產(chǎn)γ-氨基丁酸酵母菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化

畢長富，曾思恒，何 娟，龔利娟，王風青，楊雷軍

（四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000）

引 言

γ-氨基丁酸（GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是腦內(nèi)主要的神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑[1]。GABA 通過增加氧傳遞和血流量來改善腦細胞代謝，促進人體精神安定、血液循環(huán)，增加大腦氧氣供給等功能，并參與調(diào)節(jié)生長激素分泌、蛋白質(zhì)生成、脂肪燃燒和降低血壓[2]。GABA 能抑制谷氨酸的脫氨反應，使谷氨酸轉化為尿素排出體外，使血氨降低，解除氨毒，增進肝功能[3]。它還具有抗氧化、抗抑郁、抗失眠和止痛作用，被用于非免疫性疾病、中風、神經(jīng)紊亂和糖尿病控制以及癲癇、哮喘等病理的治療[4-5]。

隨著人們的生活質(zhì)量越來越高，對傳統(tǒng)食品也提出了更深層次的要求，研發(fā)各種功能性食品已成為現(xiàn)下的一個研究熱點，GABA 作為一種功能性因子，被應用于各類食品當中。利用產(chǎn)GABA 生產(chǎn)菌株，發(fā)酵富含GABA 的發(fā)酵產(chǎn)品就是其研究方向之一。李婷等[6]通過植物乳桿菌發(fā)酵制備出了含有GABA 的乳酸菌飲料。Kantachote 等[7]將高產(chǎn)GABA的菌株用于發(fā)酵香腸的制作，以產(chǎn)GABA 的戊糖片球菌HN8 和那慕爾乳桿菌NH2 為混合發(fā)酵劑發(fā)酵豬肉香腸，得到的產(chǎn)品中GABA 含量達396.2 mg/100 g。EL-Fattah 等[8]利用濃縮乳清蛋白強化的脫脂乳粉發(fā)酵酸奶，在發(fā)酵劑中添加能賦予酸奶高粘特性和產(chǎn)GABA 混合菌后發(fā)現(xiàn)，酸奶中GABA 含量達1.64 mg/100 mL，是相應的只添加具有高粘性菌株處理組的4.56 倍。石洋華[9]利用高產(chǎn)GABA 的酵母菌KS45-180，釀造富含GABA 的保健梨酒，梨酒的酒精度為9.4 度、GABA 的含量達到101.42 mg/L，超過安琪酵母產(chǎn)量，口感類似于普通梨酒。對于發(fā)酵食品的制備，發(fā)酵劑是關鍵，直投式發(fā)酵劑屬于高效濃縮型發(fā)酵劑的一種，不需要經(jīng)過菌種活化、增殖培養(yǎng)和逐級擴大培養(yǎng)過程，是一種可直接應用于生產(chǎn)的體積微小、活菌量高、活力強的新型發(fā)酵劑[10]。

本文通過單因素及響應面相關試驗對產(chǎn)GABA酵母菌HU-TS3進行增殖培養(yǎng)基成分及其培養(yǎng)條件優(yōu)化，為制備直投式菌粉，研發(fā)各種富含GABA功性發(fā)酵食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所選酵母菌HU-TS3 由四川輕化工大學生物工程學院生物發(fā)酵技術及應用試驗室分離篩選及保藏；葡萄糖（AR）購于成都市科倫化工試劑廠；可溶性淀粉（AR）、蔗糖、乳糖、溴甲酚綠（AR）均購于西隴科學股份有限公司；乙醛酸（AR）、琥珀酸（AR）購于成都市科隆化學品有限公司；普通蛋白胨、瓊脂粉（生化試劑）購于北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸粉（生化試劑）購于山東西亞化學工業(yè)有限公司；PDA 培養(yǎng)基（生化試劑）購于北京三藥科技開發(fā)公司。

UV752N 紫外可見分光光度計，上海諾科儀器儀表有限公司；YXQ-LS-18SI 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FA2004N精密電子天平，杭州萬特衡器有限公司；BCM-1000A 生物潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；H10-50133 生化培養(yǎng)箱，天津宏諾儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基：葡萄糖濃度為20 g/L、普通蛋白胨濃度為20 g/L、酵母浸粉濃度為10 g/L、pH 為自然條件，裝液量為50 mL/250 mL 三角瓶，在30 ℃、180 r/min恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)24 h。

篩選培養(yǎng)基：葡萄糖濃度為20 g/L、普通蛋白胨濃度為20 g/L、酵母浸粉濃度為10 g/L、溴甲酚綠濃度為0.1 g/L、琥珀酸濃度為2 g/L、乙醛酸濃度為2 g/L、瓊脂濃度為20 g/L，在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h。

高密度培養(yǎng)基礎培養(yǎng)基：葡萄糖濃度為20 g/L、普通蛋白胨濃度為20 g/L、酵母浸粉濃度為10 g/L、味精濃度為10 g/L，pH 為自然條件，裝液量為50 mL/250 mL 三角瓶，在37 ℃、150 r/min 恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)。

1.2.2 酵母菌HU-TS3菌株活化

將酵母菌HU-TS3 斜面菌株，采用平板劃線法接種到種子培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基平板上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)。挑取培養(yǎng)基上單菌落接種到液體種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)24 h，得到種子液。

1.2.3 酵母菌HU-TS3生長曲線測定

按3%的接種量，將種子液接種于10 mL/50 mL三角瓶中，在30 ℃、180 r/min 恒溫搖床中培養(yǎng)，從0 h 開始，每隔2 h 取樣，在560 nm 處測定吸光度（OD）[11]，測得的吸光度要保證在0.2～0.8[12]之間。以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制酵母菌HU-TS3生長曲線。

1.2.4 酵母菌HU-TS3 增殖培養(yǎng)基及條件優(yōu)化單因素試驗

選取可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、糊精5種碳源進行單因素試驗，檢測560 nm處的OD值以確定最佳碳源種類，接著設置碳源濃度為25、30、35、40 g/L與45 g/L進行單因素試驗[13]，以確定最佳濃度。

設置普通蛋白胨濃度依次為10、15、20、25 g/L與30 g/L[14]，酵母浸粉濃度依次為5、10、15、20 g/L 與25 g/L，分別進行單因素試驗，檢測560 nm 處的OD值以確定最佳氮源種類及濃度。

設置接種量依次為1%、2%、3%、4%(v/v)與5%(v/v)[15]，培養(yǎng)基初始pH 為4、5、6、7、8、未調(diào)[15]，培 養(yǎng)時間設置為12、24、36、48 h 與60 h[16]，裝液量 為5 mL/250 mL、10 mL/250 mL、15 mL/250 mL、20 mL/250 mL 與25 mL/250 mL，分別進行單因素試驗，檢測560 nm 處的OD值以確定最佳接種量、初始pH、培養(yǎng)時間及裝液量。

1.2.5 響應面相關試驗設計

依據(jù)單因素試驗的結果利用Plackett-Burman設計篩選對酵母菌HU-TS3 增殖影響顯著因子，采用n= 12 的Plackett-Burman 設計（因素水平值見表1），選取6個因素，其中，高水平“1”是低水平“-1”的1.5～2.0 倍。對于試驗結果，分別計算各因素的效應，并進行t檢驗，選擇置信度大于95%的因素作為顯著因素進一步考察。

表1 Plackett-Burman設計因素水平

依據(jù)Plackett-Burman 設計試驗結果，選取P＜ 0.1 的因素，如果因素呈現(xiàn)正效應，就從低水平往上增加；呈現(xiàn)出負效應，則從高水平往下減少；其他影響不顯著的取最優(yōu)水平進行試驗，每個顯著因子的步長根據(jù)單因素試驗的結果確定。

確定最顯著因素的最優(yōu)水平，逼近最大產(chǎn)區(qū)后，進行響應面中心組合試驗設計（因素水平設計見表2），以試驗結果擬合建立描述響應量（OD560nm）與自變量（影響菌體增殖的顯著因素）關系的多項式回歸模型，再對擬合方程進行規(guī)范性分析，尋找回歸模型的穩(wěn)定點，得到最大OD560nm時顯著因素的最優(yōu)水平，并進行試驗驗證。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有單因素試驗，都進行3組平行試驗并重復3次，數(shù)據(jù)的處理及作圖用Office 2016-Excel 工作表完成；響應面試驗設計及數(shù)據(jù)分析，采用Minitab19與Design Expert10軟件完成。

2 結果與分析

2.1 酵母菌HU-TS3菌株活化及特性觀察

將斜面酵母菌HU-TS3 用生理鹽水制成菌懸液，將其進行稀釋涂布和平板劃線，于30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。由圖1(a)可以觀察到單菌落呈乳白色，圓形，突起，邊緣齊整，表面光滑。由圖1(b)可以看出，菌落呈藍綠色，是因為當菌體合成GABA時，會與培養(yǎng)基中添加的乙醛酸、琥珀酸及溴甲酚綠發(fā)生專一性顯色反應，使其表現(xiàn)為藍綠色[17]。

圖1 菌落形態(tài)

2.2 酵母菌HU-TS3生長曲線

酵母菌HU-TS3 生長曲線如圖2 所示。由圖2可知，酵母菌HU-TS3 的對數(shù)生長期為4～12 h，在此時間段生長速率達到最大，菌體活力最好，所以選擇種子液培養(yǎng)時間為10 h。

圖2 酵母菌HU-TS3生長曲線

2.3 酵母菌HU-TS3增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源種類及濃度對酵母菌HU-TS3 增殖的影響

碳源種類及濃度對微生物生長十分重要，碳不僅可作為細胞的基本骨架，還可作為化能異養(yǎng)型微生物的能源物質(zhì)。由圖3(a)可知，與其他碳源相比，當葡萄糖作為碳源時，OD值最大，原因可能是葡萄糖作為單糖分子進入細胞內(nèi)參與代謝合成比多糖更為容易，所以選擇葡萄糖作為酵母菌HU-TS3 增殖培養(yǎng)基的碳源[18]。當葡萄糖濃度為40 g/L 時，OD560nm最大（見圖3(b)）。

圖3 不同碳源和葡萄糖濃度對酵母菌HU-TS3增殖的影響

2.3.2 氮源濃度對酵母菌HU-TS3增殖的影響

氮源對微生物生長有著十分重要的影響，作為培養(yǎng)基中的主要成分，能夠很大程度上影響菌體的生長情況。由圖4 可知，當?shù)鞍纂藵舛葹?0 g/L、酵母浸粉濃為15 g/L 時，OD560nm達到最大，與董碩等[19]研究結果一致。

2.4 培養(yǎng)條件對酵母菌HU-TS3增殖的影響

2.4.1 接種量對酵母菌HU-TS3增殖影響

接種量的多少，影響著菌種生長調(diào)整期，也與菌種生長速率相關。接種量太少，生長速度相對降低，無法在培養(yǎng)基中快速成為優(yōu)勢菌，雜菌快速生長而染菌；接種量過大，會造成短時間內(nèi)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分大量減少，導致菌體快速自溶。由圖5可知，當接種量為3%時，培養(yǎng)液OD560nm最大。

圖5 接種量對酵母菌HU-TS3增殖影響

2.4.2 初始pH對酵母菌HU-TS3增殖的影響

pH的高低會影響微生物體內(nèi)酶的活性，同時還會影響培養(yǎng)基成分的理化性質(zhì)與培養(yǎng)基成分吸收情況，從而影響菌株的生長代謝。由圖6可知，當初始pH 為6.00 時，培養(yǎng)液OD560nm達到最大，為20.05，與自然條件（pH = 5.87）下OD560nm值（19.83）相近。單藝等[20]在假絲酵母菌Y-2生長特性研究中發(fā)現(xiàn)酵母菌的最佳培養(yǎng)pH 值為5.50。綜上選定自然條件下的pH作為酵母菌HU-TS3增殖的最佳初始pH。

圖6 初始pH對酵母菌HU-TS增殖的影響

2.4.3 培養(yǎng)時間對酵母菌HU-TS3增殖的影響

培養(yǎng)時間的長短對菌體濃度有著顯著的影響，由圖7 可知，當培養(yǎng)時間達到36 h，培養(yǎng)液OD560nm達到最大，因此酵母菌HU-TS3 的高密度培養(yǎng)時間選擇36 h。

圖7 培養(yǎng)時間對酵母菌HU-TS3增殖影響

2.4.4 裝液量對酵母菌HU-TS3增殖影響

裝液量是影響培養(yǎng)基溶氧的因素之一，對于三角瓶搖床培養(yǎng)，裝液量越少，溶氧越大。由圖8 可知，裝液量越大，培養(yǎng)液OD560nm越小。當裝液量為5 mL/50 mL 三角瓶時，酵母菌HU-TS3 培養(yǎng)液OD560nm最大，此時錐形瓶的裝液系數(shù)為0.10。劉梅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當裝液系數(shù)為0.11時，酵母菌的增殖效果顯著。因此，酵母菌HU-TS3 在三角瓶搖床高密度培養(yǎng)時的裝液系數(shù)選擇0.10。

圖8 培養(yǎng)時間對酵母菌HU-TS3增殖影響

2.5 響應面相關試驗

2.5.1 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman 試驗結果見表3，各因素的系數(shù)估計和效應評價見表4。由表4 可知，對酵母菌HU-TS3 培養(yǎng)液中OD560nm值有顯著影響(置信度大于95%，P＜ 0.05)的因素有3 個：葡萄糖、蛋白胨及酵母浸粉，且均呈現(xiàn)正效應。

表3 Plackett-Burman 試驗設計及響應值(n=12)

表4 Plackett-Burman 設計中各因素系數(shù)的估計及效應評價(α=0.05，置信度為95%)

2.5.2 最陡爬坡試驗確定中心點

由表5 可知，OD560nm最大區(qū)在第3 次試驗附近，以試驗3作為響應曲面試驗因素水平的中心點，即：葡萄糖濃度為50 g/L，蛋白胨濃度為30 g/L，酵母浸粉濃度為25 g/L。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果

2.5.3 響應面設計確定最顯著因素的最優(yōu)水平

利用Minitab 19 軟件對葡萄糖、蛋白胨和酵母浸粉設計3 因素3 水平的響應面中心組合試驗，試驗結果見表6，響應值的方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

表7 響應值的方差分析

由表7 可知，所選擇的回歸模型的P值為0.0011，表明該整體模型具有可信度；失擬項的P值為0.1257，失擬項檢驗不顯著，模型選擇適當。一次項A、二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜ 0.01）、交互項A×B對結果影響較顯著（P＜ 0.1）。調(diào)整后的R2= 94.16%，表明94.16%的酵母菌HU-TS3培養(yǎng)液的OD560nm變化可由此模型解釋。OD560nm（Y）對葡萄糖濃度（A）、蛋白胨濃度（B）和酵母浸粉濃度（C）的多元二次回歸方程為：

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉3個因素兩兩交互作用對酵母菌HU-TS3 菌液OD560nm的影響如圖9 所示。由圖9 可知該方程有最大值，利用軟件分析計算，葡萄糖濃度為51.27 g/L、蛋白胨濃度為29.63 g/L、酵母浸粉濃度為25.08 g/L時，菌液OD560nm最大為34.4631?？紤]實際操作可行性，將上述最優(yōu)條件修正為葡萄糖濃度為51 g/L、蛋白胨濃度為30 g/L，酵母浸粉濃度為25 g/L。以此最優(yōu)條件進行3次重復試驗，測得酵母菌HU-TS3菌液平均OD560nm為34.606，與預測擬合度達99.59%，表明優(yōu)化模型可靠。

圖9 兩兩交互作用對酵母菌HU-TS3菌液OD560nm的影響

3 結束語

通過對產(chǎn)GABA 的酵母菌HU-TS3 進行高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化，在最佳的培養(yǎng)條件下活菌數(shù)達到8.1 × 109CFU/mL，為優(yōu)化前的兩倍多。隨著人們生活水平的不斷提高，對食品的要求也越來越高，各種功能性發(fā)酵食品的研制，成為目前食品研發(fā)的熱點之一。利用產(chǎn)γ-氨基丁酸酵母菌發(fā)酵研制各種富含功能性因子γ-氨基丁酸的發(fā)酵食品也是趨勢之一。發(fā)酵成功與否關鍵因素在于菌株，直投式菌劑是目前各種發(fā)酵企業(yè)首選的接種方式，酵母菌HU-TS3高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化研究為大規(guī)模產(chǎn)γ-氨基丁酸酵母菌直投式菌體的制備提供了理論依據(jù)。