高效液相色譜一步法快速測定10種有機(jī)酸

張艷艷，孫曉康，張曉元，袁丹丹，劉英梅，趙國敏，劉 飛

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

有機(jī)酸是一類含有羧基的化合物，是食品中酸味的主要來源，廣泛存在于水果、蔬菜和加工食品中。果蔬中的有機(jī)酸影響果蔬的色、香、味和果蔬制品的穩(wěn)定性[1]；食品中的有機(jī)酸可調(diào)節(jié)口味，改善食品風(fēng)味，影響食品的質(zhì)量和口感[2]，加工制品中的有機(jī)酸可抑制有害菌，延長其保質(zhì)期[3]。因此在產(chǎn)品的質(zhì)量管理、生產(chǎn)中，有機(jī)酸的檢測必不可少[4]。

有機(jī)酸檢測方法通常采用氣相色譜法（GC）[5]、離子色譜法（IC）[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7-9]等。其中因HPLC法操作簡單、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最廣泛，且可同時(shí)測定多種有機(jī)酸。果蔬、中藥及益生菌發(fā)酵果蔬汁飲品中的乙酸、草酸對(duì)其口感有一定影響?，F(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[10]食品有機(jī)酸（GB 5009.157-2016）測定中，可同時(shí)測定6種有機(jī)酸的含量，但并沒有對(duì)草酸、乙酸、丙酮酸等有機(jī)酸的檢測。本實(shí)驗(yàn)通過摸索優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，建立同時(shí)開展10種有機(jī)酸定性定量HPLC分析方法，靈敏度高，重復(fù)性好，對(duì)食品加工過程中控制有機(jī)酸含量、調(diào)節(jié)風(fēng)味、穩(wěn)定食品品質(zhì)具有指導(dǎo)性意義。

1 材料

1.1 材料

酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸、富馬酸、戊二酸（色譜級(jí)，Sigma）；草酸二水合物（分析純，阿拉?。患状迹ㄉV純，德國默克公司）；純凈水（娃哈哈）；KH2PO4、磷酸（分析純，國藥集團(tuán)）；果汁飲品（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Legend micro 21R低溫高速離心機(jī)（Thermo）；BSA1245電子天平（賽多利斯）；KQ-600E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GM-0.33A隔膜真空泵（天津津騰）；S201K pH計(jì)（梅特勒）。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 儲(chǔ)備液配制 精確稱取0.7 g草酸二水合物、0.125 g酒石酸、0.5 g丙酮酸、0.25 g蘋果酸、0.5 g乳酸、0.5 g乙酸、0.25 g檸檬酸、0.625 g丁二酸、0.01 g富馬酸、0.5 g戊二酸，分別用純凈水溶解，定容至5 ml，配成100 mg/ml草酸、25 mg/ml酒石酸、100 mg/ml丙酮酸、50 mg/ml蘋果酸、100 mg/ml乳酸、100 mg/ml乙酸、50 mg/ml檸檬酸、125 mg/ml丁二酸、2 mg/ml富馬酸和100 mg/ml戊二酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置于棕色瓶4 ℃儲(chǔ)存。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 采用0.1 %磷酸按照一定比例稀釋對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸儲(chǔ)備液，分別配成0.05 mg/ml草酸、0.5 mg/ml酒石酸、0.1 mg/ml丙酮酸、1 mg/ml蘋果酸、2 mg/ml乳酸、1 mg/ml乙酸、1 mg/ml檸檬酸、2.5 mg/ml丁二酸、0.01 mg/ml富馬酸、2 mg/ml戊二酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；將有機(jī)酸儲(chǔ)備液按一定比例混合，0.1 %磷酸定容至100 ml，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中同種類的有機(jī)酸的濃度相同。置于棕色瓶4 ℃儲(chǔ)存。

2.2 色譜條件的選擇

采用色譜柱：ZORBAX SB-Aq （250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；根據(jù)10種有機(jī)酸的分離情況，確定流動(dòng)相中KH2PO4溶液（磷酸調(diào)pH 2.7）的濃度、甲醇含量以及色譜柱的柱溫。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μl，按照2.2項(xiàng)優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行HPLC檢測，連續(xù)上樣6次，通過分析各有機(jī)酸的峰面積，計(jì)算峰面積的相對(duì)平均偏差（RSD）。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

有機(jī)酸混合標(biāo)樣中添加已知濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.2項(xiàng)優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行HPLC檢測，每個(gè)樣品重復(fù)上樣6次，通過峰面積，計(jì)算各有機(jī)酸平均回收率及回收率的RSD。

2.5 果汁飲品有機(jī)酸檢測

取果汁飲品1 ml，10000 r/min離心2 min，取上清，采用0.1 %磷酸稀釋10倍，0.45 μm尼龍膜過濾，按照2.2優(yōu)化后的色譜條件HPLC檢測，連續(xù)上樣3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件對(duì)有機(jī)酸組分分離效果的影響

3.1.1 流動(dòng)相中KH2PO4溶液濃度的選擇 在酸性環(huán)境中，有機(jī)酸較穩(wěn)定且易被分離，參考色譜柱對(duì)pH和鹽濃度的耐受范圍，選擇pH 2.7條件下，KH2PO4溶液濃度分別設(shè)定為5，10，20，30和40 mmol/L，結(jié)果表明，40 mmol/L KH2PO4溶液濃度條件下，蘋果酸和丙酮酸有效分離，其他濃度下蘋果酸和丙酮酸的峰型均有不同程度的重疊。

3.1.2 流動(dòng)相中甲醇含量的選擇 相同濃度KH2PO4溶液中添加不同的甲醇含量對(duì)有機(jī)酸的分離較為明顯，添加甲醇濃度分別設(shè)定為2.5 %，5 %，10 %，15 %。結(jié)果表明，5 %甲醇含量條件下，各峰型分離效果最好，甲醇含量高于5 %時(shí)，乳酸、檸檬酸、乙酸峰型有部分重疊。

3.1.3 色譜柱柱溫的選擇 固定流動(dòng)相，調(diào)節(jié)色譜柱柱溫箱的溫度為25，30，35，40 ℃。綜合分離度和保留時(shí)間，結(jié)果表明，30 ℃時(shí)各有機(jī)酸之間的分離效果最佳。

3.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，高效液相檢測條件，流動(dòng)相采用40 mmol/L KH2PO4溶液（磷酸調(diào)pH 2.7）:甲醇=95:5，柱溫30 ℃；檢測時(shí)間10 min。有機(jī)酸樣品單獨(dú)進(jìn)樣確定各有機(jī)酸的分離時(shí)間?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.1 %磷酸梯度稀釋后進(jìn)樣，以有機(jī)酸濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示，進(jìn)行線性回歸，10種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.999。有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

表1 10種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 10種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

3.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 采用上述高效液相檢測條件，計(jì)算同一濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次的各有機(jī)酸峰面積的RSD，結(jié)果見表2，各有機(jī)酸峰面積的RSD為0.82 %～2.6 %，說明該檢測方法精密度良好。

表2 10種有機(jī)酸峰面積的RSD

3.2.3 回收率實(shí)驗(yàn) 上述高效液相檢測條件，10種有機(jī)酸的回收率及相對(duì)平均偏差見圖2，結(jié)果表明，平均回收率均在94 %以上，RSD不超過4 %。證明該方法的準(zhǔn)確率較高，可用于樣品有機(jī)酸的檢測分析。

圖2 10種有機(jī)酸回收率

3.2.4 果汁飲品有機(jī)酸檢測 果汁飲品的有機(jī)酸樣品，按照3.2.1項(xiàng)的檢測方法進(jìn)行HPLC檢測，每個(gè)樣品檢測3次，取平均值，對(duì)各樣品中所含的有機(jī)酸進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表3。共檢出8種有機(jī)酸，其中草酸含量最高，可達(dá)4.75 g/L，各有機(jī)酸含量RSD小于0.5 %，可用于樣品有機(jī)酸檢測。

表3 自制果蔬汁中有機(jī)酸種類及其含量

4 結(jié)論

本研究確定了可同時(shí)檢測草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸、富馬酸和戊二酸的HPLC方法，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)10種有機(jī)酸的有效快速分離，對(duì)比GB5009.157-2016食品中有機(jī)酸的測定方法，本文中的方法測定種類更多，用時(shí)更短。方法精確度的RSD為0.82 %～2.6 %，平均加標(biāo)回收率（n=6）均在94 %以上。為檢測水果、中藥等有機(jī)酸的豐富度提供快速有效方法；對(duì)于食品加工過程中有機(jī)酸含量的控制、風(fēng)味調(diào)節(jié)、穩(wěn)定食品品質(zhì)提供指導(dǎo)性意義，具有實(shí)用價(jià)值。