細(xì)胞dNTP庫的穩(wěn)態(tài)維持與基因組穩(wěn)定性

劉聰，馮佳妮，李瑋瑋，朱偉偉，薛云新，王岱，趙西林

綜 述

細(xì)胞dNTP庫的穩(wěn)態(tài)維持與基因組穩(wěn)定性

劉聰，馮佳妮，李瑋瑋，朱偉偉，薛云新，王岱，趙西林

廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361102

作為DNA合成的重要前體，細(xì)胞中4種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)是DNA復(fù)制、重組和修復(fù)所必需的原材料，而DNA的正確合成及其完整性則是基因組穩(wěn)定性的重要體現(xiàn)，因此dNTP庫狀態(tài)的穩(wěn)定對(duì)維持基因組的穩(wěn)定進(jìn)而保證細(xì)胞的穩(wěn)定至關(guān)重要。從dNTP庫的質(zhì)量上講，一些異質(zhì)dNTP如氧化的dNTP摻入DNA容易引發(fā)堿基替換甚至DNA斷裂重排，會(huì)極大地?fù)p害基因組的穩(wěn)定性。但與此同時(shí)，細(xì)胞也進(jìn)化出了相應(yīng)的NTP焦磷酸酶將其清除，并且細(xì)胞也會(huì)通過形成DNA損傷修復(fù)網(wǎng)絡(luò)來校正損傷的DNA及修復(fù)DNA缺口。從dNTP庫的數(shù)量上講，dNTP的濃度及比例失衡也會(huì)造成堿基突變和移碼突變，這同樣會(huì)引發(fā)基因組不的穩(wěn)定性，由此細(xì)胞進(jìn)化出了龐大的酶控網(wǎng)絡(luò)以對(duì)其進(jìn)行精密調(diào)控。本文主要綜述細(xì)胞內(nèi)dNTP庫組分受損的潛在危害及受損dNTP的清除和dNTP庫組分間平衡的調(diào)控及失衡的后果，最后介紹了與dNTP庫穩(wěn)態(tài)相關(guān)的臨床疾病,旨在為細(xì)胞dNTP庫的穩(wěn)態(tài)維持與基因組穩(wěn)定性的相關(guān)性研究提供一定的思路方向，最終為相關(guān)疾病的治療提供部分理論依據(jù)。

dNTP池；質(zhì)量控制；數(shù)量調(diào)控；基因組穩(wěn)定性；臨床疾病

DNA是生物細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者，指導(dǎo)生物體完成生命活動(dòng)。遺傳信息從DNA轉(zhuǎn)錄“流入”RNA，再通過RNA翻譯“流入”蛋白質(zhì)，最后由蛋白質(zhì)承擔(dān)生命活動(dòng)。DNA上不同脫氧核糖核苷酸排列的方式?jīng)Q定了不同的遺傳信息，該信息的精準(zhǔn)調(diào)控是生物體完成正常生命活動(dòng)的前提保證。生物體主要依靠以下幾種機(jī)制實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制的高保真度：(1)核苷酸遵守嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)則；(2) DNA聚合酶5′→3′DNA聚合活性中心選擇具有正確幾何形狀的核苷酸；(3)DNA聚合酶3′→5′外切活性中心校對(duì)復(fù)制出錯(cuò)的核苷酸；(4)DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)系統(tǒng)捕捉更正逃避校對(duì)的錯(cuò)配核苷酸[1]。此外，細(xì)胞內(nèi)還有許多的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)用以維持DNA的正常狀態(tài)，從而避免損傷的、可能引發(fā)誘變的DNA進(jìn)入下一輪復(fù)制。

關(guān)于DNA復(fù)制的保真度問題，越來越多的研究聚焦于DNA的前體狀態(tài)，即4種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)的質(zhì)量和數(shù)量是否處于正常狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)的4種dNTP的濃度并不是保持相等，且總濃度也并非處于恒定的狀態(tài)。在一般情況下，4種dNTP的濃度比值處于一定的范圍，普遍的情形是在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞內(nèi)dGTP濃度都是最低的，并且總dNTP濃度維持在較低水平[2]。而dNTP庫(池)本身容易受到細(xì)胞自身及許多環(huán)境因子的影響，引起非正常的化學(xué)修飾。此外，dNTP庫的大小及組成也受胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，代謝網(wǎng)絡(luò)的擾動(dòng)可能導(dǎo)致dNTP庫大小改變或者某種dNTP的比例發(fā)生變化，這些因素都有概率引發(fā)DNA復(fù)制保真度的降低，從而影響基因組的穩(wěn)定性。

基因組不穩(wěn)定性主要涉及點(diǎn)突變和基因重排：點(diǎn)突變包括堿基替換、微插入和微缺失；基因重排則包括DNA序列的缺失、重復(fù)、擴(kuò)增、插入、倒位或易位[3]。點(diǎn)突變主要出現(xiàn)在DNA復(fù)制和修復(fù)的過程中，基因重排則受到兩種因素的控制：(1)抑制因子，包括復(fù)制、修復(fù)和S期檢查點(diǎn)因子；(2)染色體位點(diǎn)，包括脆弱的位點(diǎn)和高度轉(zhuǎn)錄的DNA序列[4]。而dNTP庫作為DNA合成的前體，其質(zhì)量和數(shù)量的穩(wěn)態(tài)維持對(duì)于點(diǎn)突變和基因重排出現(xiàn)的節(jié)點(diǎn)都具有重要影響。從群體的角度來看，點(diǎn)突變和基因重排都為生物進(jìn)化擴(kuò)充了原材料，對(duì)生命適應(yīng)不斷變化的自然環(huán)境具有積極作用。但是對(duì)于細(xì)胞和生命個(gè)體來講，基因組的不穩(wěn)定性引發(fā)的基因功能改變很有可能是具有消極作用甚至是致命的。本文主要以細(xì)胞為討論對(duì)象，闡述了其如何通過維持dNTP庫的穩(wěn)態(tài)來保證基因組的穩(wěn)定性，從而使細(xì)胞和生命個(gè)體能夠進(jìn)行正常的生命活動(dòng)。

1 dNTP質(zhì)量調(diào)控

1.1 dNTP損傷可能導(dǎo)致DNA復(fù)制的保真性下降

在質(zhì)量上，游離的dNTP庫因其不穩(wěn)定的化學(xué)特性容易被氧化、脫氨基化，而那些被修飾或損傷的dNTP被摻入DNA是有毒的或引起誘變的，這需要受到生物體的嚴(yán)格把控。所有好氧生物都離不開氧氣，而這些生物體內(nèi)的有氧代謝也依靠O2參與來產(chǎn)生生命所需的能量以及各種代謝產(chǎn)物，但隨之而來的是活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生。ROS主要包括過氧化氫(H2O2)、有機(jī)氫過氧化物(ROOH)、超氧陰離子自由基(O2·?)、羥自由基(·OH)等等。ROS有多種來源，包括有氧呼吸中的氧化磷酸化電子傳遞鏈，過渡金屬離子以及一些外界因素刺激如電離輻射、化學(xué)氧化劑等，因此ROS的產(chǎn)生是難以避免的。同時(shí)ROS也是一把雙刃劍，它既可作為多效信號(hào)分子來調(diào)節(jié)代謝網(wǎng)絡(luò)，也可能引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生生理毒性[5,6]。

DNA盡管是構(gòu)成生命基礎(chǔ)的核心部件(RNA病毒除外)，但從化學(xué)意義上講，DNA其實(shí)是一種不太穩(wěn)定的分子，游離的dNTP化學(xué)活性更高[7]，因此兩者都極容易產(chǎn)生氧化損傷，其中一個(gè)研究較為透徹的例子是8-氧代-7,8-二氫鳥嘌呤(8-oxo-G)。由于鳥嘌呤(G)的氧化還原電勢(shì)在幾種堿基里相對(duì)較低，因此其特別容易被氧化，產(chǎn)生幾種不同的氧化產(chǎn)物，數(shù)量最多并且最為典型的就是8-oxo-G[8]。8-oxo-G在空間結(jié)構(gòu)上和胸腺嘧啶(T)的順式構(gòu)象極為相似，這可能引發(fā)錯(cuò)誤的A:8-oxo-G配對(duì)取代正確的C:8-oxo-G堿基對(duì)匹配[9]。更嚴(yán)重的問題是，由于它模仿了沃森克里克經(jīng)典配對(duì)模型，無法在DNA主鏈中引起錯(cuò)誤的不正常扭曲，A:8-oxo-G錯(cuò)配并不能被DNA聚合酶的3′→5′外切校對(duì)。相反，正確的C:8-oxo-G堿基對(duì)被認(rèn)為是錯(cuò)配，最終導(dǎo)致C:8-oxo-G配對(duì)效率低下，在經(jīng)歷下一輪復(fù)制后最終產(chǎn)生C:G→A:T的轉(zhuǎn)化突變[10～13]。ROS攻擊核酸堿基會(huì)形成多種不同的化學(xué)修飾，例如環(huán)飽和和環(huán)片段化的胸腺嘧啶(T)殘基，這類修飾主要引起細(xì)胞毒性損傷，對(duì)基因組突變誘導(dǎo)的貢獻(xiàn)很小。其他一些堿基氧化產(chǎn)物則會(huì)引起配對(duì)錯(cuò)誤并引發(fā)誘變，例如2-羥基腺嘌呤的摻入會(huì)形成A:T→G:C和A:T→T:A的突變，5-羥基胞嘧啶的摻入會(huì)形成C:G→T:A和C:G→G:C的突變，5-甲酰尿嘧啶的摻入會(huì)形成T:A→C:G和T:A→A:T的突變，5-羥基尿嘧啶和尿嘧啶二醇摻入會(huì)形成C:G→T:A的突變等[14]。而8-oxo-G是引發(fā)誘變的主要參與者，據(jù)估計(jì)8-oxo-G的損傷在正常組織中的穩(wěn)態(tài)水平下約為103個(gè)/細(xì)胞/天，在癌組織中更高達(dá)105個(gè)損傷/細(xì)胞/天[15]。這些非經(jīng)典dNTP的產(chǎn)生基本上都會(huì)誘發(fā)點(diǎn)突變的生成甚至DNA的斷裂，這極大地?fù)p害了基因組的穩(wěn)定性。為了防止這些情況的發(fā)生，生物體進(jìn)化出了相應(yīng)的清除校正機(jī)制。

1.2 生物體內(nèi)清除損傷dNTP的主要機(jī)制

為了保證dNTP庫的質(zhì)量，生物體進(jìn)化出了許多NTP焦磷酸酶，這些酶可以將已修飾的NTP水解為相應(yīng)的單磷酸酯(圖1A)。例如，肌苷三磷酸焦磷酸酶(ITPase)可以將脫氨基嘌呤核苷三磷酸(ITP和dITP)水解為核苷單磷酸[16,17]。這些酶被稱為“清潔酶”，主要被劃分為幾類結(jié)構(gòu)性超家族(表 1)，包括Nudix結(jié)構(gòu)水解酶(具有高度保守的23個(gè)氨基酸殘基序列，稱為Nudix盒)、全β dUTP焦磷酸酶(蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由β折疊構(gòu)成)、ITP焦磷酸酶和全α NTP焦磷酸酶(蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α螺旋構(gòu)成)[18-19]。

圖1 生物體內(nèi)dNTP庫的清潔及雙鏈DNA中受損堿基的清除

A: dNTP被氧化修飾后通過NTP焦磷酸酶水解為相應(yīng)的單磷酸酯；B: DNA復(fù)制過程中被摻入氧化損傷的堿基通過BER切除。

表1 生物體內(nèi)的dNTP庫清潔酶及其底物

1.2.1 Nudix超家族

大腸埃希氏菌MutT是第一種被認(rèn)為可以用來清潔dNTP庫的酶，最初被定義為低特異性水解dGTP和其他典型的NTP焦磷酸酶[20]。然而，隨后的研究表明，8-oxo-dGTP相比dGTP具有更高的親和力[21]。MutT的酶活位點(diǎn)包含幾個(gè)殘基，可幫助區(qū)分位于催化位點(diǎn)附近的這兩種NTP。人類MTH1 (MutT同源酶)對(duì)8-oxo-dGTP、2-oxo-dATP和8-oxo-dATP也具有活性[22]。Nudix超家族的酶水解多種底物，包括二核苷多磷酸鹽、加帽的RNA和二核苷酸輔酶。因此，一些Nudix超家族酶不僅可以水解dNTP來對(duì)dNTP庫進(jìn)行直接清潔，還可以通過清除與dNTP代謝相關(guān)的各種產(chǎn)物來進(jìn)行間接清潔[23]。

1.2.2 全β dUTP焦磷酸酶

在所有非經(jīng)典NTP中，最常見的是dUTP，它是細(xì)菌胸腺嘧啶核苷酸生物合成的中間體，由dCTP脫氨基產(chǎn)生并被dUTPase水解為dUMP。因此，細(xì)菌dUTPase被認(rèn)為是典型的代謝酶。但是，將dUTP摻入DNA會(huì)引發(fā)尿嘧啶DNA糖基化酶的攻擊，從而導(dǎo)致雙鏈斷裂，最終損害DNA的完整性。在細(xì)菌和酵母的研究中發(fā)現(xiàn)，dUTP數(shù)量的增加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)是有害的，dUTPase的功能對(duì)其保持生存能力至關(guān)重要[24～26]。同時(shí)在人類中發(fā)現(xiàn)，dUTPase對(duì)DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性是有積極作用的[27]，但它具體如何參與細(xì)胞代謝尚未被廣泛研究。

1.2.3 ITP焦磷酸酶

ITPases是非經(jīng)典嘌呤核苷三磷酸[(d)ITP和(d)XTP]的水解酶，可以有效將其代謝并防止它們進(jìn)入DNA和RNA中[28-29]。1964年首次在人的紅細(xì)胞中被表征[30]，后來陸續(xù)在其他生物體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)，包括在古生菌中YggV和大腸桿菌中RdgB同源蛋白被表征。在高等生物中，這些非經(jīng)典核苷三磷酸的摻入可能是誘變的，包括影響mRNA的轉(zhuǎn)錄以及進(jìn)入DNA的雙鏈合成[31]，ITPase基因敲除的小鼠具有胚胎致死性這一事實(shí)也證明了這種誘變的嚴(yán)重危害[32]。針對(duì)脫氨基嘌呤類的清潔酶的冗余同樣表明其在維持基因組穩(wěn)定中的重要作用。然而，這些酶在細(xì)胞中的詳細(xì)生理作用和分支仍需要進(jìn)一步研究。

1.2.4 全α NTP焦磷酸酶

全α NTP焦磷酸酶超家族包括MazG、MazG樣水解酶和二聚體dUTPase[33]。與上述全β dUTPase的功能相同，全α dUTPase可以水解dUTP，但由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的顯著差異，它也可以水解dUDP[34]。通常在某些原核和真核生物中不表達(dá)全β dUTPase的時(shí)候，全α dUTPase就會(huì)開始出現(xiàn)在我們的視野當(dāng)中，這表明了dUTP水解對(duì)生物體的必要性。MazG和MazG樣酶在生物體中普遍存在，并被認(rèn)為只能將經(jīng)典的NTP選擇性水解為它們各自的單磷酸酯[35-36]。但最近的發(fā)現(xiàn)改變了這種看法，研究發(fā)現(xiàn)分枝桿菌MazG可對(duì)氧化的嘧啶5-羥基dCTP的細(xì)胞進(jìn)行清潔[37]，而人DCTPP1(XTP3-轉(zhuǎn)活化蛋白A，dCTPase)更傾向于以修飾的dCTP作為底物，包括氟化、甲酰化或5-甲基dCTP[38]。

1.3 生物體內(nèi)清除雙鏈DNA中受損堿基的主要機(jī)制

當(dāng)dNTP庫清潔未完全，受損的dNTP就可能被摻入到DNA中，此外DNA因其化學(xué)特性也易被氧化，最終致使DNA雙鏈中含有受損的堿基，同樣這些受損的堿基也可能引起誘變和DNA損傷，與此同時(shí)生物體也進(jìn)化出了相應(yīng)的校正機(jī)制。

生物體主要依靠堿基切除修復(fù)(base-excision repair，BER)和MMR途徑清除DNA雙鏈中的受損堿基。以8-oxo-G為例，在大腸桿菌中，由兩種DNA糖基化酶Fpg(也稱MutM)和MutY來完成BER，清除校正摻入DNA中的8-oxo-G。Fpg可以切除釋放DNA中被氧化損傷的8-oxo-G，而MutY則負(fù)責(zé)把8-oxo-G錯(cuò)配的A剪切。而Fpg和MutY的缺失都導(dǎo)致了很強(qiáng)的基因組堿基替換表型，其中的大部分都是GC到TA的轉(zhuǎn)化[39]。

在釀酒酵母()中，主要由真核細(xì)胞獨(dú)有的DNA糖基化酶OGG1完成BER以切除被氧化損傷的8-oxo-G，但是卻并未發(fā)現(xiàn)MutY蛋白的功能同源物。研究表明釀酒酵母是依靠MMR來完成類似的生物學(xué)進(jìn)程，通過復(fù)制性DNA聚合酶和DNA聚合酶η去除和8-oxo-G錯(cuò)配的A，此外聚合酶η也能夠?qū)與8-oxo-G正確配對(duì)[40]。而由RAD6-RAD18和PCNA泛素化介導(dǎo)的復(fù)制后修復(fù)(post-replication repair，PRR)也為8-oxo-G誘變的預(yù)防做出了貢獻(xiàn)。當(dāng)RAD6-RAD18對(duì)PCNA進(jìn)行單泛素化后，DNA聚合酶η更容易被招募至有氧化損傷的地方，進(jìn)而把正確的C與8-oxo-G配對(duì)[41]。數(shù)據(jù)表明，OGG1是清除8-oxoG的主要力量，但MMR，PRR以及DNA聚合酶η也都發(fā)揮了不容小覷的作用。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要依靠?jī)煞NDNA糖基化酶OGG1和MUTYH完成BER。MUTYH是MutY的同源蛋白，負(fù)責(zé)與8-oxo-G錯(cuò)配的A的切除釋放，OGG1則將C：8-oxo-G配對(duì)中受損的G清除(圖1B)。與釀酒酵母相似，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA聚合酶η和聚合酶λ也可以協(xié)同將C與8-oxo-G正確配對(duì)。此外其他途徑包括核苷酸切除修復(fù)，MMR等都協(xié)同這兩種蛋白構(gòu)建了精密的氧化堿基清除機(jī)制[42]。當(dāng)然，雙鏈中8-oxo-G的清除機(jī)制只是生物體校正受損堿基一種經(jīng)典的概述，其他例如單鏈斷裂修復(fù)(single-strand break repair，SSBR)，雙鏈斷裂修復(fù)(double-strand break repair，DSBR)尿嘧啶摻入造成的DNA斷裂都對(duì)基因組的穩(wěn)定起了相當(dāng)大的作用。

2 dNTP庫數(shù)量上的調(diào)控

2.1 dNTP庫的失衡可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定

dNTP庫的濃度受到多方面的調(diào)控，其可能因?yàn)樯矬w本身或外界因素引起失衡，包括總dNTP濃度的升高、降低，以及4種組分間的比例變化，研究表明這種失衡可能導(dǎo)致基因突變，原因可能主要?dú)w因于：dNTP庫失去平衡后，多余的dNTP在DNA復(fù)制過程中會(huì)增加該種dNTP摻入子代DNA的概率，導(dǎo)致dNTP與模板的錯(cuò)誤結(jié)合，進(jìn)而誘發(fā)DNA堿基突變，而且這種突變一般傾向于發(fā)生在下一個(gè)被結(jié)合的dNTP是過盛dNTP的位置，這種現(xiàn)象被稱為后核苷酸效應(yīng)。而在生物體內(nèi)存在多種dNTP濃度波動(dòng)的情形，細(xì)胞由親代產(chǎn)生子代需要經(jīng)歷完整的細(xì)胞周期，包括細(xì)胞間期和細(xì)胞分裂期，其中細(xì)胞間期又被分為G1，S，G2三個(gè)時(shí)期，dNTP濃度則跟隨三個(gè)時(shí)期的變遷產(chǎn)生變化，從G1期到S期總體水平升高，S期水平到達(dá)峰值，隨后在S期到G2期逐漸回落[43]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，一些DNA復(fù)制因子和修復(fù)元件的缺陷也會(huì)導(dǎo)致總dNTP濃度的升高[44]。而紫外線、電離輻射以及化學(xué)誘變劑等許多外界因素都可能引起DNA損傷，從而導(dǎo)致dNTP庫的擴(kuò)大[45]。在此情況下，DNA聚合酶的校對(duì)活性會(huì)被一定程度地抑制，從而導(dǎo)致其聚合活性高于校對(duì)外切活性，最終引起錯(cuò)誤的核苷酸摻入，發(fā)生堿基替換[46]。有趣的是，dNTP饑餓也會(huì)導(dǎo)致總dNTP濃度的升高。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，休眠的細(xì)胞被激活進(jìn)入細(xì)胞周期，許多復(fù)制起始因子的表達(dá)消耗了較多的dNTP，而dNTP饑餓則可能導(dǎo)致dNTP的過度補(bǔ)償。嚴(yán)重的dNTP饑餓可能導(dǎo)致DNA的合成停止，復(fù)制叉停滯。中等水平的饑餓帶來的影響可能更大，在此情況下，DNA的合成不會(huì)完全終止，但是一些難以復(fù)制的序列無法合成，最終產(chǎn)生不完整的染色體[47]。低水平的饑餓則可能導(dǎo)致核糖核苷單磷酸(rNMP)的摻入，而rNMP的校對(duì)相對(duì)不正確的堿基來說是比較困難的，摻入的rNMP容易使之后的DNA合成停滯[48]。最后，4種dNTP組分的比例失衡也可能導(dǎo)致基因突變。比例的變化會(huì)引發(fā)后核苷酸效應(yīng)，致使錯(cuò)誤的dNTP被DNA聚合酶摻入，進(jìn)而產(chǎn)生堿基替換。在大腸桿菌中的研究顯示，缺失株胞內(nèi)dCTP水平增加4倍、dGTP水平降低2倍后，會(huì)導(dǎo)致G:C→T:A和A:T→T:A的突變效應(yīng)分別增強(qiáng)27倍和42倍。此外，缺失株胞內(nèi)dATP水平降低4倍、dCTP水平增加2倍后，導(dǎo)致了A:T→T:A的突變效應(yīng)增強(qiáng)24倍?！板e(cuò)摻增強(qiáng)模板－引物錯(cuò)位”模型的提出也揭示了dNTP比例失衡可能會(huì)產(chǎn)生移碼突變[49]，在酵母中發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，菌株的dATP和dGTP水平分別增加了6.6倍和16倍，dCTP降低了12倍，導(dǎo)致該菌株的插入缺失率平均增加了66倍[50]。

2.2 dNTP庫的數(shù)量調(diào)控機(jī)制

dNTP庫的數(shù)量調(diào)控存在許多路徑。至關(guān)重要的路徑之一涉及到核糖核苷酸還原酶(RNR)，該酶負(fù)責(zé)催化由核糖核苷酸到脫氧核糖核苷酸的反應(yīng)，進(jìn)而控制了總體dNTP的合成，此外該酶還可以控制4種dNTP的相對(duì)水平，使產(chǎn)生的dNTP維持一定的比例。RNR是一種極其保守的酶，在原核生物、真核生物中都有存在，其有多種亞型，最經(jīng)典的是具有大小亞基的異源四聚體亞型，它是一種變構(gòu)調(diào)節(jié)酶，在大亞基R1上含有兩個(gè)變構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)。第一個(gè)調(diào)控位點(diǎn)可以感知ATP/dATP的比例變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)RNR的整體活性。第二個(gè)變構(gòu)位點(diǎn)是dATP，ATP，dGTP和dTTP的特異性結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)某種dNTP結(jié)合的時(shí)候，就會(huì)轉(zhuǎn)換成催化相應(yīng)NDP的激活態(tài)構(gòu)象。作為從頭合成dNTP的限速酶，生物體dNTP水平的調(diào)控很大程度上依賴于RNR的這種變構(gòu)調(diào)節(jié)[51]。而RNR也借此在胞內(nèi)眾多生命進(jìn)程中扮演了一個(gè)不可或缺的角色，例如細(xì)胞周期的進(jìn)程與RNR的活性緊密相連，細(xì)胞在G0或在G1期RNR的活性被抑制，隨著細(xì)胞周期到達(dá)G1晚期和S早期，活性顯著上調(diào)，與之相互呼應(yīng)的是RNR的小亞基僅僅在G1晚期和S早期表達(dá)，最終在S末期被降解，結(jié)果就是dNTP水平隨RNR活性在細(xì)胞周期中先上升后下降[52]。此外，RNR通過上調(diào)活性來響應(yīng)DNA損傷也是較為普遍的現(xiàn)象，例如大腸桿菌暴露于紫外線會(huì)引發(fā)RNR活性上升來提高dNTP水平，進(jìn)而使大腸桿菌能夠進(jìn)行跨病變合成[53]。同樣的，在酵母和果蠅中也有相同的現(xiàn)象[54]。

在大腸桿菌和人類細(xì)胞中，RNR催化的由核糖核苷酸到脫氧核糖核苷酸的還原反應(yīng)是在核苷二磷酸水平發(fā)生的(NDP→dNDP)。之后，dNDP通過核苷二磷酸激酶(NDK)轉(zhuǎn)換為dNTP。因此NDK同樣在dNTP庫的維持方面發(fā)揮了巨大的作用，研究發(fā)現(xiàn)，在NDK缺失的菌株中存在失衡的dNTP庫，并且菌株自發(fā)突變頻率增加了20～50倍[55]。此外，在SAMHD1缺失細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)dNTP庫出現(xiàn)失調(diào)，與之相應(yīng)的是基因組的穩(wěn)定性下降[56]。SAMHD1蛋白是一種水解酶，負(fù)責(zé)把dNTP切割成對(duì)應(yīng)的的脫氧核苷和三磷酸。研究表明SAMHD1水解dNTP有助于細(xì)胞控制細(xì)胞分裂周期中的dNTP濃度，進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)程。

除了這些與dNTP代謝直接相關(guān)或是極為關(guān)鍵的酶，dNTP水平的調(diào)控更是嵌入了一個(gè)巨大的核酸代謝網(wǎng)絡(luò)(圖2)，dNTP的從頭合成，嘌呤嘧啶的挽救等途徑的擾動(dòng)都會(huì)對(duì)dNTP水平產(chǎn)生巨大的影響。包括胸苷激酶(TK)、胸苷合酶(TS)、dUTP焦磷酸水解酶(Dut)等缺失導(dǎo)致dTTP數(shù)量的下降；葉酰聚谷氨酸合成酶(Met7)的失活導(dǎo)致高dUTP/dTTP比，促使尿嘧啶摻入基因組DNA；脫氧胞苷脫氨酶(DCD)缺失的細(xì)胞表現(xiàn)出失衡的dNTP庫，并引發(fā)了誘變?cè)黾覽57]。這些數(shù)據(jù)表明，dNTP庫的代謝與穩(wěn)態(tài)是一個(gè)巨大調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，一旦與之相關(guān)的途徑受阻都會(huì)引發(fā)dNTP庫的變化，最終導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定。

3 維持dNTP庫穩(wěn)態(tài)的蛋白與臨床疾病

3.1 調(diào)控dNTP庫質(zhì)量的蛋白與臨床疾病

在各種細(xì)菌和酵母中進(jìn)行的全局誘變研究表明，除了dUTPase外，清潔酶通常是非必需的，即使清潔酶發(fā)生缺失細(xì)胞仍可存活，并且沒有表現(xiàn)出比較明顯的生長(zhǎng)缺陷。在大腸桿菌中，MutT蛋白功能完全喪失的突變體中除了導(dǎo)致突變率升高外，并沒有產(chǎn)生其他明顯的表型變化。突變體表現(xiàn)出的突變率也僅比野生型略高。但是，此類突變體在與組成型缺失后表現(xiàn)出了致死的表型。在酵母中的研究則顯示，某些Nudix酶突變體傳代至20代以后會(huì)產(chǎn)生生長(zhǎng)缺陷[58]。而這種突變?cè)谌祟惡蛣?dòng)物中的后果表現(xiàn)得比微生物更為明顯。例如MutT直系同源蛋白MTH1功能喪失后導(dǎo)致了小鼠患癌率的明顯上升[59]。

而在人類當(dāng)中，MTH1的功能可能更為重要。在哺乳動(dòng)物的大腦中成熟的神經(jīng)元是不可再生的，必須在個(gè)體的整個(gè)生命周期中保持其功能的運(yùn)轉(zhuǎn)。而在成人大腦中神經(jīng)元具有很強(qiáng)的代謝活性，每天大約有5 kg ATP的周轉(zhuǎn)，僅占體重2%大腦的O2消耗量卻占比全身的20%。這種大量ATP的使用必然會(huì)伴有大量ROS的產(chǎn)生，如超氧化物、過氧化氫和羥基自由基。ROS則會(huì)攻擊氧化細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子，因此神經(jīng)元極易產(chǎn)生氧化損傷[60]。在這些生物大分子中核酸的氧化受損更加危險(xiǎn)，核酸中攜帶的信息可能會(huì)因此發(fā)生改變，甚至導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，而這種細(xì)胞的程序性死亡通常會(huì)導(dǎo)致退行性疾病的發(fā)生。8-oxoG作為一種主要類型的氧化堿基，已被發(fā)現(xiàn)在衰老過程中會(huì)在細(xì)胞核和線粒體基因組中積累，并且這種積累在患有各種神經(jīng)退行性疾病的患者中表現(xiàn)得更加顯著，例如帕金森病、阿爾茨海默病。

圖2 生物體內(nèi)部分核酸代謝網(wǎng)絡(luò)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，PD患者的主要特征是黑質(zhì)紋狀體通路中多巴胺能神經(jīng)元的丟失。研究表明[61]，在PD患者的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元中，線粒體DNA或細(xì)胞質(zhì)RNA中8-oxoG的積累相比對(duì)照組明顯增加，與此同時(shí)定位于線粒體中的MTH1蛋白水平，以及OGG1-2a(OGG1在線粒體中的存在形式)相比對(duì)照組也明顯增加。這可能表明患者幸存的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元中MTH1表達(dá)增加可以起到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種遲發(fā)性、進(jìn)行性、年齡依賴性的神經(jīng)退行性疾病，其特征是認(rèn)知功能受損以及行為和人格改變。已經(jīng)觀察到在AD患者大腦中核內(nèi)和線粒體DNA中8-oxoG的水平相比對(duì)照組顯著上升，與此同時(shí)在AD患者大腦的眶額回和內(nèi)嗅皮層中，OGG1-2a的表達(dá)相比對(duì)照組顯著下降[62]。這些結(jié)果表明，線粒體DNA氧化損傷修復(fù)酶在AD患者腦中可能沒有發(fā)揮正常的功能，造成了線粒體DNA的氧化損傷。此外，在人死后腦組織的研究表明，AD患中MTH1蛋白在海馬體CA3區(qū)透明層突觸中的表達(dá)要顯著低于非神經(jīng)系統(tǒng)病例。這意味著AD患者大腦中海馬突觸的衰退喪失，進(jìn)而產(chǎn)生了認(rèn)知障礙。另外，dUTPase的突變也會(huì)導(dǎo)致人類細(xì)胞凋亡和巨幼紅細(xì)胞性貧血；一個(gè)全外顯子組測(cè)序項(xiàng)目揭示了嚴(yán)重的人類(編碼ITPase)突變會(huì)導(dǎo)致早期嬰兒腦病和死亡；ITPase功能缺失會(huì)引發(fā)嘌呤類似物硫唑嘌呤(用作治療癌癥和炎癥性腸病的免疫抑制劑)的不良反應(yīng)，且其與早發(fā)性結(jié)核病的易感性也具有關(guān)聯(lián)；研究顯示DCTPP1在乳腺癌中顯著高表達(dá)，并且其與乳腺癌的腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。這些證據(jù)都表明了調(diào)控dNTP庫質(zhì)量蛋白功能的改變可能會(huì)誘發(fā)臨床疾病。

3.2 調(diào)控dNTP庫數(shù)量的蛋白與臨床疾病

dNTP水平的調(diào)控嵌入了一個(gè)龐大的代謝網(wǎng)絡(luò)，因此在微生物中，即便是相對(duì)極為重要的RNR功能喪失除了引起基因突變率的上升，也沒有對(duì)細(xì)胞表型產(chǎn)生明顯的影響，只有某些重要的基因才無法進(jìn)行聯(lián)合敲除，例如雙突變體是不可行的[63]。同樣的，這種調(diào)控dNTP庫數(shù)量的基因突變?cè)谌祟惡蛣?dòng)物中引發(fā)的后果更加嚴(yán)重。例如在小鼠中RNR的R2亞基的過表達(dá)導(dǎo)致更高的dNTP水平,進(jìn)而誘發(fā)了突變頻率和肺腫瘤的增加[64]。

而在人類中，更多的證據(jù)表明了調(diào)控dNTP庫數(shù)量的蛋白的重要性。一個(gè)正常的細(xì)胞必須維持具有兩個(gè)不對(duì)稱時(shí)空的dNTP庫：一種用于核DNA合成和修復(fù)，另一種用于mtDNA復(fù)制和修復(fù)。dNTP平衡的破壞會(huì)增強(qiáng)誘變，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而引發(fā)癌癥，并可能產(chǎn)生代謝疾病[65]。在細(xì)胞質(zhì)中dNTP池濃度與細(xì)胞周期是呈正相關(guān)性，S期開始時(shí)dNTP的數(shù)量是不足以進(jìn)行完整DNA復(fù)制的。dNTP水平在S期的增加是保證核DNA復(fù)制保真性所必需的。mtDNA則在有絲分裂后的細(xì)胞中不斷復(fù)制，并且mtDNA的復(fù)制保真性也取決于適宜的dNTP水平。因此，增殖和非增殖細(xì)胞都需要調(diào)控核苷酸和dNTP合成，以允許核和mtDNA復(fù)制和修復(fù)，維持細(xì)胞的健康。

核苷酸代謝失調(diào)與廣泛的病理狀況，包括癌癥和線粒體疾病。幾乎所有代謝途徑都與dNTP生物合成有關(guān)，包括從頭合成和補(bǔ)救途徑，以及所有涉及的回補(bǔ)反應(yīng)，這之間形成了高度的交叉調(diào)節(jié)。眾所周知，癌細(xì)胞必須提高dNTP生物合成的速率以滿足其快速增殖帶來的基因組快速復(fù)制，因此高度交叉的生長(zhǎng)信號(hào)通路在癌細(xì)胞中被重新編程。在人類癌癥中c-Myc是最常見的改變蛋白之一，其受到PI3K-AKT和ERK1/2-MAPK通路的調(diào)節(jié)[66]。c-Myc是一種高度多效性轉(zhuǎn)錄因子，是控制細(xì)胞代謝的主要調(diào)節(jié)因子，分別調(diào)控了糖酵解、谷氨酰胺代謝和線粒體的生成。此外，c-Myc還可以誘導(dǎo)肝臟攝取和利用葡萄糖，同時(shí)阻斷糖異生和酮體生成途徑，這表明c-Myc在肥胖和胰島素抵抗中具有抑制作用。除了調(diào)節(jié)葡萄糖和谷氨酰胺，嘌呤和嘧啶生物合成的底物，c-Myc還調(diào)控了核苷酸代謝酶基因表達(dá)。因此，c-Myc的失調(diào)會(huì)極大地改變癌癥中的核苷酸池穩(wěn)態(tài)，且根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測(cè)c-Myc在線粒體疾病中的作用也與核苷酸代謝有關(guān)。此外，在胃癌、卵巢癌、膀胱癌和結(jié)直腸癌中也有RRM2過表達(dá)的情況發(fā)生，RRM2表達(dá)的程度與乳腺癌和上皮性卵巢癌的腫瘤分級(jí)也具有重要聯(lián)系，這表明RNR功能的改變?yōu)槟[瘤的快速細(xì)胞分裂提供了巨大的支持[67]。無獨(dú)有偶，在許多癌癥病例中都發(fā)現(xiàn)了SAMHD1活性或表達(dá)的抑制。因此，SAMHD1功能受損導(dǎo)致dNTP池的上升，進(jìn)而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[68]。這些數(shù)據(jù)都表明了嵌入調(diào)控dNTP庫數(shù)量網(wǎng)絡(luò)蛋白功能的改變可能會(huì)誘發(fā)臨床疾病。

4 結(jié)語與展望

檢驗(yàn)dNTP庫的變化，首先需要定量測(cè)定胞內(nèi)的dNTP庫，傳統(tǒng)的方法是結(jié)合放射性來檢測(cè)dNTP，操作較為繁瑣，且安全隱患偏大，改進(jìn)的方法是基于熒光的測(cè)定法，相較而言，比較簡(jiǎn)單安全，靈敏度雖也相對(duì)較高，但仍無法和傳統(tǒng)方法媲美[69]。dNTP的定量分析具有挑戰(zhàn)性，dNTP的準(zhǔn)確測(cè)量也需要進(jìn)一步發(fā)展成熟。此外，在體外測(cè)定得到的dNTP濃度是否能夠真實(shí)反映用于DNA復(fù)制或修復(fù)的dNTP濃度，也就是說胞內(nèi)各處的濃度是否是保持一致也仍需進(jìn)一步探討。另外，DNA復(fù)制叉處的dNTP濃度必然是相對(duì)較高的。在原核生物中，DNA聚合酶對(duì)dNTP親和力是比較低的，因此需要dNTP合成酶形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)移至DNA復(fù)制叉處與DNA復(fù)制裝置相結(jié)合以提供高濃度的dNTP，而在真核生物中，DNA聚合酶對(duì)dNTP親和力相對(duì)較高，具有多個(gè)復(fù)制叉，鏈的延伸速度比起原核生物較慢，理論上不需要類似原核生物的dNTP提供方式，dNTP自由擴(kuò)散進(jìn)入核內(nèi)即可滿足復(fù)制需求。盡管如此，不少實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明真核生物中仍可能存在暫時(shí)不為人知的dNTP輸送方式。這樣的觀點(diǎn)如果被證實(shí)，則必須重新考慮如何測(cè)量胞內(nèi)濃度不一致的dNTP庫。此外，dNTP庫定量的最大挑戰(zhàn)是其他核苷酸的存在，其中三磷酸核糖核苷(rNTP)以比dNTP高得多的濃度存在于細(xì)胞裂解物中，并且各種核苷酸的彼此分離和提取也不簡(jiǎn)單[70]。最后dNTP的化學(xué)性質(zhì)較為活潑而胞內(nèi)也存在多種的dNTP酶，在提取的過程中dNTP容易被降解或氧化破壞等，這些都是定量dNTP庫需要克服的困難。

大量數(shù)據(jù)證明，dNTP庫的狀態(tài)對(duì)生物體基因組的穩(wěn)定有重要的影響，包括其質(zhì)量和數(shù)量的平衡，但仍有許多問題亟待解決，例如dNTP庫的測(cè)定是否準(zhǔn)確，后核苷酸效應(yīng)不能解釋所有突變體的DNA突變效應(yīng)，生物體內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)DNA損傷的精確相互作用，龐大的核酸代謝網(wǎng)絡(luò)的相互擾動(dòng)。這些問題的解決對(duì)進(jìn)一步地了解dNTP庫對(duì)生物體基因組的影響有重要的意義。

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Maintenance of dNTP pool homeostasis and genomic stability

Cong Liu, Jiani Feng, Weiwei Li, Weiwei Zhu, Yunxin Xue, Dai Wang, Xilin Zhao

As an important precursor for DNA synthesis, the four deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dTTP, dGTP, and dCTP) are necessary raw materials for DNA replication, recombination, and repair in cells. The correct synthesis and integrity of DNA are important manifestations of the genome stability, so the stability of the dNTP library state is essential to maintain the stability of the genome and the cell. In terms of the quality of the dNTP library, the incorporation of some heterogeneous dNTPs, such as oxidized dNTPs, into DNA can easily cause base substitutions and even DNA breaks and rearrangements, which will greatly damage the stability of the genome. At the same time, the cell has also evolved the corresponding NTP pyrophosphatase to remove it, and to correct the damaged DNA and repair the DNA gap by forming a DNA damage repair network. In terms of the number of dNTP libraries, the imbalance of the dNTP concentration and ratio will also cause base and frameshift mutations, which will also cause genome instability. As a result, cells have evolved a huge enzyme-controlled network to carry them out under precise control. This article mainly reviews the potential harm of damage to dNTP library components in cells, the clearance of damaged dNTPs, the regulation on the balance between dNTP library components, and finally discusses clinical diseases related to dNTP library homeostasis. It provides insights on the research of the correlation between the stability of the cellular dNTP library and the genome, and finally provides some theoretical basis for the treatment of related diseases.

dNTP pool; qualitative control; quantitative regulation; genome stability; clinical disease

2021-10-16;

2021-12-14;

2021-12-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81971905)和福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：FJHJF-L-2019-4，JT180009)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81971905) and the Natural Science Foundation of Fujian Province (Nos. FJHJF-L- 2019-4, JT180009)]

劉聰，碩士研究生，專業(yè)方向：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)。E-mail: 1193850497@qq.com

趙西林，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：抗感染藥物及其作用機(jī)理。E-mail: zhaox5@xmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.21-211

(責(zé)任編委: 張?zhí)煊?