種蛋孵化死胚及孵化廳環(huán)境樣本中銅綠假單胞菌的分離鑒定及其耐藥性分析

余 蘊(yùn)，向 勇，李慶缽，劉 鵬，黎麗珍，廖 明，曹偉勝, 3, 4, 5, 6*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；4. 廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；5. 人獸共患病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；6. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一種分布廣泛的人獸共患條件致病菌，可以在人、動(dòng)物、環(huán)境中循環(huán)傳播[1-2]，嚴(yán)重影響著人類(lèi)健康和畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)。研究人員對(duì)PA耐藥性的關(guān)注度從未降低，它是醫(yī)院臨床高度關(guān)注并愈發(fā)棘手的問(wèn)題，作為對(duì)抗PA最后一道有效防線的亞胺培南和美羅培南等碳青霉烯類(lèi)抗菌藥也逐漸失去其作用[3-4]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)雞及其養(yǎng)殖環(huán)境當(dāng)中的PA中一些重要耐藥基因的檢出率逐漸升高，如金屬β內(nèi)酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs)的相關(guān)耐藥基因MBLVIM-2和MBLSPM-1等[5-6]。張艷等[7]對(duì)從醫(yī)院分離到的100株P(guān)A進(jìn)行耐藥性分析，數(shù)據(jù)顯示，亞胺培南耐藥基因oprD2的檢出率為93.0%，顯著高于其他耐藥基因的檢出率，提示PA的耐藥性日漸嚴(yán)重，極大的危害臨床抗感染治療，在全球范圍內(nèi)均構(gòu)成極大的威脅[8-10]。但目前對(duì)種禽場(chǎng)孵化廳中PA的感染情況和耐藥性的相關(guān)報(bào)道仍然較少。因此，本研究旨在對(duì)廣東省種禽場(chǎng)孵化廳中PA的流行情況進(jìn)行調(diào)查，為預(yù)防和控制該病原菌提供理論依據(jù)；其次，對(duì)分離到的PA進(jìn)行抗菌藥物敏感性分析及耐藥基因的檢測(cè)，為種禽場(chǎng)的合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

LB瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸桿菌ATCC25922均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。NAC瓊脂培養(yǎng)基、NAC液體培養(yǎng)基、無(wú)菌均質(zhì)袋等均為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。rTaqPCR Premix為上海翌圣生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片為OXOID公司產(chǎn)品。SQ Tissue組織DNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2 樣品采集

2018年3月—2019年1月，從廣東省5個(gè)不同規(guī)?；N禽場(chǎng)收集孵化廳內(nèi)21日齡仍未出殼且外殼完好的種蛋孵化死胚共655份，以及孵化機(jī)灰塵、污垢等環(huán)境樣本共24份，總計(jì)樣本679份。環(huán)境樣本用滅菌棉拭子采集并放入裝有適量的滅菌NAC液體培養(yǎng)基的15 mL離心管中，從樣品采集到運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室不超過(guò)8 h。

1.3 PA的分離與鑒定

用75%酒精將死胚外殼充分消毒3次，無(wú)菌操作取出胚體并剪碎，尤其使胸腔、腹腔和卵黃囊充分暴露，隨后將整個(gè)胚體放入無(wú)菌均質(zhì)袋。接著加入適量的無(wú)菌NAC液體培養(yǎng)基到裝有樣品的無(wú)菌均質(zhì)袋中，37 ℃、120 r·min-1條件下選擇性增菌8 h， 增菌后移取1 mL增菌液轉(zhuǎn)種于10 mL新的無(wú)菌NAC液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、120 r·min-1進(jìn)行二次選擇增菌12～16 h。接著用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種于NAC瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取疑似PA的綠色單菌落，參考文獻(xiàn)[11-12]進(jìn)行菌種16S rRNA基因和特異性基因oprI的PCR鑒定，并送至廣州擎科生物有限公司測(cè)序，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PA的16S rRNA和oprI基因的PCR引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.4 藥物敏感性試驗(yàn)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織 (World health organziatio, WHO)推薦的 K-B 紙片擴(kuò)散法和美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的操作規(guī)程，以銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸桿菌ATCC25922為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株，嚴(yán)格參照CLSI2019標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定，測(cè)定所有PA分離株對(duì)22種抗菌藥物的敏感性?？咕幬铮喊逼S西林(ampicillin，AMP)、復(fù)方新諾明(complex sulfamethoxazole，SXT)、萘啶酸(naphthyridic acid，NA)、卡那霉素(kanamycin，K)、四環(huán)素(tetracycline，TE)、氯霉素(chloramphenicol，C)、哌拉西林(piperacillin，PRL)、頭孢噻肟(cefotaxime，CTX)、頭孢吡肟(cefepime，F(xiàn)EP)、頭孢他啶(ceftazidime，CAZ)、頭孢哌酮(cefoperazone，CFP)、亞胺培南(imipenem，IPM)美羅培南(meropenem，MEM)、氨曲南(aztreonam，ATM)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam，TZP)、頭孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam，SCF)、妥布霉素(tobramycin，TOB)、阿米卡星(amikacin，AK)、慶大霉素(gentamicin，CN)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、左氧氟沙星(levofloxacin，LEV)和多黏菌素B(polymyxin B，PB)。

1.5 耐藥基因檢測(cè)

參照SQ Tissue組織DNA提取試劑盒(OMEGA)說(shuō)明書(shū)提取PA總DNA。參考文獻(xiàn)[13-14]中的PCR引物及反應(yīng)體系和條件對(duì)相應(yīng)28個(gè)耐藥基因(TEM、SHV、CTX、VEB、VIM、IMP、SPM、GIM、oprD2、NDM、DHA、OXA-10、OXA-23、qnrA、qnrD、qnrS、aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6′)-Ib、aac(6′)-II、ant(3″)-I、tetA、tetB、catB、cmlA、qacE△1-sul1、mcr-1和NDM-1)進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物大于500 bp時(shí)反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸8 min。PCR產(chǎn)物小于500 bp時(shí)反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸8 min，退火溫度可根據(jù)引物合成的Tm值作適當(dāng)調(diào)整。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并拍照保存。

2 結(jié) 果

2.1 PA的分離與鑒定

PA在NAC瓊脂培養(yǎng)基及LB瓊脂培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)出圓形、光滑、濕潤(rùn)的綠色菌落，并帶有特殊芳香氣味，生化分析結(jié)果顯示其均符合PA的生化特性(表2)。對(duì)分離到的疑似PA菌株的16S rRNA及oprI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示其擴(kuò)增出大小約為470和214 bp左右的片段(圖1)，結(jié)合測(cè)序結(jié)果確認(rèn)為PA。本研究分離鑒定出PA共77株(77/679，11.3%)，其中,2株來(lái)源于環(huán)境樣本中的孵化機(jī)污垢(2/24，8.3%)，75株來(lái)源于死胚(75/655，11.5%)(表3)。

表2 PA分離株的生化鑒定

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. PA分離株；2. 陽(yáng)性對(duì)照；3. 陰性對(duì)照M. DNA marker; 1. PA isolates; 2. Positive control; 3. Negative control圖1 PA的16S rRNA和oprI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product for 16S rRNA and oprI gene

2.2 抗菌藥物敏感性

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，除天然耐藥的AMP、K和NA之外，PA對(duì)TE、SXT、C的耐藥性較強(qiáng)，耐藥率分別為100%、100%、75.4%，其次為CTX(11.7%)、CIP(9.1%)、LEV(9.1%)、CN(7.9%)、TOB(7.8%)；另外，PA對(duì)PRL、CFP和AK也表現(xiàn)出了較低的耐藥率；未檢測(cè)到對(duì)FEP、CAZ、IPM、MEM、ATM、TZP、SCF和PB耐藥的PA菌株。除天然耐藥外，耐3類(lèi)或3類(lèi)以上抗菌藥的PA占比為74.1%(57/77)，表現(xiàn)出多重耐藥性，其中，耐3類(lèi)抗菌藥的菌株數(shù)量最多，占62.3%(48/77)；耐4類(lèi)抗菌藥的菌株占比為3.9%(3/77)；耐6類(lèi)抗菌藥的菌株占比為7.8%(6//77)。耐藥譜分析顯示(表4)，所有分離菌株100%表現(xiàn)出耐4種及以上抗菌藥，最廣耐14種抗菌藥，其中6耐菌株最多。

2.3 耐藥基因檢測(cè)

77株P(guān)A的28種耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，18種耐藥基因檢測(cè)陽(yáng)性(表5)，其中磺胺類(lèi)的qacE△1-sul1檢出率最高，對(duì)應(yīng)的耐藥表型是SXT；而碳青霉烯類(lèi)耐藥基因oprD2的檢出率達(dá)到11.7%，對(duì)應(yīng)的耐藥表型主要是IPM；質(zhì)粒介導(dǎo)誘導(dǎo)產(chǎn)生氟喹諾酮類(lèi)耐藥的qnr基因qnrA、qnrD和qnrS的檢出率均為9.1%；氨基糖苷類(lèi)的aac(3)-II和ant(3″)-I耐藥基因檢出率最高；氯霉素類(lèi)耐藥基因檢出率最高為cmlA(2.6%)；四環(huán)素類(lèi)耐藥基因以tetA(3.9%)為主?；前奉?lèi)的耐藥基因qacE△1-sul1陽(yáng)性率為13.73%，而5種常見(jiàn)的MBLs耐藥基因(VIM、IMP、SPM、GIM、NDM)及氨基糖苷類(lèi)的aac(3)-I和mcr-1檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

表3 種雞場(chǎng)中PA分離株的數(shù)量及分離率

表4 PA的耐藥譜及相應(yīng)數(shù)量

表5 PA耐藥基因的檢出率

3 討 論

當(dāng)前，PA是醫(yī)院內(nèi)重要的條件致病菌，常引起免疫力低下或有外傷傷口患者的嚴(yán)重感染，而且是導(dǎo)致重癥病房患者死亡的罪魁禍?zhǔn)譡15-16]。關(guān)于醫(yī)院及其環(huán)境中PA的流行情況有太多的文獻(xiàn)報(bào)道，相比之下，關(guān)于動(dòng)物源PA的流行情況卻較少報(bào)道，缺乏該方面的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。本研究共分離到77株P(guān)A，總體分離率為11.3%，其中,2株來(lái)源于環(huán)境樣本(2/24，8.3%)，75株來(lái)源于死胚(75/655，11.5%)；數(shù)據(jù)表明，不僅在死胚中發(fā)現(xiàn)有不同程度的PA感染，而且種禽場(chǎng)周?chē)h(huán)境中也有一定比例的PA污染。有研究表明，種禽場(chǎng)環(huán)境當(dāng)中的PA是污染種蛋的一個(gè)重要因素，尤其是孵化箱內(nèi)環(huán)境[17-19]。而在G場(chǎng)的死胚和環(huán)境樣本中均分離到了PA，因此作者推斷環(huán)境中的PA可能是導(dǎo)致種蛋感染的重要原因，即胚胎可能被孵化箱內(nèi)的PA污染，并侵入蛋殼，致其死亡；另一方面，即便是在死胚和環(huán)境樣本中均分離到了PA，但也不能將雞胚死亡或孵化率較低的結(jié)果全部歸因于PA的感染，因?yàn)樵趥€(gè)別養(yǎng)殖場(chǎng)的死胚中也分離到了沙門(mén)菌[20]；所以，孵化率受影響是多種因素共同作用的結(jié)果。但在F場(chǎng)中并未分離到PA，說(shuō)明其飼養(yǎng)管理和生物安全措施實(shí)施得較好，推測(cè)這也是該場(chǎng)孵化率稍高于其他養(yǎng)殖場(chǎng)的原因。所以在家禽養(yǎng)殖過(guò)程中，不應(yīng)該繼續(xù)忽視PA的存在，應(yīng)當(dāng)重視起來(lái)，需要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理及生物安全措施，防止PA污染種蛋，避免損失。

本研究選取了常用的22種抗菌藥進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，其中,IPM、PRL、FEP、CAZ等都是醫(yī)院臨床治療PA感染性疾病的一線藥物[21-22]，但部分PA分離株也對(duì)其表現(xiàn)出了耐藥現(xiàn)象，即便其耐藥率較低，但也應(yīng)當(dāng)引起重視，特別是醫(yī)院臨床抗感染的一線藥物亞胺培南。而在所調(diào)查的11個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中，均未使用上述抗菌藥，這也從側(cè)面反映出PA在群體遺傳進(jìn)化過(guò)程中，其耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，推測(cè)與全球范圍內(nèi)醫(yī)院中多重耐藥PA菌株的暴發(fā)流行有關(guān)；反觀AMP、K、NA這3種抗菌藥，在養(yǎng)殖場(chǎng)中的使用率極高，但PA對(duì)其天然耐藥，因此不具備預(yù)防治療意義。而PA對(duì)SXT、TE、C三者的耐藥率也很高，因此養(yǎng)殖場(chǎng)需要更換其他抗菌藥使用。另外，耐藥譜分析顯示,最廣耐14種抗菌藥；其中多重耐藥PA占比高達(dá)為62.3%，這些數(shù)據(jù)表明禽源PA的耐藥情況同樣不容樂(lè)觀，且日漸嚴(yán)重。耐藥基因oprD2對(duì)應(yīng)的耐藥表型是亞胺培南，且醫(yī)院內(nèi)的PA分離株對(duì)IPM表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性[23-24]。而在本研究中，雖然未檢測(cè)到對(duì)IPM耐藥的菌株，但其oprD2基因的陽(yáng)性率高達(dá)11.7%，推斷可能是因?yàn)閛prD2耐藥基因沒(méi)有表達(dá)或表達(dá)量不夠，不足以引起對(duì)應(yīng)的耐藥表型，同時(shí)也提示種禽場(chǎng)PA分離株對(duì)IPM的耐藥性轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)水平較高。雖然本研究中分離到的PA并未被檢測(cè)到MBLs耐藥基因，但仍然不能掉以輕心，畢竟已表現(xiàn)出對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥性轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，并且有必要進(jìn)行動(dòng)物源PA耐藥基因的監(jiān)測(cè)。

PA目前的流行情況(尤其是醫(yī)院內(nèi)的流行情況)已經(jīng)十分嚴(yán)峻，而醫(yī)院中PA的流行在某種程度上對(duì)動(dòng)物源PA的流行造成了一定的威脅，醫(yī)院內(nèi)的PA傳播至ICU病人，病人將PA帶入到家庭環(huán)境，最終導(dǎo)致其寵物感染PA并發(fā)病，這都是有依據(jù)可言的。另一方面，由于PA強(qiáng)大的耐藥性和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，使其本身就具有較強(qiáng)的流行性。在面對(duì)動(dòng)物源PA的逐漸流行時(shí)，應(yīng)該趁早將其扼殺在搖籃里。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)5個(gè)不同種雞場(chǎng)中的種蛋孵化死胚和環(huán)境樣本進(jìn)行銅綠假單胞菌的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)其死胚中均存在不同程度的感染，且個(gè)別種雞場(chǎng)的死胚和環(huán)境樣本中均分離到了該菌。這些PA分離株具有多重耐藥性，提示種雞場(chǎng)一方面應(yīng)做好生物安全措施，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，及時(shí)對(duì)種蛋、孵化機(jī)及其周邊環(huán)境進(jìn)行清潔和消毒；另一方面應(yīng)定期進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果合理選擇并交替使用抗菌藥，如阿米卡星、哌拉西林、頭孢哌酮等可作為銅綠假單胞菌較好的預(yù)防或治療藥物。