準貯備液得到濃度為0.105 84 ng/mL、0.211 68 ng/mL、1.058 40 ng/mL、5.292 00 ng/mL、10.584 00 ng/mL和21.168 00 ng/mL標準工作曲線溶液。在此過程中，100～1 000 ?L移液器使用2次，20～200 ?L移液器使用6次。50 mL的容量瓶（A級）使用1次，25 mL的容量瓶（A級）使用1次，10 mL的容量瓶（A級）使用1次，1 mL的容量瓶（A級）使用6次。則由玻璃量器和移液器的使用引起的相對不確定度為：

綜合以上3個不確定度分量，標準品溶液配制引起的相對合成不確定度為：

2.2.3 樣品溶液配制引起的相對不確定度urel（r）

（1）樣品稱量引起的不確定度。萬分之一天平稱量范圍為0.1～50 g時，最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布，包含因子k=，2次稱量后獲得樣品質(zhì)量（天平清零也帶來稱量不確定度）。樣品稱樣量為1 g（1 000 mg）。則樣品稱量引入的相對不確定度計算過程為：

（2）樣品定容引起的相對不確定度。移液器urel（V1）=0.004 590 6。綜合2個不確定度分量，樣品溶液配制引入的相對合成不確定度為：

2.2.4 試樣重復測定時引入的相對不確定度urel（s）

對本樣品中合成辣椒素進行6次獨立測試，每個樣品重復測量2次。樣品中合成辣椒素含量重復性測定結(jié)果見表2。

因此，重復性測定引起的相對合成不確定度為：

2.2.5 標準曲線擬合引入的不確定度urel（p）

采用6個濃度水平的標準溶液，每個標準溶液測2次，按照外標法擬合，得到線性方程

y=257 10.674 74x-2 700.849 23，其相關(guān)系數(shù)r=0.999 74。

標準曲線相關(guān)數(shù)據(jù)見表3。

因此，標準曲線擬合引入的不確定度為：

式中：P-樣品溶液測量次數(shù);n-標準溶液的測量次數(shù);C-標準溶液平均濃度，ng/mL;C0-由曲線計算的樣品溶液濃度，ng/mL;B0-線性方程截距;B1-線性方程斜率;SR-擬合標準偏差;Cj-第j次測量時標準溶液的濃度，ng/mL;Aj-第j次測量時標準溶液的峰面積。

故u（p）=0.001 493 6;

2.3 測量不確定度評定結(jié)果

合成辣椒素測定的各不確定度分量見表4。

食用油脂中合成辣椒素相對合成不確定度為：

樣品中合成辣椒素平均含量為0.374 ?g/kg，則其標準不確定度為：

u（X）= 0.058 73×0.374 =0.021 97 μg/kg

根據(jù)測量不確定度評估指南對一般檢測實驗室要求[5]，在置信概率P=95%時，取k=2，因此擴展不確定度為：U=k×u（X）=2×0.021 97=0.044 ?g/kg。

合成辣椒素含量X=（0.374±0.044） ?g/kg，k=2。

3 結(jié)論

由評定結(jié)果可知，測量結(jié)果的不確定度的主要來源是樣品測量重復性，其次是標準品溶液和樣品溶液的配制，其他分量引入的不確定度相對較小。因此，在實際操作過程中，增加樣品測定次數(shù)，減少人為誤差是優(yōu)化不確定度的有效途徑。這要求檢驗人員具備與檢驗工作相適應的操作水平，適當增加對照品的稱樣量，盡量減少稀釋步驟，轉(zhuǎn)移、稀釋時使用檢定級別較高的玻璃量器，以提高檢測結(jié)果的準確性。

參考文獻

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