60Co-γ射線輻照滅菌對白芍藥材中有效成分的影響

崔永偉

（南京市溧水區(qū)中醫(yī)院 藥劑科，江蘇 南京 211200）

白芍藥材來源于毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗抑郁、調節(jié)免疫等藥理作用[1-3]，主要含單萜及其苷類、黃酮類、三萜及其苷類、鞣質類等成分，如沒食子酸、兒茶素、芍藥內酯苷、芍藥苷、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖（β-PGG）和苯甲酰芍藥苷等化合物，白芍藥材在煎煮、干燥、炮制等過程中，其有效成分易收到外界條件的影響而發(fā)生改變[4-8]。

中藥材一般來源于植物、動物和礦物質等，其本身常帶有微生物，加工炮制過程中也會引入微生物。部分微生物生長繁殖對中藥材質量有一定影響，甚至危及患者健康和生命安全，因此，出廠前對中藥材進行滅菌處理及控制具有十分重要的意義。目前，中藥材的滅菌方法主要有乙醇蒸汽滅菌法、干熱滅菌法、濕熱滅菌法、環(huán)氧乙烷滅菌法、微波滅菌法、60Co-γ射線輻照滅菌等，部分藥材在滅菌過程中藥材質量會有不同程度改變[9-10]。

60Co-γ射線輻照滅菌具有殺蟲滅菌、抑制發(fā)芽、保鮮等作用，其穿透力強、環(huán)保、高效，對中藥材性狀及質量影響甚微[11]，是目前中藥材滅菌的最有效方式之一[12-13]。高劑量及高頻次60Co-γ射線輻照滅菌對中藥材中有效成分的含量有一定影響，因此輻照滅菌前應開展安全性、有效性和穩(wěn)定性等方面驗證工作[14-15]，確保藥材在輻照滅菌過程中質量的穩(wěn)定性。

本研究采用0，2，5，8 kGy劑量60Co-γ射線，對6批白芍藥材進行輻照滅菌處理，考察6種有效成分，即兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG、苯甲酰芍藥苷的含量變化規(guī)律，旨在驗證白芍藥材輻照滅菌的可行性，為白芍藥材開展低劑量60Co-γ射線輻照滅菌提供參考依據

1 儀器和材料

2695型高效液相色譜儀（2996DAD檢測器，美國沃特世公司）；FW200萬能粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；AL104型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250A 型超聲波清洗器( 北京科偉永興儀器有限公司)；YJ-875 型醫(yī)用凈化工作臺（蘇州凈化設備廠）。

芍藥藥材自采（見表1），經本人鑒定為毛莨科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的去皮干燥根。世界衛(wèi)生組織規(guī)定食品輻射滅菌劑量≤10，本研究采用的輻照劑量為0，2，5，8 kGy。沒食子酸對照品（批號：110831-201906，純度：91.5 %）、芍藥苷對照品（批號：110736-201943，純度95.1 %）、兒茶素對照品（批號：110877-201604，純度：99.2 %）、均購自中國食品藥品檢定研究院，芍藥內酯苷對照品（批號：A25D8H50784，純度≥91.4 %）、苯甲酰芍藥苷對照品（批號：MUST-19022310，純度≥98.0 %）購自上海源葉生物科技有限公司；β-PGG對照品（批號：P29F7F10218，純度≥99.0 %）購自上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純（美國JT.Baker公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。

表1 白芍藥材信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件[16]

色譜柱：Tnertsil?ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～22 min，5 %→15 % A；22～40min，15 % A→38 % A；40～55 min,38 %→50 % A；60～65 min，50 % A；65～65 min，50 % A→5 % A）；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 取兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG、苯甲酰芍藥苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml分別含兒茶素0.256 mg、沒食子0.355 mg、芍藥內酯苷1.700 mg、芍藥苷8.880 mg、β-PGG 1.160 mg、苯甲酰芍藥苷0.240 mg的混合對照品貯備液；精密量取貯備液5 ml，置入25 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，混勻，濾過（0.22 μm微孔濾膜），取續(xù)濾液，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取新鮮采集白芍藥材，洗凈，除去頭尾和細根，置沸水中煮后除去外皮，曬干，粉碎過篩（四號篩），取藥材粉末約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加稀乙醇50 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz)45 min，放至室溫，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過（0.22 μm微孔濾膜），取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

圖1 白芍高效液相色譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密量取2.2.1項下混合對照品貯備液0.2，0.4，0.8，1，2，2.4，5.0 μl，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積，以峰面積（Y）對化合物質量濃度（X，mg/ml）進行線性回歸，繪制標準曲線，計算線性范圍。結果回歸方程分別為兒茶素Y=1235.32X+15.32（r=0.9991）、沒食子酸Y=7968.02X+3.70（r=0.9993）、芍藥內酯苷Y=12 031.46X-20.45（r=0.9998）、芍藥苷Y=223 462.12X-14.03（r=0.9998）、β-PGG Y=15 312.14X-26.31（r=0.9994）、苯甲酰芍藥苷Y=15363.12X-18.95（r=0.9990），組分兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷分別在0.005～0.128，0.007～0.178 ，0.034～0.850，0.178～4.440，0.023～0.580，0.005～0.120 mg/ml范圍內呈良好的線性關系。

2.3.2 精密度試驗 取2.2.1項下混合對照品溶液，按2.1項色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖峰面積，測得兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷峰面積RSD分別為0.15 %，0.20 %，0.05 %，0.02 %，0.08 %和0.25 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批（編號：A2，0 kGy）白芍藥材，按2.2.2項方法，平行制備供試品溶液6份，按2.1項色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積，計算各組分含量及RSD。結果兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷平均含量分別為1.235，1.51，7.122，33.326，4.610，0.678 mg/g，RSD分別為0.45 %，0.40 %，0.22 %，0.10 %，0.32 %和0.78 % （n=6），表明方法重復性較好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批（編號：A2，0 kGy）白芍供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，18，24 h進樣，按2.1項色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積。結果兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷面積RSD分別為1.12 %，0.98 %，0.69 %，0.84 %，0.98 %和1.36 %（n=7），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批白芍藥材（編號：A2，0 kGy）6份,洗凈，除去頭尾和細根，置沸水中煮后除去外皮，曬干，粉碎過篩（四號篩），精密稱取粉末約0.075 g，置具塞錐形瓶中，加入2.2項下混合對照品貯備液2 ml，按2.2.2項方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下進行測定，記錄色譜圖峰面積，計算白芍藥材加樣回收率，結果見表2。

表2 白芍藥材6個成分加樣回收率試驗結果（n=6）

2.4 白芍樣品測定

取經0，2，5，8 kGy60Co-γ射線輻照處理的白芍樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積，代入2.4.1項下各組分曲線方程計算6批樣品含量。采用SPSS 22軟件對輻照前后各組分含量進行配對t檢驗，考察60Co-γ射線輻照滅菌對白芍藥材中有效成分的影響，并繪制不同輻照劑量各組分含量折線圖。結果見表3、圖2。

圖2 60Co-γ射線對白芍藥材有效成分含量影響的折線圖

表3 白芍各成分含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

利用儀器自帶DAD檢測器功能，分別對兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷的光譜圖進行分析，結果表明，6成分在230 nm處吸收值均較大，可設定檢測波長為230 nm。先后考察乙腈-0.1 %冰醋酸水溶液、乙腈-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液和乙腈-0.05 %磷酸水溶液4種流動相系統(tǒng)，結果表明，以乙腈-0.05 %磷酸水溶液作為流動相時，供試品色譜圖中6個主成分均能實現較好的分離效果，色譜峰對稱性好，理論塔板數按兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷計均大于6000。在2.1項色譜條件下，分別采用Boston C18、Tnertsil?ODS-2、Phenomenex Kinetex C18及Caprisil C18-AQ 4種品牌色譜柱進行測試，結果以Tnertsil?ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱的分離效果最佳。

3.2 滅菌效果檢查

取經60Co-γ射線輻照滅菌的A1～A6樣品，按中國藥典2020年版四部（1105）非無菌產品微生物限度微生物計數法檢查[17]，結果見表4。結果，經5，8 kGy輻照滅菌樣品符合中國藥典直接口服及泡服飲片要求，即需氧菌不得過105cfu/g，霉菌和酵母菌總數不多過103cfu/g，表明60Co-γ射線輻照滅菌對白芍藥材滅菌效果較好。

表4 白芍藥材微生物限度檢查結果

3.3 不同輻照劑量對白芍質量影響

由表3可見，經成組配對t檢驗，6批樣品中有效成分含量隨60Co-γ射線輻照滅菌劑量變化而存在差異，當輻照劑量大于5 kGy時，與輻照前樣品相比，輻照后樣品中兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷含量存在顯著性差異（P＜0.05），即白芍樣品質量發(fā)生了改變。所以，為保證白芍藥材品質，60Co-γ射線輻照滅菌劑量最大設置為5 kGy較宜。由圖2可見，6批白芍藥材中兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷的含量隨輻照劑量提高而呈現下降趨勢，且當輻照劑量大于5 kGy時，折線下降趨勢最明顯，6種成分中，以芍藥苷折線較為平緩，表明，芍藥苷較其它成分受60Co-γ射線影響較小。研究表明[6-8]，兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷等成分在光照、高溫、高濕等條件下含量有不同程度改變，而60Co-γ射線輻照滅菌方法是一種環(huán)保型滅菌方法，其滅菌徹底，不存在熱對流和氣體擴散等問題，且在常溫下即可進行，有利于滅菌過程中樣品質量的穩(wěn)定性。

通過對不同劑量下60Co-γ射線輻照滅菌后白芍樣品中6個有效成分含量的研究表明，當輻照劑不超過5 kGy時，6批白芍藥材中兒茶素、沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-PGG和苯甲酰芍藥苷含量穩(wěn)定，且滅菌效果顯著，所以，60Co-γ射線輻照滅菌方法適合白芍藥材的滅菌，可為白芍藥材貯存及流通提供強有力保障。