可視化RPA-LFD技術(shù)快速檢測(cè)豬鏈球菌

張閃閃，何 斌，李書(shū)光，劉明成，姜金慶，胡建和，雷連成，沈志強(qiáng) *，夏小靜 *

(1. 河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003； 2. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600； 3. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是豬的重要病原體，可導(dǎo)致化膿性腦膜炎、心內(nèi)膜炎、多發(fā)性漿膜炎、敗血癥、中毒性休克樣綜合征(STSLS)和關(guān)節(jié)炎[1]。豬鏈球菌以共生菌株形式在上呼吸道定殖，從而產(chǎn)生病原攜帶豬[2]。此外，豬鏈球菌也可作為機(jī)會(huì)致病菌出現(xiàn)[3]。豬鏈球菌的感染不僅會(huì)造成養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅。在西方國(guó)家，豬鏈球菌被認(rèn)為是一種職業(yè)病，感染通常為單病例散發(fā)，例如養(yǎng)豬戶(hù)、獸醫(yī)、屠宰場(chǎng)工作人員。感染主要通過(guò)皮膚傷口與受污染的豬肉直接接觸而發(fā)生，即使在沒(méi)有明顯傷口的情況下也可被感染[4]。另一方面，在東南亞國(guó)家，主要的感染途徑是胃腸道。在這些國(guó)家，食用未煮熟的豬肉產(chǎn)品現(xiàn)象普遍存在[5]。人類(lèi)感染豬鏈球菌中最常見(jiàn)的癥狀是腦膜炎和敗血性休克[6]。據(jù)報(bào)道豬鏈球菌腦膜炎幸存者常伴有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[7]。兩次大規(guī)模的人類(lèi)豬鏈球菌流行導(dǎo)致患者中毒休克樣綜合征(STSLS)，盡管采取了適當(dāng)?shù)闹委煷胧┑詫?dǎo)致較高的死亡率[8-10]。

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化分析費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且靈敏度低[11]。ELISA技術(shù)是實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)細(xì)菌和病毒的最普遍使用的免疫測(cè)定方法。該方法具有成本低，速度快，靈敏度高，易于使用和可靠性高的優(yōu)點(diǎn)，并且可以在單個(gè)試驗(yàn)中篩查大量樣本。本團(tuán)隊(duì)前期分別以gdh、sao-M為診斷抗原建立了Dot-PPA-ELISA、PPA-ELISA檢測(cè)方法[12-14]，實(shí)現(xiàn)對(duì)豬鏈球菌的快速診斷，彌補(bǔ)了分離培養(yǎng)和生化分析的不足，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。基于膠體金的免疫層析試紙法和免疫傳感器技術(shù)也被用于檢測(cè)豬鏈球菌感染[11, 15]。這些方法均可用于豬鏈球菌的快速、靈敏檢測(cè)，但是，大多數(shù)方法需要專(zhuān)業(yè)的操作技術(shù)人員，有賴(lài)于特殊儀器，限制了其推廣應(yīng)用[11, 15]。目前，基于PCR的分子生物學(xué)技術(shù)是最常用于豬鏈球菌檢測(cè)的技術(shù)。單個(gè)或多重PCR、熒光定量PCR等方法對(duì)豬鏈球菌保守基因或不同血清型特異的莢膜多糖基因進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序[16-17]，在基因水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)豬鏈球菌的快速檢測(cè)。此外，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)也成功應(yīng)用于檢測(cè)豬鏈球菌[18]。然而LAMP技術(shù)存在引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、需要多對(duì)引物、產(chǎn)物間易相互作用造成非特異擴(kuò)增、無(wú)法通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果的正確性等問(wèn)題[19]。因此，臨床仍然需要一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)SS感染的快速診斷。

重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(recombinase ploymerase amplication, RPA)是一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在37～42 ℃條件下，模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段有效等溫?cái)U(kuò)增，20 min即可完成反應(yīng)，且操作簡(jiǎn)便，同時(shí)還具有特異性好和靈敏度高的特點(diǎn)[20]。RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條(lateral flow dipstick，LFD)相結(jié)合形成RPA-LFD檢測(cè)體系，不需要電泳儀、熒光值監(jiān)測(cè)設(shè)備，可在5～10 min實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的快速可視化檢測(cè)[21]，適用于臨床及野外檢測(cè)。目前，國(guó)際上尚無(wú)基于RPA-LFD技術(shù)檢測(cè)豬鏈球菌的報(bào)道。

谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)是碳氮代謝的連接橋梁，在細(xì)菌能量代謝過(guò)程中具有重要作用，直接影響細(xì)菌的致病性[22]。豬鏈球菌GDH蛋白表達(dá)于菌體細(xì)胞壁，是進(jìn)化上極其保守的種特異性抗原成分，可作為豬鏈球菌的診斷性抗原，建立針對(duì)豬鏈球菌所有血清型的通用檢測(cè)方法[12, 23]。本研究以gdh為檢測(cè)靶標(biāo)，將RPA與LFD結(jié)合，開(kāi)發(fā)了RPA-LFD封閉式檢測(cè)體系。此外，作者通過(guò)與PCR方法的比較及其在快速篩選臨床樣本中的應(yīng)用，評(píng)估了該方法的特異性和敏感性，力求建立一種速度快，特異性好和靈敏度高的豬鏈球菌通用檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

1型菌株JZLQ036，2型菌株CVCC606、CVCC1941、JZLQ022、ZY05719、05ZYH33、JZLQ019，7型菌株JZLQ034，9型菌株JZLQ035由濱州畜牧獸醫(yī)研究院沈志強(qiáng)研究員和吉林大學(xué)雷連成教授惠贈(zèng)。腸致病性大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌，由河南科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存；豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(L20)、沙門(mén)菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC49525)、嗜水氣單胞菌(AH-1)和pMD-18T-gdh質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存[24]。

1.2 試驗(yàn)試劑

TwistAmp?Basic、TwistAmp?nfo 試劑盒購(gòu)自TwistDX公司；側(cè)流層析試紙條及檢測(cè)裝置購(gòu)自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司；PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。細(xì)菌 DNA 提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌DNA提取 利用Ezup柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的豬鏈球菌、腸致病性大腸桿菌、沙門(mén)菌、副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌、巴氏桿菌、嗜水氣單胞菌的基因組DNA；保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物與探針的設(shè)計(jì)與合成 從GenBank下載豬鏈球菌gdh基因序序列，并在DNAStar軟件(DNASTAR，麥迪遜，威斯康星州，美國(guó))上進(jìn)行了比對(duì)分析。根據(jù)《TwistAmp DNA擴(kuò)增試劑盒分析設(shè)計(jì)手冊(cè)》，使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物8對(duì)(表1)。為結(jié)合側(cè)流層析試紙條的可視化檢測(cè)，反向引物5′端用生物素標(biāo)記。根據(jù)TwistAmp Basic試劑盒(英國(guó)TwistDX)的說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)兩個(gè)TwistAmp?nfo探針。探針的5′端用羧基熒光素(FAM)標(biāo)記，而3′端用C3-Spacer修飾。然后，將THF(四氫呋喃)位點(diǎn)置于距探針5′端30 bp處，并替換1個(gè)核苷酸。THF殘基后3′端至少添加15個(gè)核苷酸。引物與探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.3 普通PCR檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[25-26]進(jìn)行。

1.3.4 Basic-RPA反應(yīng)體系的建立和反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)TwistAmp?Basic試劑盒(英國(guó)，TwistDX)的說(shuō)明書(shū)建立50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行RPA反應(yīng)。組分包括29.5 μL反應(yīng)緩沖液、正向和反向引物各2.4 μL，2.2 μL模板(DNA)和11 μL無(wú)核酸酶水。輕輕混勻以上混容物，并將其加入到冷凍干燥的RPA反應(yīng)管中。反應(yīng)管中含有經(jīng)真空冷凍干燥處理的固體反應(yīng)物，用移液器吸打混勻，使凍干狀態(tài)的固體反應(yīng)物復(fù)水。之后，加入2.5 μL 280 mmol·L-1MgAc，并使用熱循環(huán)儀在39 ℃下孵育20 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。為了提高靈敏度，作者對(duì)Basic-RPA反應(yīng)的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，包括各種反應(yīng)溫度(30、35、37、39、45 ℃)和時(shí)間(5、10、15、20、25、30、35和40 min)。篩選的反應(yīng)溫度和時(shí)間用于后續(xù)nfo-RPA反應(yīng)。nfo-RPA反應(yīng)體系：29.5 μL反應(yīng)緩沖液、正向和反向引物各2.1 μL，0.6 μL探針(10 μmol·L-1)，2.2 μL模板(DNA)和11 μL無(wú)核酸酶水。其他操作同Basic-RPA。

1.3.5 RPA-LFD檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物 nfo-RPA反應(yīng)體系：29.5 μL反應(yīng)緩沖液、正向和反向引物各2.1 μL，0.6 μL探針(10 μmol·L-1)，2.2 μL模板(DNA)和11 μL無(wú)核酸酶水。反應(yīng)操作同Basic-RPA。反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)需純化，按照TwistAmp?nfo試劑盒(TwistDx，英國(guó))提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行LFD結(jié)果分析。取出10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用190 μL經(jīng)過(guò)濾的去離子水稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)移液器適當(dāng)混合后，使用一次性核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物。最后，可直接用肉眼觀察可視化結(jié)果。即當(dāng)樣品線(xiàn)和對(duì)照線(xiàn)均可見(jiàn)時(shí)，該反應(yīng)被認(rèn)為是陽(yáng)性的；如果只有控制線(xiàn)可見(jiàn)，則測(cè)試被解釋為陰性；未見(jiàn)控制線(xiàn)則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

1.3.6 特異性試驗(yàn) 為了分析建立的RPA-LFD方法的特異性，選擇腸致病性大腸桿菌、沙門(mén)菌、副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌、巴氏桿菌、嗜水氣單胞菌用合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)，按“1.3.1”方法提取細(xì)菌DNA作為模板，利用最佳反應(yīng)條件進(jìn)行 RPA 檢測(cè)，評(píng)價(jià)上述建立的RPA-LFD方法的特異性。用豬鏈球菌作為陽(yáng)性對(duì)照，回收RPA產(chǎn)物分別克隆到T-vector pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后各挑取3個(gè)單菌落，用通用引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，將PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行送往上海生工測(cè)序,并分析測(cè)序結(jié)果。

表1 豬鏈球菌通用RPA擴(kuò)增引物及探針序列

1.3.7 靈敏性試驗(yàn) 將本室保存的pMD-18T-gdh陽(yáng)性質(zhì)粒按10倍倍比稀釋至7個(gè)濃度(1.0 × 107～1.0 × 100拷貝·μL-1)，作為模板以最佳反應(yīng)條件使用開(kāi)發(fā)的Basic-RPA和RPA-LFD進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法的最小檢出量。同時(shí)采用前述PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，比較3種檢測(cè)方法的敏感性。

1.4 臨床應(yīng)用試驗(yàn)

本研究首先應(yīng)用所建立的豬鏈球菌RPA-LFD檢測(cè)方法檢測(cè)1型菌株JZLQ036，2型菌株CVCC606、CVCC1941、JZLQ022、ZY05719、05ZYH33、JZLQ019，7型菌株JZLQ034，9型菌株JZLQ035基因組DNA初步評(píng)價(jià)其實(shí)用性。為進(jìn)一步確證RPA-LFD在臨床應(yīng)用中的使用效果，選擇河南省不同規(guī)?；i場(chǎng)45頭臨床癥狀疑似豬鏈球菌感染的病豬，采集扁桃體組織總DNA，以pMD-18T-gdh重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以ddH2O為空白對(duì)照，以健康豬的扁桃體組織總DNA為陰性對(duì)照，按照最佳反應(yīng)條件進(jìn)行RPA-LFD檢測(cè)；同時(shí)對(duì)上述樣品進(jìn)行傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、常規(guī)多重PCR檢測(cè)[26]，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 RPA引物和探針選擇

豬鏈球菌gdh基因因其高度保守的特性被本研究選為建立豬鏈球菌通用型檢測(cè)方法的靶標(biāo)。用核酸蛋白分析儀測(cè)定本室保存的重組pMD-18T-gdh陽(yáng)性質(zhì)粒濃度，經(jīng)公式計(jì)算得出重組質(zhì)?？截悢?shù)為1.84×1010拷貝·μL-1。根據(jù)RPA引物設(shè)計(jì)原則，針對(duì)gdh基因設(shè)計(jì)了8對(duì)通用引物(表1)，并分別以pMD-18T-gdh陽(yáng)性質(zhì)粒為模板在沒(méi)有探針的情況下進(jìn)行擴(kuò)增，隨后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行評(píng)估。利用引物GDH1166F/GDH1346R和GDH874F/GDH812R對(duì)gdh進(jìn)行RPA 擴(kuò)增，可出現(xiàn)清晰條帶，而其他引物擴(kuò)增無(wú)條帶、拖帶、或者特異性不好，由此確定引物GDH1166F/GDH1346R和GDH874F/GDH812R特異性較好(圖1，部分?jǐn)?shù)據(jù)未顯示)。后續(xù)試驗(yàn)證實(shí)GDH874F/GDH812R及其探針存在非特異性擴(kuò)增，故本試驗(yàn)僅使用引物GDH1166F/GDH1346R及其探針。

2.2 RPA檢測(cè)體系的建立與優(yōu)化

為了確定最佳測(cè)定條件，使用Basic-RPA方法對(duì)RPA兩個(gè)主要參數(shù)(時(shí)間和溫度)進(jìn)行優(yōu)化。首先將相同RPA反應(yīng)體系在不同溫度(25～45 ℃范圍內(nèi))下孵育30 min以確定最佳擴(kuò)增溫度。如圖2A所示，在30～45 ℃條件下，擴(kuò)增子均具有預(yù)期的大小(圖2A)。當(dāng)RPA反應(yīng)體系在39 ℃孵育時(shí)，可以看到清晰的擴(kuò)增條帶，這表明它是理想的擴(kuò)增溫度。30、35和37 ℃反應(yīng)30 min后,分別顯示出預(yù)期的RPA擴(kuò)增條帶較弱。45 ℃反應(yīng)30 min后擴(kuò)增條帶亮度較39 ℃開(kāi)始減弱。最終確定本方法的最佳反應(yīng)溫度為39 ℃。

在上述最佳反應(yīng)溫度下，篩選了不同的反應(yīng)時(shí)間(5、10、15、20、25、30、35和40 min)。 結(jié)果顯示，在39 ℃溫度下，反應(yīng)進(jìn)行10 min 時(shí)已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)目的條帶，反應(yīng)15 min時(shí)能夠較為清晰地看到特異性擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明，RPA反應(yīng)在不低于10 min時(shí)，即可得到清晰的特異性擴(kuò)增條帶，但在10、15 min時(shí)檢測(cè)到的擴(kuò)增目的條帶熒光強(qiáng)度較低，本研究選擇20 min為最佳擴(kuò)增時(shí)間(圖2B)。

M. 500 bp DNA ladder; 1. 引物GDH1166F/GDH1346R; 2. 引物GDH874F/GDH1002R; 3. 引物GDH556F/GDH706R; 4. 引物GDH162F/GDH240R; N. 陰性對(duì)照M. 500 bp DNA ladder; 1. Primer GDH1166F/GDH1346R; 2. Primer GDH874F/GDH1002R; 3. Primer GDH556F/GDH706R; 4. Primer GDH162F/GDH240R; N. Negative control圖1 不同引物的RPA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of different primers detected by RPA

A. Basic-RPA反應(yīng)溫度優(yōu)化；B. Basic-RPA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化；M. 500 bp DNA ladder; 1～6. 反應(yīng)溫度分別為25、30、35、37、39、45 ℃；7～14. 反應(yīng)時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30、35、40 minA. Basic-RPA reaction temperature optimization; B. Basic-RPA reaction time optimization; M. 500 bp DNA ladder; 1-6. The reaction temperature are 25, 30, 35, 37, 39, 45 ℃, respectively; 7-14. Reaction time are 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 min, respectively圖2 RPA反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Optimization of reaction temperature and time for RPA

2.3 RPA檢測(cè)方法的特異性

利用優(yōu)化后的RPA反應(yīng)體系及條件分別對(duì)豬鏈球菌、腸致病性大腸桿菌、沙門(mén)菌、副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌、巴氏桿菌、嗜水氣單胞菌8種常見(jiàn)致病菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示Basic-RPA和RPA-LFD僅對(duì)豬鏈球菌擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，其他7種常見(jiàn)致病菌并未擴(kuò)增出條帶(圖3)。為了進(jìn)一步明確獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物是特異的豬鏈球菌序列，將擴(kuò)增獲得的約121 bp的RPA產(chǎn)物分別克隆至pMD-19T載體，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明以上2個(gè)豬鏈球菌陽(yáng)性樣品為模板的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物均是特異的豬鏈球菌gdh基因序列，與NCBI上豬鏈球菌gdh基因序列的相似性為100%(數(shù)據(jù)未給出)。以上結(jié)果表明本研究建立的豬鏈球菌 RPA-LFD檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性。

A. Basic-RPA；B. RPA-LFD. M. 1 000 bp DNA ladder；1. 陽(yáng)性對(duì)照；2～8.腸致病性大腸桿菌、沙門(mén)菌、副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌、巴氏桿菌、嗜水氣單胞菌基因組檢測(cè)結(jié)果；N. 陰性對(duì)照A. Basic-RPA; B. RPA-LFD; M. 1 000 bp DNA ladder; 1. Positive control; 2-8. Detection results of enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella, Haemophilus parasuis, Staphylococcus aureus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella, Aeromonas hydrophila, respectively; N. Negative control圖3 豬鏈球菌RPA檢測(cè)方法特異性評(píng)價(jià)Fig.3 Specificity evaluation of RPA-LFD detection method for Streptococcus suis

2.4 RPA檢測(cè)法的靈敏性

為確定RPA檢測(cè)方法的靈敏性，將構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-18T-gdh按照10倍的比例依次稀釋為1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 × 103、1 × 102、1 × 101、1 × 100拷貝·μL-1。這8個(gè)濃度梯度在最佳反應(yīng)條件下擴(kuò)增后與PCR方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如圖4所示，RPA具有比PCR更高的靈敏度，其最低檢測(cè)限為100拷貝·μL-1。

A. PCR; B. RPA-LFD；M. 1 000 bp DNA ladder；1～8. 模板DNA濃度分別為1 × 107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷貝·μL-1；N. 陰性對(duì)照A. PCR; B. RPA-LFD; M. 1 000 bp DNA ladder; 1-8. Template DNA concentrations are 1×107, 1×106, 1×105, 1×104, 1×103, 1×102, 1×101, 1×100 copies·μL-1; N. Negative control圖4 豬鏈球菌RPA-LFD檢測(cè)方法靈敏度評(píng)價(jià)Fig.4 Sensitivity evaluation of RPA-LFD detection method for Streptococcus suis

2.5 RPA檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用

采用建立的LFD-RPA方法檢測(cè)1型菌株JZLQ036，2型菌株CVCC606、CVCC1941、JZLQ022、ZY05719、05ZYH33、JZLQ019，7型菌株JZLQ034，9型菌株JZLQ035，均可出現(xiàn)清晰的檢測(cè)線(xiàn)(圖5，其中JZLQ019結(jié)果未展示)。對(duì)45份疑似SS感染的臨床樣品，采用常規(guī)分離培養(yǎng)共檢出陽(yáng)性樣品10份，多重PCR檢測(cè)方法共檢測(cè)出陽(yáng)性樣品18份，其中，2型菌株7株，7型菌株3株，9型菌株2株，分別占總樣本數(shù)的15.5%、6.7%和4.4%(表2)。LFD-RPA共檢出陽(yáng)性樣品19份，與多重PCR方法比較具有更高的檢出率(表2)。

1. 1型菌株JZLQ036; 2～6. 2型菌株CVCC606、CVCC1941、JZLQ022、ZY05719、05ZYH33; 7. 7型菌株JZLQ034; 8. 9型菌株JZLQ035；9. 陰性對(duì)照1. Type 1 strain JZLQ036; 2-6. Type 2 strain CVCC606, CVCC1941, JZLQ022, ZY05719, 05ZYH33; 7. Type 7 strain JZLQ034; 8. Type 9 strain JZLQ035; 9. Negative control圖5 PRA-LFD方法檢1、2、7和9型菌株基因組DNA的可行性評(píng)價(jià)Fig.5 Evaluation of the feasibility of PRA-LFD method for detecting genomic DNA of type 1, 2, 7 and 9 strains

表2 不同方法在臨床樣本檢測(cè)中的應(yīng)用

3 討 論

豬鏈球菌是引起豬多種疾病的重要病原，不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅[27]。本研究選擇高度保守的gdh基因作為診斷靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)了一種具有靈敏度高，特異性強(qiáng)和檢測(cè)普廣的RPA-LFD檢測(cè)方法，可方便快捷地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)診斷。

在分子生物學(xué)檢測(cè)方法中，準(zhǔn)確地選擇靶基因至關(guān)重要，其可直接影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。豬鏈球菌菌株在各血清型內(nèi)和血清型間表現(xiàn)出廣泛的遺傳異質(zhì)性[23]，增加了建立診斷方法的難度。gdh序列具有良好的保守性和較低的點(diǎn)突變率，已成功用于艱難梭菌的檢測(cè)[22]。此外，豬鏈球菌的gdh基因在所有莢膜血清型中都高度保守，可用作診斷抗原[25]。作者前期研究選取gdh作診斷抗原，開(kāi)發(fā)了PPA-ELISA和Dot-PPA-ELISA診斷方法應(yīng)用于豬鏈球菌感染的大規(guī)模和現(xiàn)場(chǎng)診斷[12, 14]?；趃dh的PCR技術(shù)也已被用于檢測(cè)豬鏈球菌[23, 28]?；谶@些觀察，本研究選擇gdh為靶標(biāo)建立豬鏈球菌RPA-LFD快速檢測(cè)方法。

相較于PCR，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)提供了簡(jiǎn)化的核酸人工復(fù)制條件，僅需要恒定的溫度而不需要熱循環(huán)。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不僅通過(guò)消除重復(fù)的加熱和冷卻步驟減少擴(kuò)增的時(shí)間，還可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)分子反應(yīng)異步進(jìn)行，大大提高了核酸擴(kuò)增效率[29]。RPA是由Armes團(tuán)隊(duì)于2006年首次提出的一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在37～42 ℃條件下模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段有效等溫?cái)U(kuò)增，20 min即可完成反應(yīng)，且操作簡(jiǎn)便，同時(shí)還具有特異性好和靈敏度高的特點(diǎn)[20，30]?；趥?cè)流層析的結(jié)果展示可在預(yù)制的試紙條上完成，且無(wú)需任何額外設(shè)備，可在5～10 min觀測(cè)結(jié)果[21]。另一方面，通過(guò)封閉式LFD檢測(cè)裝置判讀結(jié)果可有效避免核酸產(chǎn)物外泄造成的假陽(yáng)性污染。這些特點(diǎn)使PA-LFD可視化檢測(cè)體系，在基層衛(wèi)生部門(mén)及野外環(huán)境中，都有極大的應(yīng)用潛力[31]。

PCR的加熱過(guò)程可避免引物間結(jié)合引發(fā)的非特異擴(kuò)增，RPA恒溫反應(yīng)條件的核酸擴(kuò)增較易出現(xiàn)引物二聚體，不僅影響反應(yīng)的擴(kuò)增效率，而且產(chǎn)生的非特定信號(hào)可能影響試驗(yàn)結(jié)果。因此，在設(shè)計(jì)RPA反應(yīng)的引物時(shí)，應(yīng)竭力避免引物二聚體的產(chǎn)生。此外，對(duì)于RPA-nfo反應(yīng)而言，探針的設(shè)計(jì)也要避免擴(kuò)增過(guò)程中形成的非特異信號(hào)影響后續(xù)側(cè)流層析的結(jié)果[32]。本研究以豬鏈球菌gdh基因?yàn)榘行蛄泄苍O(shè)計(jì)8對(duì)RPA引物，首先利用TwistAmp-Basic試劑盒對(duì)引物進(jìn)行篩選，最終選擇特異性好、擴(kuò)增效率高的GDH1166F/GDH1346R引物對(duì)及其探針。

篩選RPA最佳反應(yīng)溫度發(fā)現(xiàn)在30～45 ℃反應(yīng)均可出現(xiàn)預(yù)期的RPA擴(kuò)增條帶，提示RPA的反應(yīng)條件要求比較寬松，體溫或加熱水浴鍋即可完成反應(yīng)。這對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件惡劣或經(jīng)濟(jì)條件較差地區(qū)的應(yīng)用和推廣極為有利。探索RPA最佳反應(yīng)時(shí)間的結(jié)果顯示，當(dāng)RPA反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)目的條帶，快于常規(guī)PCR方法所需的檢測(cè)時(shí)間，本方法更加有利于實(shí)現(xiàn)快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)或野外檢測(cè)。

檢測(cè)技術(shù)的可信度取決于特異性。本研究建立的豬鏈球菌RPA-LFD檢測(cè)結(jié)果顯示，該檢測(cè)方法與其他7種常見(jiàn)的病原微生物不發(fā)生交叉反應(yīng)，表明該方法特異性良好。靈敏度的高低直接影響臨床樣本的檢出率。本研究建立的RPA-LFD靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，模板標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA 100拷貝·μL-1時(shí)可出現(xiàn)清晰的檢測(cè)線(xiàn)，該檢測(cè)靈敏度約是常規(guī)PCR的10倍，說(shuō)明RPA-LFD的檢測(cè)方法具有更高的靈敏度。對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，RPA-LFD檢出率高于多重PCR，表明本研究建立的RPA-LFD檢測(cè)方法優(yōu)于常規(guī)PCR。

4 結(jié) 論

本研究建立了針對(duì)豬鏈球菌的廣譜RPA-LFD檢測(cè)方法，有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)快速、可肉眼直接觀察結(jié)果、無(wú)需大型精密儀器等優(yōu)勢(shì)，十分適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)或野外檢測(cè)的需求，具有廣闊的應(yīng)用前景。