LincRNA AC027700.1在小鼠蛻膜化中的表達(dá)研究

譚麗萍，高茹菲，尹鑫，陳雪梅，李方方，袁柳，何俊琳

研究報(bào)告

LincRNA AC027700.1在小鼠蛻膜化中的表達(dá)研究

譚麗萍，高茹菲，尹鑫，陳雪梅，李方方，袁柳，何俊琳

重慶醫(yī)科大學(xué)，生殖與發(fā)育國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400016

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200 nt、不具有蛋白編碼潛能的RNA分子。在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、物質(zhì)代謝以及疾病等的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用，但在蛻膜化相關(guān)領(lǐng)域研究報(bào)道較少。為了探究lincRNA AC027700.1在早孕小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)規(guī)律，初步探討AC027700.1在小鼠蛻膜化中的作用，本研究利用qRT-PCR檢測(cè)AC027700.1在小鼠孕第6 d胚胎著床點(diǎn)及著床旁子宮組織中的表達(dá)；構(gòu)建了假孕小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型和原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型，qRT-PCR檢測(cè)AC027700.1在人工誘導(dǎo)蛻膜化的組織和細(xì)胞中的表達(dá)；通過分離細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)RNA，qRT-PCR檢測(cè)AC027700.1在胞核和胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)水平；利用GOseq和KOBAS軟件對(duì)AC027700.1下游靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析。結(jié)果表明，AC027700.1在小鼠孕第6 d著床點(diǎn)子宮組織中的表達(dá)顯著高于著床旁；AC027700.1在成功誘導(dǎo)蛻膜化的子宮內(nèi)膜組織及細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于未誘導(dǎo)的組織及細(xì)胞；AC027700.1主要定位于細(xì)胞核內(nèi)；AC027700.1下游靶基因主要富集于自噬通路、細(xì)胞周期以及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路。本研究初步揭示了lincRNA AC027700.1可能與早孕子宮內(nèi)膜蛻膜化有關(guān)，但具體作用及調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

lincRNA；AC027700.1；蛻膜化；子宮內(nèi)膜；著床

盡管輔助生殖技術(shù)在不斷進(jìn)步并已成為目前治療不孕癥的最重要手段，但臨床妊娠率和胚胎著床率仍然保持相對(duì)較低的水平[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織計(jì)算，大約50%的不孕癥是由女性生殖缺陷引起的[2]，而母體子宮內(nèi)膜蛻膜化缺陷是導(dǎo)致不孕的重要原因之一[3,4]。正常生理狀況下，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞受到蛻膜化誘導(dǎo)因子的刺激，廣泛增殖分化而形成一種特殊的蛻膜組織。蛻膜組織能為胚胎的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)母體子宮的適度侵襲提供保障以及參與協(xié)調(diào)母胎免疫應(yīng)答等，對(duì)于人類及所有侵入性著床動(dòng)物(靈長(zhǎng)類動(dòng)物及嚙齒類動(dòng)物)的妊娠建立和維持都是不可或缺的[5,6]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是指長(zhǎng)度超過200 nt、不具有蛋白編碼潛力的轉(zhuǎn)錄本[7]。根據(jù)lncRNA相對(duì)于蛋白編碼基因的位置，可將其分為不與蛋白編碼基因序列有重疊的長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA, lincRNA)，其余以某種方式與蛋白編碼基因重疊的lncRNA被進(jìn)一步分類為外顯子lncRNA、內(nèi)含子lncRNA和重疊子lncRNA[8]。越來越多的研究證據(jù)表明，lncRNA具有基因轉(zhuǎn)錄、RNA剪接、mRNA翻譯以及表觀遺傳調(diào)節(jié)等功能[9～11]，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、物質(zhì)代謝等過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用[12,13]。除此之外，lncRNA還可以作為分子支架調(diào)節(jié)核酸-核酸、核酸-蛋白或蛋白-蛋白之間的相互作用[13,14]。LncRNA的異常表達(dá)與許多疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如腫瘤[15]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16]、自身免疫性疾病[17]和心血管系統(tǒng)疾病[18]等。但迄今為止，lncRNA在蛻膜化相關(guān)領(lǐng)域的研究報(bào)道較少。本課題組前期通過RNA-seq測(cè)序技術(shù)對(duì)小鼠孕第6 d著床點(diǎn)及著床旁子宮組織中的RNA進(jìn)行測(cè)序，首次發(fā)現(xiàn)lincRNA AC027700.1在著床點(diǎn)和著床旁子宮組織中的表達(dá)存在顯著差異，提示AC027700.1可能參與小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程。因此，本研究進(jìn)一步探究了AC027700.1在小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的表達(dá)規(guī)律，以期為后續(xù)深入探討lincRNA在小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用提供線索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物樣本

本研究所使用的6～8周齡雌雄昆明小鼠購(gòu)買并代養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK(渝) 2018-0003；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可號(hào)：SYXK(渝) 2018-0003)。小鼠于溫度(22±2)℃、12 h光照/12 h黑暗、自由攝水和飲食條件下飼養(yǎng)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 正常孕鼠子宮內(nèi)膜組織收取及轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序

構(gòu)建正常妊娠孕鼠模型，將雌鼠與雄鼠按3:1比例合籠，次日清晨有陰道栓的雌鼠視為妊娠第1 d (D1)。以脫頸法處死孕第6 d小鼠，收集胚胎著床點(diǎn)(implantation sites, IS)和著床旁(inter implantation sites, IIS)子宮組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，著床點(diǎn)和著床旁的區(qū)分見圖1A。共收取4份小鼠著床點(diǎn)和著床旁子宮組織，建庫(kù)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析均由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 假孕小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化

參考文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法構(gòu)建假孕小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型：將雌鼠與雙側(cè)輸精管結(jié)扎的雄鼠按3:1進(jìn)行合籠，次日清晨有陰道栓的雌鼠記為假孕第1 d(PD1)。假孕第4 d(PD4)早上9:00對(duì)雌鼠一側(cè)子宮給予子宮角注射玉米油(美國(guó)Sigma公司)處理(即誘導(dǎo)側(cè))，另一側(cè)不給予任何處理(即對(duì)照側(cè))。假孕第8 d (PD8)處死小鼠，分別收集小鼠雙側(cè)子宮內(nèi)膜組織。

1.4 原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分離及培養(yǎng)

按照文獻(xiàn)[20]報(bào)道的方法分離原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，具體步驟如下：(1)以脫頸法處死8周齡左右正常昆明雌鼠，在無菌環(huán)境下，取出小鼠雙側(cè)子宮，HBSS(上海博士德公司)清洗后剪碎；(2)加入適量胰蛋白酶，4℃中消化2 h，之后轉(zhuǎn)移至37℃中繼續(xù)消化30 min；(3)用槍頭反復(fù)吹打組織10 min后，加入適量膠原酶(美國(guó)Sigma公司)，于37℃中消化30 min；(4)將消化完畢的組織經(jīng)70 μm濾器過濾，對(duì)下層細(xì)胞懸液進(jìn)行離心并清洗。接種適量的細(xì)胞懸液于含有20%血清(以色列Biological Industries公司)、青鏈霉素及兩性霉素(上海碧云天公司)DF12培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)培養(yǎng)；(5)大約1 h后更換培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃的孵箱中培養(yǎng)過夜。

次日更換培養(yǎng)基，同時(shí)依據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法，加入10 nmol/L 雌二醇和1 μmol/L 孕酮(美國(guó)Sigma公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)蛻膜化處理，連續(xù)誘導(dǎo)72 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 鬼筆環(huán)肽-FITC染色

將分離得到的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞接種到無菌細(xì)胞爬片上，按上述方法誘導(dǎo)其蛻膜化。72 h后，使用無菌PBS清洗爬片3次，每次5 min。使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(鬼筆環(huán)肽-FITC，美國(guó)Sigma公司)避光染色40～60 min。之后DAPI避光核染10 min，PBS清洗后，取出爬片，滴加抗熒光淬滅劑，封片后于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用Trizol (美國(guó)Sigma公司)提取子宮內(nèi)膜組織及細(xì)胞總RNA，并檢測(cè)其濃度和純度。使用PrimerScript RTTMMaster Mix (Perfect Real Time)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(日本TaKaRa公司)在Real-time PCR儀(美國(guó)BioRad公司)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，各基因引物序列見表1。以β-actin作為總RNA內(nèi)參，采用2–ΔΔCT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞核、質(zhì)RNA分離

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法，使用RNA Subcellular Isolation Kit試劑盒(美國(guó)Active motif公司)提取細(xì)胞核RNA和細(xì)胞質(zhì)RNA。其工作原理是利用完全裂解液裂解已誘導(dǎo)蛻膜化的基質(zhì)細(xì)胞，然后高速離心分離裂解液，上清液即包含細(xì)胞質(zhì)RNA，沉淀含細(xì)胞核RNA。之后利用純化柱對(duì)RNA進(jìn)行清洗純化，純化后的RNA用于qRT-PCR。以核小RNA U3及U4作為細(xì)胞核內(nèi)參，β-actin作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參，采用已報(bào)道的2?dCt[2?(NUC Ct?CYT Ct)]法[21]計(jì)算AC027700.1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

1.8 生物信息學(xué)分析

利用iLoc-LncRNA(iLoc-LncRNA (lin-group.cn))對(duì)AC027700.1亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用GOseq軟件和KOBAS軟件分別對(duì)AC027700.1下游靶基因進(jìn)行基因本體富集(Gene Ontology, GO)分析和通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組之間數(shù)據(jù)比較均采用配對(duì)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，以*< 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 LincRNA AC027700.1在早孕小鼠子宮組織中的表達(dá)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)lincRNA AC027700.1在小鼠孕第6 d著床點(diǎn)和著床旁子宮組織中的表達(dá)存在顯著差異(圖1B)，提示AC027700.1可能在早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中發(fā)揮調(diào)控作用。LincRNA AC207700.1基因位于小鼠第10號(hào)染色體上，轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)2587 bp，包含3個(gè)外顯子(圖1C)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AC207700.1在早孕小鼠子宮組織中的表達(dá)，本研究進(jìn)一步分離了小鼠孕第6 d著床點(diǎn)和著床旁子宮組織(圖1A)，并通過qRT-PCR檢測(cè)了AC027700.1在著床點(diǎn)和著床旁子宮組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，AC027700.1在著床點(diǎn)的表達(dá)顯著高于著床旁(圖1D)。

2.2 假孕小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化后AC027700.1表達(dá)上調(diào)

為排除胚胎對(duì)AC027700.1表達(dá)的影響以及進(jìn)一步確定AC027700.1在小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用，本研究構(gòu)建了假孕小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型。結(jié)果顯示，和對(duì)照側(cè)相比，假孕小鼠誘導(dǎo)側(cè)子宮明顯腫大、重量顯著增加、蛻膜標(biāo)志物蛻膜/滋養(yǎng)層催乳素相關(guān)蛋白(decidual/trophoblastic prolactin related proteins, Dtprp) mRNA水平顯著增高(圖2：A～C)，以上結(jié)果提示假孕小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型構(gòu)建成功。qRT-PCR結(jié)果顯示，AC027700.1在誘導(dǎo)側(cè)子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)照側(cè)(圖2D)。

2.3 體外誘導(dǎo)原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化后AC027700.1表達(dá)上調(diào)

子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞向具有分泌功能的上皮樣蛻膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)變是蛻膜化最顯著的特征，也是目前研究蛻膜化最主要的對(duì)象[22]。為進(jìn)一步探索AC027700.1在基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中的作用，本研究分離和培養(yǎng)了原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，聯(lián)合應(yīng)用雌二醇和孕酮對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)蛻膜化。利用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞的F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)進(jìn)行熒光染色后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，誘導(dǎo)組細(xì)胞胞體變大變圓、雙核細(xì)胞數(shù)量增加(圖3A)。同時(shí)qRT-PCR結(jié)果顯示，蛻膜化標(biāo)志物Dtprp在誘導(dǎo)組細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(圖3B)，提示原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型成功構(gòu)建。qRT-PCR檢測(cè)AC027700.1在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外蛻膜化過程中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AC027700.1在誘導(dǎo)組細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(圖3C)，提示AC027700.1可能在基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

圖1 AC027700.1在小鼠孕第6 d子宮中的表達(dá)

A：小鼠孕第6 d子宮；B：AC027700.1在小鼠孕第6 d的IIS和IS子宮組織中的FPKM值；C：AC027700.1基因組位點(diǎn)；D：qRT-PCR檢測(cè)AC027700.1在小鼠孕第6 d的IIS和IS子宮組織中的表達(dá)。IIS：著床旁；IS：著床點(diǎn)。*< 0.05，***< 0.001。

圖2 AC027700.1在假孕小鼠人工體內(nèi)誘導(dǎo)蛻膜化模型中的表達(dá)

A：假孕小鼠人工體內(nèi)誘導(dǎo)蛻膜化模型；B：雙側(cè)子宮重量比較；C：qRT-PCR檢測(cè)Dtprp在IDC及ID子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)；D：qRT-PCR檢測(cè)AC027700.1在IDC及ID子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)。IDC：對(duì)照側(cè)；ID：誘導(dǎo)側(cè)。*< 0.05，**< 0.01。

圖3 AC027700.1在原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外人工誘導(dǎo)蛻膜化模型中的表達(dá)

A：異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對(duì)IDC及ID細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白染色；B：qRT-PCR檢測(cè)Dtprp在IDC及ID細(xì)胞中的表達(dá)；C：qRT-PCR檢測(cè)AC027700.1在IDC及ID細(xì)胞中的表達(dá)。IDC：對(duì)照組；ID：誘導(dǎo)組。*< 0.05。

2.4 AC027700.1主要定位在基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核

LncRNA的功能取決于其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位：核富集lncRNA的功能包括染色質(zhì)相互作用、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等；而富集于細(xì)胞質(zhì)的lncRNA主要參與調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性或翻譯等[15]。因此，為探究AC027700.1可能發(fā)揮的功能，本研究首先利用在線預(yù)測(cè)工具iLoc-LncRNA對(duì)AC027700.1細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示AC027700.1主要定位于細(xì)胞核，可能性約為0.65 (圖4A)。為驗(yàn)證AC027700.1亞細(xì)胞定位，本研究對(duì)對(duì)照組及誘導(dǎo)組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)RNA分離，以只存在于細(xì)胞核的核小RNA U3、U4作為胞核內(nèi)參，以主要存在于胞質(zhì)的β-actin作為胞質(zhì)內(nèi)參。利用qRT-PCR分別檢測(cè)了U3、U4、β-actin及AC027700.1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，核小RNA U3、U4在胞核中的表達(dá)顯著高于胞質(zhì)，β-actin在胞質(zhì)中的表達(dá)顯著高于胞核(圖4B)，證明細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)RNA分離成功。AC027700.1主要富集在細(xì)胞核中，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖4C)。

2.5 AC027700.1下游靶基因預(yù)測(cè)

根據(jù)lncRNA與下游靶基因位置關(guān)系可以將lncRNA功能大致分為影響附近基因表達(dá)或染色質(zhì)狀態(tài)的順式調(diào)節(jié)和在整個(gè)細(xì)胞中執(zhí)行功能的反式調(diào)節(jié)[23]。基于全轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，本研究根據(jù)AC027700.1與基因的位置關(guān)系(上下游100 kb以內(nèi))進(jìn)行順式共定位靶基因預(yù)測(cè)，根據(jù)與基因的表達(dá)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)大于0.95)進(jìn)行反式共表達(dá)靶基因預(yù)測(cè)。最終預(yù)測(cè)得到：AC027700.1下游共定位靶基因2個(gè)，共表達(dá)靶基因598個(gè)，共計(jì)600個(gè)(圖5A)。分別利用GOseq和KOBAS軟件對(duì)AC027700.1靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析。結(jié)果顯示，AC027700.1共定位靶基因主要富集于T細(xì)胞激活、T細(xì)胞聚集、淋巴細(xì)胞聚集等生物學(xué)過程，主要參與調(diào)控自噬通路(圖5：B，C)；AC027700.1共表達(dá)靶基因主要富集于基礎(chǔ)代謝、大分子代謝等細(xì)胞生物學(xué)過程，主要參與調(diào)控自噬、細(xì)胞周期和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路(圖5：D，E)。以上結(jié)果提示，主要定位于細(xì)胞核的AC027700.1可能通過順式作用或反式作用調(diào)節(jié)下游靶基因，從而通過調(diào)控自噬、細(xì)胞周期以及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路在蛻膜化中發(fā)揮用。

圖4 AC027700.1細(xì)胞定位

A：iLoc-LncRNA預(yù)測(cè)AC027700.1在細(xì)胞中的定位；B：qRT-PCR檢測(cè)U3、U4和β-actin在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RNA中的相對(duì)表達(dá)；C：qRT-PCR檢測(cè)AC027700.1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RNA中的相對(duì)表達(dá)。IDC：對(duì)照組；ID：誘導(dǎo)組。

圖5 AC027700.1靶基因GO和KEGG分析

A：AC027700.1下游靶基因分類；B：AC027700.1共定位靶基因GO分析；C：AC027700.1共定位靶基因KEGG分析；D：AC027700.1共表達(dá)靶基因GO分析；E：AC027700.1共表達(dá)靶基因KEGG分析。*< 0.05。

3 討論

人類和哺乳動(dòng)物的妊娠是一個(gè)復(fù)雜的、受多種因素精細(xì)調(diào)控的過程，包括受精、著床、子宮內(nèi)膜蛻膜化、胎盤形成、分娩等事件，任何一個(gè)階段異?；蚴《紩?huì)影響妊娠結(jié)局[3,24]。母體子宮內(nèi)膜處于容受狀態(tài)、胚胎與母體子宮內(nèi)膜同步對(duì)話是成熟胚胎成功著床的決定因素[25]。在母體一側(cè)，由于早期妊娠中蛻膜化異常導(dǎo)致的蛻膜缺陷可促使不孕、反復(fù)植入失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子癇前期、早產(chǎn)等妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生[3,4]。例如，Aghajanova等[26]認(rèn)為子宮內(nèi)膜蛻膜化受損是子宮內(nèi)膜異位癥患者不孕的病理基礎(chǔ)。研究報(bào)道，蛻膜缺陷是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要發(fā)生機(jī)制[27]。Hirota等[28]研究發(fā)現(xiàn)子宮轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白P53(Trp53)缺失的雌鼠在排卵、受精及胚胎著床階段均正常。然而，胚胎植入后子宮蛻膜細(xì)胞表現(xiàn)出終末分化和生長(zhǎng)受限，誘發(fā)了胎兒早產(chǎn)、難產(chǎn)和死亡。因此，蛻膜化的正常進(jìn)行是成功妊娠的關(guān)鍵。深刻理解蛻膜化發(fā)展過程及其調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)于預(yù)防、治療妊娠相關(guān)疾病具有重要的意義。

子宮內(nèi)膜蛻膜化同樣受眾多因素的調(diào)控，包括甾體激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等[29]。以往研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可能在胚胎著床和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖分化中起著重要的調(diào)控作用[30,31]。例如，Liu等[32]對(duì)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(human endometrial stromal cells, HESCs)進(jìn)行cAMP處理后，lncRNA LINC00473表達(dá)顯著增加。在HESCs的體外誘導(dǎo)蛻膜化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，LINC00473表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致人蛻膜PRL和IGFBP1的mRNA及蛋白水平降低，提示蛻膜化進(jìn)程受到抑制。Zhang等[33]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CD36-005在PCOS大鼠卵巢及子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)顯著上調(diào)，lncRNA CD36-005可改變大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的mRNA分子表達(dá)譜，降低大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖活性。

本研究經(jīng)過RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)lincRNA AC027700.1在小鼠孕第6 d著床點(diǎn)子宮組織中的表達(dá)顯著高于著床旁。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，本研究成功構(gòu)建了假孕小鼠體內(nèi)人工誘導(dǎo)蛻膜化模型和原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型。研究結(jié)果顯示，AC027700.1在成功誘導(dǎo)蛻膜化的小鼠子宮內(nèi)膜組織及細(xì)胞中的表達(dá)顯著增高。同時(shí)，為了探索AC027700.1的功能，本研究首先對(duì)AC027700.1的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了探索。iLoc-LncRNA預(yù)測(cè)結(jié)果和qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞核、質(zhì)RNA中AC027700.1的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AC027700.1主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。AC027700.1下游靶基因GO和KEGG分析結(jié)果提示，AC027700.1下游靶基因可能通過調(diào)控自噬、細(xì)胞周期以及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路在蛻膜化中發(fā)揮調(diào)控作用，但仍需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)lincRNA AC027700.1在小鼠孕第6 d著床點(diǎn)子宮組織中高表達(dá)，并探討了AC027700.1在小鼠蛻膜化過程中的表達(dá)規(guī)律及其亞細(xì)胞定位，初步預(yù)測(cè)和篩選了可能參與調(diào)控蛻膜化的下游通路?？傊?，lincRNA AC027700.1的表達(dá)譜鑒定和初步的功能分析強(qiáng)調(diào)了lincRNA在早孕子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的重要性，為胚胎著床的研究提供了新的思路和理論依據(jù)，亦為女性妊娠及妊娠相關(guān)疾病提供新的標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。

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The expression of lincRNA AC027700.1 in mouse decidualization

Liping Tan, Rufei Gao, Xin Yin, Xuemei Chen, Fangfang Li, Liu Yuan, Junlin He

Long non-coding RNAs (lncRNAs), which belong to the non-protein-coding RNAs, are greater than 200 nt in length. Although they have been found to play crucial roles in the regulation of cell growth and development, cell metabolism and the development of diseases, they are rarely reported in decidualization. The objective of our study is to explore the expression of lincRNA AC027700.1 in the endometrium of early pregnant mice and its role in decidualization. The expression of AC027700.1 in uterine tissues at implantation sites and inter implantation sites on the 6th day of pregnancy were detected by qRT-PCR. The relative expression of AC027700.1 in anmodel of induced decidualization in pseudopregnant mice and inmodel of induced decidualization in primary stromal cells and nucleus/cytoplasmic fractions were detected by qRT-PCR. GO and KEGG analysis of downstream target genes were performed by GOseq and KOBAS, respectively. The results show that AC027700.1 expression is significantly increased in tissues at implantation sites on the 6th day of pregnancy and in decidualized endometrial tissues and stromal cells. Furthermore, AC027700.1 localizes in the nuclear fraction and the downstream targeted genes are mainly involved in autophagy, cell cycle and RNA transport pathways. This study revealed that lincRNA AC027700.1 may be involved in decidualization of endometrium in early pregnancy, but the specific role and regulatory mechanism remain to be further studied.

lincRNA; AC027700.1; decidualization; endometrium; implantation

2021-10-15;

2022-01-17;

2022-01-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31571554)，重慶市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：cstc2020jcy j-msxmX0041)和重慶市研究生導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：dstd201809)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31571554), General Project of Chongqing Natural Science Foundation (No.cstc2020jcy j-msxmX0041) and Postgraduate Tutor Team Construction Project of Chongqing (No.dstd201809)]

譚麗萍，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生殖遺傳學(xué)。E-mail: 2957066450@qq.com

何俊琳，博士生導(dǎo)師，研究方向：胚胎著床分子機(jī)理，雌性生殖損傷機(jī)制。E-mail: hejunlin@cqmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.21-356

(責(zé)任編委: 單革)